新西蘭白兔BMP15基因的真核表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)模式及其在卵巢組織的表達(dá)

陳孟娟,劉雨晴,王智通,溫佳樂(lè),許會(huì)芬,于光晴,李 明

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,鄭州 450046)

兔(Oryctolaguscuniculus)是最重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一,可為人們提供肉、皮毛等生產(chǎn)生活資料。兔肉具有低脂肪、低膽固醇和高蛋白質(zhì)的特點(diǎn),其深受消費(fèi)者的歡迎[1]。兔繁殖性能是影響兔產(chǎn)業(yè)發(fā)展和經(jīng)濟(jì)效益的重要因素,雌性動(dòng)物的繁殖潛力主要取決于卵巢和卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育[2],因此,探究兔卵巢卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制,在其生產(chǎn)過(guò)程中具有重要的科學(xué)意義。

卵巢的發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,在每個(gè)生殖周期都經(jīng)歷著廣泛的組織重塑,包括卵泡的形成和閉鎖、排卵、黃體形成和退化的過(guò)程,并且還伴隨著血管系統(tǒng)和微環(huán)境的變化[3-5]。卵泡是卵巢的功能單位,多種卵巢內(nèi)因子參與膜內(nèi)細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的旁分泌/自分泌信號(hào)傳導(dǎo),并且有助于優(yōu)勢(shì)卵泡的發(fā)育[6]。研究發(fā)現(xiàn),卵巢內(nèi)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)著卵泡的發(fā)育和生長(zhǎng),如卵泡信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGFβ)家族發(fā)揮著重要作用,它可以調(diào)控卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和孕酮的分泌進(jìn)而調(diào)控卵泡的發(fā)育和閉鎖[7]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)由卵母細(xì)胞分泌,屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)超家族的多功能胞外分泌蛋白,在哺乳動(dòng)物卵巢、卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟以及排卵過(guò)程中起著不可或缺的作用[8-9]。BMP15 蛋白作為卵母細(xì)胞分泌因子,以內(nèi)分泌或旁分泌的方式分泌到胞外,通過(guò)調(diào)節(jié)卵泡顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化來(lái)控制卵泡的生成和排卵,最終影響優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇和閉鎖卵泡的形成[10]。Hosoe等[11]研究發(fā)現(xiàn),BMP15在成年母牛卵巢卵丘細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于小牛,且在母牛的卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中均有表達(dá)。在小鼠卵巢中,BMP15最早出現(xiàn)于初級(jí)卵母細(xì)胞中,持續(xù)表達(dá)于卵母細(xì)胞晚期,并維持至排卵發(fā)生,存在于卵泡發(fā)育的各個(gè)階段[12]。當(dāng) BMP15敲除后,導(dǎo)致豬卵巢發(fā)育功能不全以及正常卵泡的數(shù)量顯著減少[13]。綿羊BMP15基因突變?yōu)榧兒献雍?其卵泡發(fā)育停滯[14]。BMP15能夠刺激顆粒細(xì)胞中促卵泡激素(FSH)mRNA表達(dá)增加,從而調(diào)控卵巢內(nèi)固醇類(lèi)激素的合成和促黃體受體(LHR)的表達(dá)[15]。還有研究發(fā)現(xiàn),BMP15基因通過(guò)TGF-βRⅡ 激活SMAD4信號(hào)分子從而實(shí)現(xiàn)調(diào)控卵泡顆粒細(xì)胞的發(fā)育[16]。BMP15作為家畜繁殖力的重要候選基因,在卵巢發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用,對(duì)其深入研究能更好地理解卵巢卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制。

目前,BMP15的研究已經(jīng)在多個(gè)物種中開(kāi)展,但BMP15對(duì)于兔卵巢發(fā)育影響的研究較少,BMP15基因?qū)ν梅敝硻C(jī)能的調(diào)控機(jī)制尚未清楚。本試驗(yàn)以新西蘭白兔卵巢組織RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,克隆出BMP15 基因的CDS區(qū),構(gòu)建該基因的真核表達(dá)載體,對(duì)BMP15蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,通過(guò)激光共聚焦方法檢測(cè)BMP15在細(xì)胞內(nèi)的定位情況,并且通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)新西蘭白兔BMP15基因在不同組織及器官中的表達(dá)情況,初步分析BMP15基因的功能及表達(dá)特點(diǎn),以期為深入研究兔BMP15基因?qū)β殉舶l(fā)育的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ),為提高家畜繁殖能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

