桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BCoV纖突蛋白及其對(duì)小鼠的免疫原性

喻琦勝,朱 慶,周 群,宋 鑫,張家祺,陳濤云,徐 林,張朝輝*,張 斌*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,成都 610041;2.四川省甘孜藏族自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,康定 626000)

牛冠狀病毒病是由牛冠狀病毒(bovine coronavirus,BCoV)引起的導(dǎo)致牛呼吸道和腸道感染的病毒性疾病[1],被廣泛認(rèn)為是引起初生犢牛腹瀉的重要病原之一。目前國內(nèi)BCoV廣泛流行,嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展[2-4]。有研究證實(shí)BCoV能感染多種宿主[5-6],說明BCoV在跨物種傳播領(lǐng)域具有重要意義,其生物安全影響不容忽視。

BCoV是單股正鏈RNA病毒,屬于套式病毒目、冠狀病毒科、β冠狀病毒屬[7]。其病毒粒子呈球形或多邊形,編碼五種主要結(jié)構(gòu)蛋白,即纖突蛋白(S蛋白)、核衣殼蛋白(N蛋白)、囊膜糖蛋白(M蛋白)、血凝脂酶糖蛋白(HE蛋白)和小膜蛋白(E蛋白)[8]。其中S結(jié)構(gòu)蛋白含有主要抗原位點(diǎn),包含S1、S2兩個(gè)亞基,能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,進(jìn)而誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生[9-10]。目前已有多種冠狀病毒的疫苗是基于S蛋白進(jìn)行開發(fā)的[11-13]。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(baculovirus expression system,BES)是以桿狀病毒為外源基因表達(dá)載體,以昆蟲細(xì)胞為受體的真核表達(dá)系統(tǒng)。其優(yōu)點(diǎn)是桿狀病毒對(duì)外源基因的容納能力較強(qiáng),只感染節(jié)肢動(dòng)物[14],在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中較為安全;昆蟲細(xì)胞能夠?qū)ν庠吹鞍走M(jìn)行加工修飾,使外源蛋白能夠正確折疊,保持空間構(gòu)象及蛋白活性[15-16]。BES已被廣泛用于表達(dá)重組蛋白[15],已有多種商業(yè)化的基因工程亞單位疫苗使用該系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白,如由GSK公司研發(fā)的人乳頭瘤病毒二價(jià)疫苗,四川大學(xué)華西醫(yī)院研發(fā)的重組新冠病毒疫苗,武漢科前生物股份有限公司生產(chǎn)的豬瘟病毒E2蛋白重組桿狀病毒滅活疫苗(WH-09株)[17-18]。

目前,有關(guān)BCoV S蛋白表達(dá)的報(bào)道均屬于原核表達(dá),缺乏翻譯后修飾、蛋白產(chǎn)量較低,而且未表達(dá)完整S蛋白[19-20]。因此,本研究構(gòu)建了攜帶BCoV S基因的重組桿狀病毒,通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得重組S蛋白,免疫BALB/c小鼠,對(duì)其免疫原性進(jìn)行評(píng)價(jià),為今后BCoV亞單位疫苗的研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5α、DH10Bac)、Sf9細(xì)胞、pFastBac-Dual質(zhì)粒由西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA生物公司,BacPAKTM桿狀病毒滴度快速測定試劑盒購自TaKaRa生物公司,超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物購自四正柏生物公司,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG均購自北京博奧森生物有限公司,異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自博士德生物工程有限公司,RIPA裂解液購自Thermo Fisher Scientific公司,蛋白酶抑制劑混合物(通用型)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,NE41動(dòng)物免疫佐劑(MF59佐劑)、CpG免疫增強(qiáng)劑均購自北京利昂盛生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～6周齡雌性BALB/c小鼠,購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 選擇BCoV/SWUN/HXD-4/2021株(GenBank:OL456213.1)的S結(jié)構(gòu)蛋白作為模板,由生工生物工程(上海)股份有限公司針對(duì)Sf9細(xì)胞進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成,連接至pFastBac-Dual載體上,得到pFastBac-Dual-S重組質(zhì)粒。

