荷斯坦牛肺干細胞分離培養(yǎng)與生物學(xué)特性研究

劉晏辰,周世瑩,張 洋,高 揚,關(guān)偉軍*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;2.首都體育學(xué)院,北京 100191)

肺癌是一種高度惡性的腫瘤,給人類健康帶來了嚴重的威脅。化療、放療、手術(shù)等手段在治療肺癌方面取得了一定的進展,但其5年生存率仍然很低。因此近年來,人們在分子、基因?qū)用嫔蠈Ψ伟┌l(fā)生發(fā)展的機理進行了深入研究,提供了新的治療思路。研究發(fā)現(xiàn),胚胎肺組織中存在多種前體細胞,而成年肺組織中是否有具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細胞尚不清楚[1]。為了深入了解肺癌的病理機制以及開發(fā)新的肺癌治療手段,一些研究組開始對肺間充質(zhì)干細胞(LR-MSCs)進行研究。

LR-MSCs是一種干細胞,具有分化多種組織的潛能,其是干細胞研究與臨床工作者共同探索的重要方向。在研究過程中,研究者采用阻斷組織壁等方法獲得LR-MSCs,并將其與原代培養(yǎng)的LR-MSCs進行共培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn),這些細胞具有向成脂、成骨、軟骨等組織分化的能力,并且已經(jīng)證明LR-MSCs具有多向分化的潛能,這被認為具有很大的實用價值。

目前,原代培養(yǎng)是LR-MSCs體外培養(yǎng)的最為常用的方法。這種方法不僅能夠重現(xiàn)LR-MSCs體外形成、增殖、分化的全過程,而且能夠直觀觀察不同因子對LR-MSCs體外培養(yǎng)的影響,還能保持基因背景不變,使得研究結(jié)果更加可靠、可信[2-6]。因此,LR-MSCs的形態(tài)學(xué)、增殖及分化潛能的研究對于肺癌的治療具有重要意義。肺間質(zhì)干細胞可以作為潛在的標(biāo)志物用于幫助早期診斷。研究人員發(fā)現(xiàn),肺間質(zhì)干細胞特有的標(biāo)記物和生物學(xué)特征,如CD44、CD166等,與肺癌的存在和發(fā)展相關(guān)聯(lián)。通過檢測這些標(biāo)記物的表達,可以提高肺癌診斷的準(zhǔn)確性和敏感性。在肺癌的治療方面,肺間質(zhì)干細胞也可能對治療結(jié)果產(chǎn)生影響。研究表明,肺間質(zhì)干細胞可以通過多種機制參與肺癌的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥性等過程。同時,肺間質(zhì)干細胞與腫瘤微環(huán)境之間存在相互作用,可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和血管生成等過程,從而影響肺癌的發(fā)展和治療效果[7-9]。

此外,肺間質(zhì)干細胞還具有一定的應(yīng)用潛力。通過將抗腫瘤藥物或基因載體轉(zhuǎn)導(dǎo)到肺間質(zhì)干細胞中,可以提高藥物的靶向性和療效,從而改善肺癌的治療效果。此外,肺間質(zhì)干細胞還可能被用作肺癌疫苗的載體,以提高免疫治療的效果。

肺間質(zhì)干細胞在肺癌中的具體作用機制和其在臨床應(yīng)用中的潛力還需要進一步的研究和驗證[10]。此外,由于肺間質(zhì)干細胞的來源和獲取方面的限制,其在臨床應(yīng)用中還面臨著一些挑戰(zhàn)。因此,進一步深入研究肺間質(zhì)干細胞與肺癌的關(guān)系,將有助于揭示其作用機制,開發(fā)更有效的診斷和治療策略[11-13]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 試驗所用健康雄性荷斯坦牛胚胎由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)所昌平實驗基地提供。

1.1.2 主要材料 胰蛋白酶(Tripsin)、胎牛血清(FBS)DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、L-DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自 Gibco 公司;膠原酶V購自 Sigma公司;封閉用山羊血清、FITC 標(biāo)記山羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;CD29、CD44、CD73、CD90、CD34、CD45 一抗購自美國 Abcam 公司;RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 公司;胰島素生長因子-1 (IGF-1)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白(ITS)均購自英國 Perotech 公司;吉姆薩染液、油紅O染液、阿利新藍染液、糖原染液、茜素紅染液均購自索萊寶公司。激光共聚焦顯微鏡(Nikon 公司),TH4-200 倒置顯微鏡(Olympus 公司),CO培養(yǎng)箱(Heraeus 公司),離心機(Ependorf 公司)。