選取180日齡健康的新西蘭白兔雌兔3只,屠宰后迅速采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、子宮、腿肌、卵巢組織,用PBS沖洗后,剪成小塊,轉(zhuǎn)入2 mL無(wú)酶凍存管中,液氮速凍后,放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。本試?yàn)所使用的細(xì)胞系為人胚胎腎細(xì)胞(HEK293 T)和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(H1299)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 主要試劑

Trizol試劑和DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)有限公司,KOD高保真酶購(gòu)自于上海東洋紡生物科技有限公司,DNA Marker、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自于莫納(武漢)生物科技有限公司,膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自于北京天根生化科技有限公司,T4連接酶購(gòu)自TaKaRa(日本)公司,KpnⅠ、EcoR Ⅰ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB(北京)公司,PBS、胎牛血清和 DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司,Lipofectamine 3000試劑購(gòu)自Thermo(美國(guó))生物科技有限公司,4% PFA多聚甲醛購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司,DAPI和抗熒光淬滅劑購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司,Myc抗體購(gòu)自Santa Cruz(美國(guó))公司 (sc-40),BMP15抗體購(gòu)自上海生工生物工程有限公司 (D121992),β-actin抗體購(gòu)自賽維爾(武漢)生物科技有限公司(GB11001-100),蛋白質(zhì)裂解液、蛋白質(zhì)上樣緩沖液、蛋白marker購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

參考GenBank中公布的兔BMP15基因序列(GenBank登錄號(hào):NM_001 199 117.1),使用SnapGene設(shè)計(jì)BMP15基因特異性克隆引物,隨后使用NCBI網(wǎng)站進(jìn)行引物驗(yàn)證,使用NCBI設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大小為100～200 bp。內(nèi)參為GAPDH基因(GenBank登錄號(hào):NM_001082-253.1),引物序列信息見(jiàn)表1。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄

取黃豆大小(100 mg)的組織樣品進(jìn)行研磨,用Trizol法提取組織總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量,超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5 家兔BMP15基因的克隆

以新西蘭白兔卵巢組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為:模板cDNA(500 ng·μL-1)5 μL,BMP15-F(10 ng·μL-1)1.5 μL,BMP15-R(10 ng·μL-1)1.5 μL, KOD OneTM PCR Master Mix 25 μL,ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR 反應(yīng)程序:98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s , 60 ℃退火5 s, 68 ℃延伸13 s, 35個(gè)循環(huán);68 ℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,膠回收試劑盒回收目的條帶,將回收的目的條帶、Pmcherry-N1 和pCMV-Myc載體用KpnI、EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切37 ℃、30 min后,酶切產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,膠回收,將回收的目的基因以及載體使用T4連接酶連接,體系為:T4連接酶1 μL,Buffer 1 μL,目的基因膠回收產(chǎn)物 5 μL,載體3 μL,16 ℃連接過(guò)夜,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化,涂在含有卡那霉素、氨芐霉素的培養(yǎng)板上,第2天挑取陽(yáng)性菌落,菌液PCR結(jié)果正確后送擎科生物有限公司測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果利用SeqMan軟件與兔BMP15基因進(jìn)行序列比對(duì)。利用在線工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析,分析工具如表2所示,利用Mega7.0軟件對(duì)不同物種BMP15基因進(jìn)行同源性比較,并繪制不同物種BMP15基因的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表2 生物信息學(xué)分析網(wǎng)址

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR

以新西蘭白兔的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢、子宮的cDNA為模板,準(zhǔn)備相對(duì)應(yīng)的1.5 mL無(wú)酶EP管,將相對(duì)應(yīng)上下游引物、水、SYBRGreen Mix預(yù)混在一起,分別均勻加至每孔,生物重復(fù)和技術(shù)重復(fù)各3個(gè),反應(yīng)體系為10 μL:cDNA模板1 μL,上、下游引物各 0.2 μL,SYBRGreen Mix 5 μL, ddH2O 補(bǔ)足至 10 μL。使用實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x器進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。根據(jù)熒光定量所得到的 Ct 值,采用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,GraphPad Prism 7.0軟件作圖。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的H1299細(xì)胞和HEK293 T細(xì)胞從液氮中取出,放在37 ℃水浴鍋中解凍,期間不斷搖晃使受熱均勻,隨后將細(xì)胞凍存液移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,分別加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基,放入含有5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。傳代2～3次,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70～80%時(shí),按照Lipofectamine 3000 試劑盒說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,將pCMV-Myc-BMP15轉(zhuǎn)染到HEK293 T細(xì)胞內(nèi),對(duì)照組轉(zhuǎn)染pCMV-Myc空載體,每組各設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),培養(yǎng)24 h 后,收取細(xì)胞樣品用于檢測(cè)mRNA 水平的過(guò)表達(dá)效果;48 h 后,收取細(xì)胞樣品用于檢測(cè)蛋白水平表達(dá)效果。同樣地按照Lipofectamine 3000 試劑盒說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染Pmcherry-N1-BMP15質(zhì)粒,設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.10 激光共聚焦分析