1.2.2 收獲重組桿粒 將上述構(gòu)建成功的pFastBac-Dual-S重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中,涂布到含有慶大霉素、卡那霉素、氯霉素的LB瓊脂平板上。在37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h后,可觀察到藍(lán)色和白色的圓形菌落,挑取白色圓形單個(gè)菌落利用菌落PCR篩選出陽性克隆,并通過三線法進(jìn)一步劃線純化以去除假陽性。將篩選出的陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng),提取重組桿粒命名為Bacmid-S,測定濃度后保存于-20 ℃。

1.2.3 重組桿狀病毒的拯救 將長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶的Sf9細(xì)胞傳代到六孔板中,根據(jù)CellfectinTMII Reagent轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,27 ℃靜置培養(yǎng)96 h后,反復(fù)凍融3次,收獲病毒液,將其作為第一代病毒(P1),命名為rpFastBac-S。盲傳代到P4后,收集病毒液,分裝保存于-80 ℃。

1.2.4 重組桿狀病毒的鑒定

1.2.4.1 基因組PCR:取P4病毒液提取基因組DNA。將rpFastBac-S的DNA作為模板,進(jìn)行基因組PCR鑒定。

1.2.4.2 間接免疫熒光試驗(yàn):將長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶的Sf9細(xì)胞進(jìn)行傳代,用Sf9專用培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整到4×105cells·mL-1,進(jìn)行六孔板鋪板,每孔2 mL,8～10 h后按細(xì)胞培養(yǎng)液3%的比例接入rpFastBac-S。27 ℃靜置培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液,用80%丙酮固定10 min,PBS洗滌3次;5%脫脂奶封閉2 h,PBS洗滌3次;以Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗體為一抗,37 ℃孵育2 h,PBS洗滌3次;以FITC標(biāo)記的Goat Anti-rabbit IgG作為二抗,37 ℃孵育1 h,PBS洗滌3次;滴入DAPI染色液,室溫孵育10 min,使用吸水紙吸取凈殘留液體后,進(jìn)行熒光顯微鏡成像。

1.2.4.3 Western blot分析:通過Western blot分析S蛋白在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)情況。樣品制備方法同“1.2.4.2”,27 ℃靜置培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液,用PBS重懸細(xì)胞,12 000 r·min-1離心5 min,棄去上清;加入200 μL RIPA裂解液裂解細(xì)胞,同時(shí)加入2 μL通用型蛋白酶抑制劑,冰浴15 min后再次離心,取上清,加入SDS-PAGE上樣緩沖液,95 ℃加熱5 min,完成樣本制備。以5%脫脂奶為封閉液,37 ℃水平搖晃孵育2 h,TBST洗滌3次;以Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗體為一抗,4 ℃水平搖晃孵育過夜,TBST洗滌3次;以HRP標(biāo)記的Goat Anti-rabbit IgG作為二抗,37 ℃水平搖晃孵育2 h,TBST洗滌3次;使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物顯影,觀察目的條帶。

1.2.5 重組桿狀病毒滴度的測定 按照BacPAKTM桿狀病毒滴度快速測定試劑盒說明書,測定P4重組桿狀病毒rpFastBac-S的滴度。

1.2.6 優(yōu)化不同感染劑量對(duì)蛋白表達(dá)的影響 將rpFastBac-S分別以MOI=0.005、MOI=0.05、MOI=0.5、MOI=1、MOI=2感染Sf9細(xì)胞,3 d后,棄去上清,收集細(xì)胞,Western blot檢測蛋白表達(dá)情況。

1.2.7 收獲S蛋白及制備免疫原 將rpFastBac-S按照最佳感染復(fù)數(shù)感染Sf9細(xì)胞,3 d后收獲細(xì)胞培養(yǎng)液,3 000 r·min-1離心20 min以去除細(xì)胞碎片,收集上清進(jìn)行超速離心純化,離心條件為“4 ℃、30 000 r·min-1、2 h”,離心后用PBS重懸沉淀。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,分裝儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 rpFastBac-BCoV-S蛋白在小鼠中的免疫原性評(píng)價(jià)