1.2 方法

1.2.1 LR-MSCs的分離培養(yǎng) 試驗所用荷斯坦牛胚胎在無菌情況下取肺部組織,經(jīng) PBS沖洗3次后,去腸系膜,將肺部組織切開(1 mm×1 mm×1 mm),用0.1%膠原蛋白4在37 ℃下進行10～20 min的消化。在 DMEM/F12混合液中加入10%的FBS,經(jīng)中和后進行消化。用100目的篩子過濾得到的懸浮液,在1 200 r·min-1下離心6 min。用 PBS法處理,將不粘著的細胞移除。

組織塊貼壁法:小塊肺部組織需要經(jīng)過洗滌處理后才能被貼在細胞培養(yǎng)皿上。這是為了去除可能存在的細菌和污染物,以保證組織的健康生長。組織塊需要在完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),包括DEME/F12、FBS和bFGF。這些培養(yǎng)基成分可以提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子,以促進組織生長。組織塊需要在特定的環(huán)境下進行培養(yǎng),包括37 ℃和50 mL·L-1CO2的培養(yǎng)箱。組織塊的邊緣會出現(xiàn)大量的細胞,這時可以在融合率達到80%時使用胰蛋白酶進行傳代,繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 LR-MSCs生長曲線及群體倍增時間檢測 在24孔平板上,將3、9、15代的細胞以1×104個·孔-1的密度種植。從接種開始,每隔24 h,在3個小孔中有序地抽取3個小孔,連續(xù)8 d,采集細胞懸液。以此為依據(jù),畫出生長曲線,并計算出群倍數(shù)(PDT)。PDT=lg2(t-t0)/(lgNt-lgN0),Nt為最后的培養(yǎng)細胞數(shù)量。

1.2.3 LR-MSCs克隆形成能力檢測 將第3、9、15代的LR-MSCs細胞以100個·孔-1接種在6孔板中培養(yǎng),2周后可見單個LR-MSCs形成較大克隆團,40 g·L-1多聚甲醛固定30 min,PBS洗2次,吉姆薩工作液染色20 min。顯微鏡下拍照觀察克隆形態(tài)并計算克隆形成率,克隆形成率=克隆形成數(shù)/接種細胞數(shù)×100%,試驗重復(fù)3次以計算平均值。

1.2.4 染色體核型檢測 加入秋水仙素0．2 μg·mL-1,于37 ℃和50 mL·L-1CO2培養(yǎng)器中連續(xù)培養(yǎng)24 h,將其消化后采集,2 000 r·min-1離心10 min,除去上清,37 ℃進行低滲性預(yù)處理30 min,用1 mL的固定溶液輕輕吹動混合均勻后,將1 mL的定量分析溶液混合均勻后置于室內(nèi)溫靜置30 min,再進行1次以上的定量分析。然后將其取出,于冷凍后的玻璃片上1.5 m高度,將其均勻地倒在玻璃片上,于室溫下進行烘干,用吉姆薩工作液對其進行20 min的染色。經(jīng)過干燥處理后,在顯微鏡下進行詳細的觀察和照片。

1.2.5 LR-MSCs表面標(biāo)志物檢測 將LR-MSCs種植于6孔平板上。當(dāng)融合率為70%時,用 PBS沖洗,40 g·L-1的聚乙二醇固定30 min,0.25%的TritonX-100滲透10 min。在室溫下將羊血清封閉30 min后,加入CD29、CD44、CD73;在4 ℃下培養(yǎng)CD90抗體的稀釋劑。丟棄第一抗體,用 PBS沖洗2次,添加 FITC標(biāo)記的第二抗體,培養(yǎng)1 h。PBS沖洗3次,DAPI培養(yǎng)20 min,PBS沖洗完畢,用激光共焦顯微鏡對 PBS沖洗完畢的樣品進行觀察和攝像。

1.2.6 多能性相關(guān)基因表達鑒定 采用 Trizol方法,通過 PCR試劑盒(TaKaRa)進行 RNA的合成。通過 Primer Premier5．0軟件對特異的引物進行設(shè)計(表1),對 RNA進行擴增。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包含10×RT緩沖液2．0 μL,蒸餾水13．4 μL,LEx-Taq 0．2 μL,正、反轉(zhuǎn)引物共2．0 μL,模板 cDNA1．0 μL,dNTP (2．5 mmol·L-1)1．4 μL。根據(jù)操作規(guī)程,對反應(yīng)條件進行了設(shè)定。PCR擴增產(chǎn)物后,于140 V瓊脂電泳恒溫培養(yǎng)30 min,檢測多能性相關(guān)基因的表達。