待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),將細(xì)胞接種于預(yù)先加入圓形蓋玻片(直徑2 cm)的6孔板中,細(xì)胞密度為2×105個(gè)·孔-1;培養(yǎng)24 h后,轉(zhuǎn)染構(gòu)建的Pmcherry-N1-BMP15質(zhì)粒;24 h后,去除培養(yǎng)基,用 PBS漂洗3次,用1 μg·mL-1DAPI 室溫下染色10 min,PBS清洗細(xì)胞3次;封片:取約5 μL抗淬滅劑滴加到載玻片上,然后將蓋玻片倒置于抗淬滅劑上(有細(xì)胞的一面向下),用吸水紙吸凈溢出來(lái)的抗淬滅劑;用Leica 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.11 Western blotting

使用裂解液提取細(xì)胞或組織的蛋白,加入蛋白上樣緩沖液后,100 ℃煮10 min。待蛋白樣品冷卻后,根據(jù)蛋白含量,在上樣孔中加入5～10 μL蛋白樣品和2.5 μL蛋白Marker。將電壓設(shè)為80 V進(jìn)行電泳,待溴酚藍(lán)條帶進(jìn)入分離膠,將電壓設(shè)置為120 V,電泳50～60 min(根據(jù)目的蛋白分子量大小調(diào)整電泳時(shí)間)。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,120V,60 min。5%脫脂奶粉封閉60 min,孵育一抗 4 ℃過(guò)夜,一抗工作濃度為1∶1000稀釋,TBST洗膜3次,每次5 min,室溫孵育二抗60 min,二抗工作濃度為1∶10 000,TBST洗膜3次。PVDF膜滴加ECL發(fā)光液,放入到暗室中進(jìn)行顯影。

1.12 免疫熒光

采取健康新西蘭白兔的卵巢,10%多聚甲醛固定后,制作石蠟切片,將切片置于0.1 mol·L-1、 pH=6的枸櫞酸液修復(fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù);PBS洗2次,每次2 min,加0.2% TritonX-100透膜15 min;PBS洗兩次,每次2 min;玻片上PBS用濾紙擦凈,在濕盒內(nèi)用BSA室溫封閉1 h;PBS洗兩次后,4 ℃孵育一抗過(guò)夜,一抗工作濃度為1∶1 000稀釋,PBS洗5次,滴加熒光二抗并在濕盒內(nèi)室溫避光孵育1 h,二抗工作濃度為1∶500稀釋;PBS洗3次,滴加DAPI避光孵育15 min,PBS洗兩次后,滴加抗熒光淬滅劑封片,烘干后在熒光顯微鏡下觀察。

1.13 數(shù)據(jù)分析

定量和蛋白量化數(shù)據(jù)使用 SPSS 26.0 軟件進(jìn)行分析處理,經(jīng)齊性檢驗(yàn)后,進(jìn)行單因素方差分析比較顯著性差異,顯著性水平為: *P<0.05表示差異顯著,**P<0.05表示差異比較顯著,***P<0.05表示差異極顯著。使用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖形繪制。

2 結(jié) 果

2.1 新西蘭白兔 BMP15 基因的克隆

以反轉(zhuǎn)錄的卵巢組織cDNA為模板,PCR 擴(kuò)增BMP15基因,擴(kuò)增片段為1 182 bp,1% 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期片段相符(圖1)。測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì),與NM_001 199 117.1的相似度為100%,可以初步確定為兔BMP15 CDS區(qū)序列。

M. DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. BMP15 基因CDS區(qū)全長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物M. 2000 bp DNA marker; 1. PCR amplification product of CDS region of BMP15 gene 圖1 新西蘭白兔BMP15基因CDS區(qū)克隆Fig.1 The CDS region of New Zealand white rabbits BMP15 gene