1.2.8.1 rpFastBac-BCoV-S免疫小鼠的方案設(shè)計(jì):4～6周齡雌性BALB/c小鼠24只,隨機(jī)分為3組,分別為S蛋白組、滅活病毒組、佐劑對(duì)照組,每組8只。均采用肌肉注射,S蛋白組每只每次免疫50 μg蛋白,滅活病毒組每只每次免疫200 μL滅活病毒液(劑量為2×104.67TCID50),佐劑對(duì)照組每只每次免疫50 μL MF59佐劑,其中S蛋白組與滅活病毒組均混合了等體積的MF59佐劑與20 μg CpG免疫增強(qiáng)劑。首免后14 d進(jìn)行二免,并在免疫前、首免7 d、首免14 d、二免7 d、二免14 d進(jìn)行采血,收集血清備用。

1.2.8.2 間接ELISA試驗(yàn)檢測小鼠血清特異性抗體水平:根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的基于BCoV S2重組蛋白的間接ELISA抗體檢測方法,對(duì)收集到的血清樣本進(jìn)行特異性抗體水平檢測。將原核表達(dá)獲得的BCoV S2蛋白用50 mmol·L-1Tris-HCl溶液稀釋為0.1 μg·mL-1,每孔100 μL,37 ℃包被1 h后棄液,PBST洗滌三次;每孔加入100 μL 5%脫脂奶,37 ℃封閉1 h后棄液,PBST洗滌三次;以收集到的小鼠血清作為一抗,用2%冷水魚皮明膠進(jìn)行梯度稀釋后,每孔100 μL,37 ℃孵育1 h后棄液,PBST洗滌三次;將HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG用2%冷水魚皮明膠按照1∶10 000稀釋,每孔100 μL,37 ℃孵育1 h后棄液,PBST洗滌三次;加入TMB顯色液,每孔100 μL,37 ℃避光孵育10 min后,加入終止液終止反應(yīng),使用酶標(biāo)儀讀取OD450 nm值。

1.2.8.3 微量中和試驗(yàn)檢測小鼠血清中和抗體水平:將長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶的HCT-8細(xì)胞傳代至96孔板,37 ℃靜置培養(yǎng)8～10 h;將小鼠血清56 ℃滅活30 min,用不含血清與雙抗的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行2倍倍比稀釋,與200 TCID50的BCoV混合,37 ℃培養(yǎng)箱感作1 h;取出含有HCT-8細(xì)胞的96孔板,棄液,PBS洗滌2次,將感作完成后的混合培養(yǎng)液加入到96孔板中培養(yǎng)96 h后,觀察記錄每孔的病變情況,按Reed-muech兩氏法計(jì)算血清中和抗體的效價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以S基因?yàn)槟０?針對(duì)昆蟲細(xì)胞進(jìn)行密碼子優(yōu)化,CAI(密碼子適應(yīng)指數(shù))從0.39調(diào)整為0.87,平均GC含量從35.8%調(diào)整為50.6%,利用基因合成技術(shù)獲得重組質(zhì)粒pFastBac-Dual-S。

2.2 重組桿粒獲取及重組桿狀病毒的拯救與鑒定

將上述構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac同源重組后獲得重組桿粒,并在轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后收獲重組桿狀病毒rpFastBac-S,將拯救的重組桿狀病毒rpFastBac-S傳代至第四代時(shí),Sf9細(xì)胞開始出現(xiàn)典型病變,表現(xiàn)為細(xì)胞生長緩慢、變大變圓。為了驗(yàn)證重組桿狀病毒rpFastBac-S是否構(gòu)建成功,作者通過PCR、Western blot、IFA試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行鑒定(圖1A～C)。鑒定結(jié)果如圖1所示,圖1A為提取第四代重組桿狀病毒DNA后,利用S基因特異引物進(jìn)行PCR鑒定和瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)果顯示在4 000 bp附近出現(xiàn)預(yù)期條帶,說明收獲的重組桿狀病毒正確表達(dá)了S目的蛋白基因;IFA試驗(yàn)的一抗為Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗體,利用倒置熒光顯微鏡能觀察到試驗(yàn)組產(chǎn)生了很亮的綠色熒光(圖1C),說明構(gòu)建的桿狀病毒有效表達(dá)了S目的蛋白;收集重組桿狀病毒rpFastBac-S感染Sf9細(xì)胞48 h后的培養(yǎng)液上清部分,使用Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果顯示其能夠與Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合(圖1B),說明重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞后可以有效表達(dá)S目的蛋白,并且該蛋白具有較好的反應(yīng)原性。