表1 引物信息

1.2.7 誘導(dǎo)分化能力鑒定 成骨誘導(dǎo)劑包括:DMEM/F12、10%的 FBS、0.1 mmol·L-1的地塞米松、10 mmol·L-1的β-甘油、50 mg·L-1的 Vc。本試驗的誘發(fā)劑為 DMEM/F-12,FBS為10%,地塞米松為10～7 mol·L-1,肺部島素為8 μg·L-1,吲哚美辛為70 μmol·L-1,IBMX為0.5 mmol·L-1。L-DMEM,FBS 2.5%,ITS1%,脯氨酸50 μg·mL-1,地塞米松0.1 μmol·L-1,丙酮酸鈉0.5 mmol·L-1,維生素C 50 μg·mL-1,TGF-β310 ng·mL-1,IGF-1 10 mg·L-1,IGF-110。以茜素紅、油紅O、阿利新蘭、糖原等為主要研究對象,采用RT-PCR技術(shù),對骨特異性基因collogen-I、骨橋蛋白(OPN)進行研究。前期研究發(fā)現(xiàn),成脂特異性的PPAR-γ和 LPL在脂肪組織中均高表達。研究發(fā)現(xiàn),成軟骨特異性蛋白 ACAN、SOX9在軟骨細胞中表達。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS25．0軟件對資料進行了單因子變異數(shù)分析和鄧肯氏多元比較,結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,P<0.05表明差異有顯著性,P<0.01表明差異有極顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 LR-MSCs的分離培養(yǎng)

采用組織塊貼壁法可以得到LR-MSCs,這種方法所得到的細胞在傳到第3代的時候,其形態(tài)是長梭形的,并且呈螺旋狀生長(圖1)。

2.2 LR-MSCs體外增殖能力檢測

對LR-MSCs進行第3、9、15代培養(yǎng)后,分別對第3、9、15代培養(yǎng)的LR-MSCs作生長曲線。3個世代的生長周期分別為潛伏期、對數(shù)生長期、平緩期、下降期,形成一個典型的“S”形(圖2)。結(jié)果顯示:隨著傳代次數(shù)的增多,細胞倍增能力在不斷下降。

圖2 荷斯坦牛LR-MSCs生長曲線Fig.2 Growth curves of Holstein cattle LR-MSCs

2.3 LR-MSCs克隆形成能力檢測

LR-MSCs的第3、6、9代都可以以較低的濃度形成單克隆群(圖3)。荷斯坦牛LR-MSCs第3、6、9代的克隆率分別為(39.4±6.5)%、(34.9±2.6)%、(27.3±4.9)%,隨傳代次數(shù)增加,其克隆形成率呈下降趨勢。利用 SPSS軟件對其進行了計算,結(jié)果顯示,在第3、6、9代LR-MSCs的克隆形成率存在著明顯的差異(表2)。

A～C．荷斯坦牛LR-MSCs在第3、6、9代(P3．P6．P9)中克隆團簇形態(tài)A-C．Holstein cattle LR-MSCs exhibit cloned cluster morphology in the 3rd．6th．a(chǎn)nd 9th passages (P3．P6．P9)

A～W．組織塊貼壁法第0～22代細胞形態(tài)A～W．Cell morphology of generations 0 to 22 by the tissue block attachment method 圖1 荷斯坦牛 LR-MSCs 形態(tài)Fig.1 The morphology of Holstein cattle LR-MSCs

表2 LR-MSCs的克隆形成率

2.4 核型分析

第9代LR-MSCs的染色體數(shù)為2n=60,包含一對 XY性染色體。結(jié)果顯示,LR-MSCs在體外培養(yǎng)過程中,其染色體形態(tài)和數(shù)量均未發(fā)生異常變化(圖4)。

A． 染色體核型形態(tài);B．染色體核型配對A.Karyotypic analysis;B.Chromosome karyotype pairing analysis

2.5 免疫熒光表型分析

在第7代LR-MSCs中檢測到CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166的表達;顯示全部為陽性(圖5)。

2.6 多能性相關(guān)基因表達鑒定

用Primer Premier5．0軟件設(shè)計CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166、CD34的擴增引物;以GAPDH作為內(nèi)參考基因,用CD45標(biāo)記基因擴增引物,檢測到 MSC的特異標(biāo)志基因CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166均為陽性。CD34和CD45在MSC特異標(biāo)志基因中的表達呈陰性(圖6)。