2.2 新西蘭白兔 BMP15 基因及蛋白生物信息學(xué)分析

2.2.1 新西蘭白兔BMP15基因編碼核苷酸序列分析 新西蘭白兔BMP15基因序列與小鼠、人、牛、豬、馬、綿羊、雞、犬的同源相似性分別為66.3%、75.5%、81.2%、81.9%、81.2%、79.9%、38.3%、81.7%(圖2A)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明(圖2B),兔與豬的親緣關(guān)系最近,與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)

A. 新西蘭白兔與其他物種BMP15基因核苷酸序列同源性比較; B. 新西蘭白兔BMP15基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)A. Comparison of nucleotide sequence homology of BMP15 gene between New Zealand white rabbits and other species; B. Phylogenetic tree of BMP15 gene in New Zealand white rabbits

2.2.2 新西蘭白兔BMP15蛋白理化性質(zhì)分析 蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示,新西蘭白兔BMP15蛋白分子式為C2020H3199N591O550S18,其原子總數(shù)為6 378,含有393個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)為9.69,屬于堿性蛋白,不穩(wěn)定指數(shù)為55.32,為不穩(wěn)定蛋白,脂肪酸指數(shù)為92.80%,總平均親水性為-0.865,為親水性蛋白(圖3)。對(duì)新西蘭白兔BMP15蛋白氨基酸主成分分析結(jié)果如表3所示,其中負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)為31,正電殘基(Arg+Lys)總數(shù)為48。

圖3 新西蘭白兔 BMP15 蛋白疏水性分析Fig.3 Hydrophobic analysis of BMP15 protein in New Zealand white rabbits

表3 新西蘭白兔 BMP15 蛋白的氨基酸組成

2.2.3 新西蘭白兔BMP15蛋白跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽預(yù)測(cè) 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,新西蘭白兔BMP15 蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu),表明BMP15蛋白不屬于跨膜蛋白(圖4A)。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖4B), BMP15蛋白在25位氨基酸處存在一個(gè)信號(hào)肽,屬于分泌型蛋白。

A. 新西蘭白兔 BMP15 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè); B. 新西蘭白兔 BMP15 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)A. Prediction of transmembrane region of BMP15 protein in New Zealand white rabbits; B. Prediction of BMP15 protein signal peptide in New Zealand white rabbits

2.2.4 新西蘭白兔BMP15蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)分析 如圖5所示,新西蘭白兔BMP15蛋白共檢測(cè)出26個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中19個(gè)Serine(絲氨酸)磷酸化位點(diǎn),7個(gè)Threonine (蘇氨酸) 磷酸化位點(diǎn)。NetNGlyc4.0分析表明BMP15蛋白共有15個(gè)糖基化位點(diǎn)。

圖5 BMP15蛋白磷酸化位點(diǎn)圖Fig.5 Phosphorylation site map of BMP15 protein

2.2.5 BMP15蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)蛋白質(zhì)在線分析系統(tǒng)預(yù)測(cè)BMP15蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示,新西蘭白兔BMP15蛋白主要由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角組成,占比分別為38.68%、37.4%、15.52%、8.40%,為混合性蛋白(圖6)。該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)主要以 α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主,與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致(圖7)。

h.α-螺旋;e.延伸鏈;t.β-轉(zhuǎn)角;c.無(wú)規(guī)則卷曲h. α-helix; e. Extension chain; t. β-rotation; c. Irregular crimp

圖7 BMP15 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 BMP15 tertiary structure prediction

2.2.6 新西蘭白兔BMP15蛋白的互作分析 通過(guò)STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析BMP15蛋白的相互作用,如圖8所示,發(fā)現(xiàn)BMP15蛋白與促卵泡激素受體(FSHR)、生殖系a因子(FIGLA)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B(BMPR1B)、配體特異性II型受體(AMHR2)、新生兒卵巢同源基因(NOBOX)等蛋白之間存在相互作用。

圖8 新西蘭白兔 BMP15 蛋白與其它蛋白相互作用Fig.8 Interaction between BMP15 protein and other proteins in New Zealand white rabbit

2.3 BMP15 基因在新西蘭白兔不同組織和器官中的表達(dá)量分析

對(duì)BMP15基因在新西蘭白兔各個(gè)組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析,結(jié)果如圖9所示,由結(jié)果可知,BMP15基因僅在卵巢中表達(dá)(P<0.05)。

圖9 BMP15基因在新西蘭白兔不同組織中的表達(dá)量Fig.9 Expression of BMP15 gene in different tissues of New Zealand white rabbits