A. S基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(1. DL5000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);2. 重組桿狀病毒DNA);B. Western blot結(jié)果 (1. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);2～4. 桿狀病毒感染后的細(xì)胞上清;5. 正常Sf9細(xì)胞對(duì)照);C. 間接免疫熒光結(jié)果A. The PCR results of S gene (1. DL5000 marker; 2.Recombinant baculovirus DNA); B. Western blot results (1. Protein marker; 2-4. Baculovirus infected cell supernatant; 5. Normal Sf9 cell control); C. Indirect immunofluorescence assay results

2.3 桿狀病毒滴度測定

鑒定完成后,使用試劑盒測得第四代重組桿狀病毒rpFastBac-S的滴度為1.013×107IFU·mL-1,表明第四代重組桿狀病毒數(shù)量和密度良好,達(dá)到要求,能用于Sf9細(xì)胞的接種,可以進(jìn)行大量蛋白的表達(dá)。

2.4 優(yōu)化不同感染劑量對(duì)蛋白表達(dá)的影響

將rpFastBac-S分別以MOI=0.005、MOI=0.05、MOI=0.5、MOI=1、MOI=2感染Sf9細(xì)胞,3 d后,Western blot檢測蛋白表達(dá)情況。圖2顯示MOI為0.5時(shí)S蛋白表達(dá)量最高,所以將其作為后續(xù)大量表達(dá)蛋白時(shí)的最佳感染條件。

A. Western blot結(jié)果(1. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);2～6. 接毒量0.005、0.05、0.5、1、2 MOI);B. Western blot灰度值分析A. Western blot results (1. Protein marker;2-6. Dose 0.005,0.05,0.5,1,2 MOI); B. Western blot analysis of gray value

2.5 rpFastBac-BCoV-S蛋白在小鼠中的免疫原性評(píng)價(jià)

2.5.1 小鼠血清特異性抗體IgG檢測結(jié)果 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的基于BCoV S2重組蛋白的間接ELISA抗體檢測方法,對(duì)收集到的血清進(jìn)行特異性抗體檢測。由圖3可以看出,S蛋白組小鼠在首免一周后抗體水平開始升高,并在二免后抗體水平持續(xù)增長,二免7、14 d的特異性抗體效價(jià)顯著高于滅活病毒組和佐劑對(duì)照組,二免14 d特異性抗體效價(jià)最高達(dá)到1∶12 800。

**. P<0.01;***. P<0.001

2.5.2 小鼠血清中和抗體檢測結(jié)果 對(duì)收集到的各組一免7 d、一免14 d、二免7 d、二免14 d血清進(jìn)行BCoV中和抗體檢測。分析結(jié)果如圖4所示,S蛋白組小鼠在首免1周后就產(chǎn)生了抗BCoV的中和抗體,效價(jià)為1∶20～1∶40,與MF59佐劑對(duì)照組相比,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.05),并且隨著時(shí)間增長,中和抗體效價(jià)在持續(xù)升高,二免14 d后中和抗體效價(jià)最高達(dá)到1∶224。一免14 d后,S蛋白組中和效價(jià)平均值高于滅活病毒組,但中和抗體效價(jià)相當(dāng),統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(P>0.05)。

同一時(shí)間點(diǎn),柱上有相同字母表示差異不顯著(P>0.05),具不同標(biāo)記字母表示差異顯著(P<0.05)At the same time point, the same letter above each column indicates no significant difference between the treatments (P>0.05), while the different marked letters indicates significant difference (P<0.05)