2.4 BMP15亞細(xì)胞定位分析

將已構(gòu)建成功的紅色熒光標(biāo)簽標(biāo)記的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞中,BMP15主要分布在細(xì)胞質(zhì)中(圖10)。

mCherry-BMP15代表紅色熒光通道;DAPI代表藍(lán)色熒光通道;MERGE表示兩個(gè)通道的疊加mCherry-BMP15 represents red fluorescence channel; DAPI represents blue fluorescence channel; MERGE represents the superposition of two channels

2.5 兔BMP15基因在HEK293 T細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)

將帶有Myc標(biāo)簽的BMP15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞內(nèi),定量結(jié)果顯示(圖11A),BMP15 mRNA水平相比對(duì)照組上調(diào)約13 666倍(P<0.001),Western bloting結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)BMP15后,BMP15蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.001)(圖11B,C)。

A. 過(guò)表達(dá)后BMP15 mRNA相對(duì)表達(dá)量;B. 過(guò)表達(dá)后BMP15蛋白的表達(dá);C. 蛋白表達(dá)量化結(jié)果。CON. 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組;OVE. 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。***. P<0.001A. Relative expression of BMP15 mRNA after overexpression; B. Expression of BMP15 protein after overexpression. C. Quantitative results of protein expression.CON. Empty plasmid transfection control group; OVE. Recombinant plasmid transfection group. ***. P<0.001

2.6 BMP15 在卵巢組織的定位及表達(dá)

卵巢組織免疫熒光結(jié)果顯示(圖12A),BMP15表達(dá)于不同發(fā)育時(shí)期卵泡的顆粒細(xì)胞中,并且主要在顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。同時(shí),BMP15蛋白在新西蘭白兔卵巢組織的表達(dá)如圖12B所示。

3 討 論

近年來(lái),對(duì)于BMP15在卵巢發(fā)育中作用的研究不斷深入, BMP15對(duì)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育影響的分子機(jī)制也慢慢明確,但BMP15在兔上的研究還甚少。秦明鳴等[2]通過(guò)構(gòu)建豬BMP15基因報(bào)告載體隨后顯微注射至不同細(xì)胞內(nèi)及體外培養(yǎng)的卵泡中,發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子只在卵巢細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá),并且能在卵母細(xì)胞體外成熟18 h 啟動(dòng)表達(dá)。本研究通過(guò)克隆得到新西蘭白兔BMP15基因的CDS區(qū)序列,并且成功構(gòu)建出BMP15真核表達(dá)載體,可以為深入探究BMP15基因?qū)τ谕梅敝承阅苡绊懙姆肿訖C(jī)制提供基礎(chǔ)。接下來(lái)通過(guò)對(duì)不同物種間BMP15基因及其編碼序列分析發(fā)現(xiàn),兔與豬、犬、牛、綿羊的同源性較高,而與雞的序列同源性較低,說(shuō)明在哺乳動(dòng)物中BMP15基因進(jìn)化比較保守。

本研究通過(guò)TMHMML 和SignalP-4.1在線軟件預(yù)測(cè)BMP15不屬于跨膜蛋白,并且含有一個(gè)信號(hào)肽,屬于分泌型蛋白。BMP15的無(wú)活性前體包括N端信號(hào)肽、前肽和含有成熟蛋白的C端區(qū)域,當(dāng)其發(fā)揮生物學(xué)功能時(shí),將進(jìn)行翻譯后處理,包括信號(hào)肽的去除、二聚化和進(jìn)一步的剪切[17]。BMP15蛋白成熟區(qū)域的二聚化包括其自身的二聚化或者與其它TGF超家族成員的成熟區(qū)域進(jìn)行二聚化[18],有報(bào)道稱人類(lèi)BMP15與GDF9成熟蛋白會(huì)形成成熟的同型二聚體、多聚體和異二聚體[19-20]。對(duì)BMP15蛋白進(jìn)行磷酸化預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)該蛋白共有26個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn),能發(fā)生磷酸化的氨基酸位點(diǎn)包括絲氨酸和蘇氨酸;糖基化預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白共有15個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。磷酸化和糖基化是重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,蛋白質(zhì)的磷酸化與多種生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān),包括 DNA 損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,糖基化修飾是可以改變多肽的構(gòu)象,進(jìn)而使蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定[21]。體外研究表明,受體需要磷酸化和糖基化來(lái)識(shí)別BMP15因子,從而保證其生物活性[22]。

蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)結(jié)果表明,BMP15蛋白與FSHR、FIGLA、BMPR1B等10種蛋白之間存在相互作用關(guān)系。其中FSHR蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員之一,對(duì)于動(dòng)物卵巢卵泡的發(fā)育有著重要的調(diào)控作用[23],其突變會(huì)導(dǎo)致雌、雄動(dòng)物的不孕或者是繁殖能力降低[24-25]。在新西蘭白兔生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,FSHR mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平隨著年齡的增長(zhǎng)和卵巢卵泡的生長(zhǎng)而同步增加[26]。Du等[27]研究發(fā)現(xiàn),敲低FSHR會(huì)誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖,并且能夠降低細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的水平。BMP15 可以通過(guò)Smad和非Smad途徑誘導(dǎo)人顆粒細(xì)胞中的 FSHR 表達(dá),從而控制卵泡的生長(zhǎng)[28]。FIGLA(生殖系a因子)是第一個(gè)生殖細(xì)胞特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,在卵泡發(fā)育和透明帶形成的過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用,FIGLA基因異常會(huì)導(dǎo)致卵巢早衰,研究表明FIGLA在早期卵子發(fā)生期間通過(guò)抑制卵母細(xì)胞雌激素信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)促進(jìn)卵泡的形成[29-32]。BMPR1B蛋白與BMP15蛋白一樣均屬于TGF-β超家族成員,近年來(lái),有大量研究表明BMPR1B基因是多種綿羊品種的多胎主效基因[33],也是綿羊高繁殖力的主效基因和控制綿羊繁殖性能遺傳的重要候選基因[34]。趙金[35]研究發(fā)現(xiàn),BMP15通過(guò)受體BMPR1B激活MAPK通路調(diào)控卵泡顆粒細(xì)胞增殖和凋亡。以上這些結(jié)果表明,BMP15在卵巢卵泡發(fā)育、卵泡閉鎖、雌激素生成等眾多生理過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用,但這只是初步預(yù)測(cè)分析結(jié)果,還需進(jìn)一步深入研究驗(yàn)證。

本研究用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了BMP15基因在180日齡新西蘭白兔不同組織中的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)BMP15基因僅在卵巢組織中特異性表達(dá),這一結(jié)果與李明霞等[36]在牦牛上的研究結(jié)果一致。但目前,有許多研究表明,BMP15基因的組織表達(dá)特點(diǎn)不盡相同,可能不同物種之間有所區(qū)別。Elis等[37]研究發(fā)現(xiàn),BMP15基因在雞的卵巢以及其它組織中均有表達(dá)。劉世佳等[38]對(duì)綿羊的研究發(fā)現(xiàn),BMP15基因在其卵巢以及十二指腸中高表達(dá)。H1299細(xì)胞系具有較大的細(xì)胞核,常被作為檢測(cè)亞細(xì)胞定位的工具。將BMP15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞后,用激光共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)BMP15基因主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá),同時(shí)卵巢免疫熒光結(jié)果顯示,BMP15主要定位在卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,這些結(jié)果與其可能為分泌型蛋白的結(jié)果相一致。

BMP15基因在家兔卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用還尚未報(bào)道,BMP15作為卵巢卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)控因子,通過(guò)調(diào)控該基因的表達(dá)與活性可影響卵泡的生長(zhǎng)和顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡,最終影響家兔的繁殖性能,但其中具體的調(diào)控機(jī)制還需要深入探究。本研究獲得了新西蘭白兔BMP15基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和表達(dá)特征,為進(jìn)一步開(kāi)展BMP15基因在家兔生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功克隆了新西蘭白兔BMP15基因的CDS區(qū)序列,全長(zhǎng)1 182 bp ,編碼393個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明,該蛋白與豬的親緣關(guān)系最近,與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。同時(shí),該蛋白為堿性不穩(wěn)定蛋白,并且還含有一個(gè)信號(hào)肽,可能為分泌型蛋白。蛋白互作分析表明,BMP15基因與多種蛋白質(zhì)相互作用,這些蛋白在卵巢卵泡發(fā)育過(guò)程中具有一定的調(diào)控作用。組織表達(dá)分析表明,BMP15基因在新西蘭白兔卵巢組織中特異性表達(dá),并且免疫熒光結(jié)果顯示BMP15表達(dá)于不同發(fā)育時(shí)期的卵泡顆粒細(xì)胞。亞細(xì)胞定位表明,BMP15主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展BMP15基因功能研究提供了理論依據(jù)。