3 討 論

牛冠狀病毒最早在1972年由Mebus等從牛腹瀉糞便中分離得到[21]。BCoV首先在美洲流行,隨后在亞洲和歐洲暴發(fā),流行范圍廣,可引起呼吸道和腸道雙重臨床癥狀[22]。感染BCoV后通常會(huì)導(dǎo)致初生犢牛腹瀉、冬季痢疾和呼吸道感染癥狀,進(jìn)而造成犢牛死亡、肉牛生長緩慢、奶牛產(chǎn)奶量和產(chǎn)奶品質(zhì)降低等影響,對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。牛冠狀病毒的S蛋白是病毒感染宿主細(xì)胞的主要成分,全長1 363個(gè)氨基酸[23],基因組較大,其序列高度突變和高重組的特性可能會(huì)導(dǎo)致BCoV的抗原性與致病性改變[24-25]。有研究表明,分子伴侶pG-KJE8可促進(jìn)BCoV病毒樣顆粒的可溶性表達(dá),與分子伴侶共表達(dá)的VLPs具有免疫活性,免疫小鼠后能使其產(chǎn)生較高IgG抗體水平和細(xì)胞因子水平[26]。S蛋白的單克隆抗體在體內(nèi)可防止BCoV引發(fā)的犢牛腸毛萎縮,證實(shí)了S蛋白在誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的同時(shí),也起到阻斷病毒附著和感染的作用,因此該蛋白在疫苗研究方面具有重要參考價(jià)值。

目前國內(nèi)暫無商品化BCoV疫苗。S蛋白是冠狀病毒的主要抗原蛋白,可以作為新型疫苗研究的切入點(diǎn)。新型冠狀病毒通過S蛋白的RBD結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體——血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2,介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞[13]。2021年9月,中國三葉草生物制藥公司一項(xiàng)研究表明,基于SARS-CoV-2 S蛋白的改良疫苗針對(duì)該病毒的五種變體提供了較強(qiáng)的保護(hù)作用,并且對(duì)具有高度傳染性的Delta毒株也具有較強(qiáng)的保護(hù)作用[27]。2022年,四川大學(xué)華西醫(yī)院研發(fā)出RBD-HR/三聚體亞單位疫苗,該研究將Delta變異株的RBD序列與SARS-CoV-2 S2亞基中的HR1和HR2序列直接串聯(lián)起來,使其通過自組裝形成三聚體[28],在多種動(dòng)物模型中能夠誘導(dǎo)持續(xù)的體液免疫,產(chǎn)生高水平的針對(duì)Omicron變異株的廣譜中和抗體,也可在體內(nèi)誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。

本研究發(fā)現(xiàn),利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的BCoV S重組蛋白經(jīng)過昆蟲細(xì)胞較為完整的包括糖基化在內(nèi)的翻譯后修飾,能夠正確折疊以維持原有的空間構(gòu)象和蛋白活性,在此基礎(chǔ)上還優(yōu)化了不同MOI感染后的S重組蛋白的表達(dá)量,結(jié)果表明MOI=0.5的接毒條件更適合蛋白表達(dá)。豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)與BCoV同屬于冠狀病毒科,在一項(xiàng)應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PEDV纖突蛋白的研究中,S蛋白免疫小鼠后,可刺激小鼠產(chǎn)生IL-4,但血清抗體水平與PBS組相比,并無明顯差異[29]。而本研究在BCoV S重組蛋白制備免疫原時(shí)使用了MF59佐劑與CpG免疫增強(qiáng)劑,小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示,該免疫原能夠刺激小鼠產(chǎn)生特異性IgG抗體,血清抗體效價(jià)最高達(dá)到1∶12 800,抗體效價(jià)顯著高于滅活病毒組和佐劑對(duì)照組,同時(shí)也能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的中和抗體,最高中和抗體效價(jià)達(dá)到1∶224,且S蛋白組的中和效價(jià)平均值高于滅活病毒組。MF59佐劑安全有效并且可以完全降解,在新型冠狀病毒疫苗研究中也有使用[28,30],而CpG免疫增強(qiáng)劑能提高免疫原穩(wěn)定性并延長其在體內(nèi)的半衰期,可不同程度地誘導(dǎo)體液免疫與細(xì)胞免疫,增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答[31]。本研究為后續(xù)BCoV重組亞單位疫苗的研制提供了進(jìn)一步的參考。

4 結(jié) 論

本研究利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了BCoV全長S蛋白,免疫小鼠后,產(chǎn)生高水平的特異性IgG抗體與中和抗體,說明本研究中表達(dá)的BCoV S重組蛋白具有良好的免疫原性,為今后BCoV亞單位疫苗的研發(fā)提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。