2.7 LR-MSCs多向分化能力鑒定

2.7.1 成脂誘導(dǎo)分化能力鑒定 在誘導(dǎo)成脂6 d后,用RT-PCR方法對其進行了檢測,結(jié)果顯示,在誘導(dǎo)成脂6 d后,油紅 O染色可見大量的桔紅色油珠。LR-MSCs成脂分化過程中,其高表達LPL及PPAR-γ(圖7)。

A．對照組,未用油紅-O染色。B．誘導(dǎo)組,用油紅-O染色。C.M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.GAPDH;2.試驗組 LPL;3.試驗組 PPAP-γ;4．對照組LPL;5.對照組PPAP-γA．Control group without Oil Red O staining．B．Induction group with Oil Red O staining．C.M. DNA marker; 1.GAPDH; 2.Experimental group LPL; 3.Experimental group PPAP-γ; 4．Control group LPL; 5.Control group PPAP-γ

2.7.2 成軟骨誘導(dǎo)分化能力的鑒定 經(jīng)阿利新蘭染色,15 d后,誘導(dǎo)組小鼠軟骨結(jié)節(jié)呈現(xiàn)出明顯的青色,其中以酸性粘多糖為主;RT-PCR結(jié)果顯示,ACAN與SOX9在LR-MSCs中均有表達(圖8)。

A．染色前。B．阿利新藍染色后。C.M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.GAPDH;2.試驗組Collagen typeⅠ;3.試驗組 ACAN;4.試驗組 SOX9A．Before staining．B．After Alcian blue staining．C.M. DNA marker; 1.GAPDH; 2.Experimental group Collagen type Ⅰ; 3.Experimental group ACAN; 4.Experimental group SOX9

2.7.3 成骨誘導(dǎo)分化能力的鑒定 在15 d的成骨誘導(dǎo)之后,進行茜素紅染色,在誘導(dǎo)之后,能看見沉積的鈣鹽變?yōu)榧t色。RT-PCR分析顯示,LR-MSCs在成骨分化后,其組織中有Ⅰ型膠原蛋白(Collagetype I)和骨橋蛋白(Osteopontin)基因表達(圖9)。

A．未染色前。B．茜素紅染色后。C.M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.GAPDH;2.試驗組Osteopontin;3.試驗組 Collagen typeⅠ;4.對照組 Osteopontin;5.對照組 Collagen typeⅠA．Before staining．B．After Sirius red staining．C.M. DNA marker; 1.GAPDH; 2.Experimental group Osteopontin; 3.Experimental group Collagen type I; 4.Control group Osteopontin; 5.Control group Collagen type I

3 討 論

肺間充質(zhì)干細胞(LR-MSCs)是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細胞,可有效的修復(fù)組織損傷,并可有效的抑制炎癥反應(yīng)。因此,尋找來自于同一組織或同一部位的干細胞有可能為臨床應(yīng)用提供新的思路[14-18]。 LR-MSCs除用于肺部疾病外,LR-MSCs與 MSCs的體外分化及免疫調(diào)控功能在移植機體中同樣有很好的應(yīng)用前景[19-21]。 通過貼壁法可從荷斯坦牛胚胎中獲得生長狀態(tài)良好的LR-MSCs,細胞形態(tài)為長梭形且傳代時間一致。隨著傳代次數(shù)的增加群體倍增時間逐漸增加,克隆形成率逐漸降低。說明隨著細胞傳代次數(shù)的增加細胞逐漸衰老。二倍體核型和穩(wěn)定的染色體數(shù)目、形狀和結(jié)構(gòu)是細胞生長和功能的先決條件。核型分析是區(qū)分正常細胞和變異細胞的一種簡單實用的方法。荷斯坦牛有30對染色體,包括性染色體X和Y。本研究培養(yǎng)的荷斯坦牛LR-MSCs均為正常二倍體(2 n=60,XY)。這些發(fā)現(xiàn)可能對理解染色體融合的分子機制、基因進化具有重要意義[22-26]。

荷斯坦牛LR-MSCs的鑒定主要依據(jù)是CD29、CD44、CD73、CD90等特異性標(biāo)志物。CD44是細胞膜上的一種糖蛋白,在細胞間相互作用、遷移、粘附、活化、循環(huán)、歸巢等方面起著重要作用[27-29]。CD73是一種以糖類磷脂酰肌醇(GPI)為核心的蛋白,其與細胞膜的結(jié)合是CD73的重要功能。CD106和VCAM-1是由細胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種膜蛋白,可介導(dǎo)細胞間的粘附[30-33]。目前,MSCs的鑒定主要依據(jù)是細胞形態(tài)、生長特性和多種免疫表型,而 MSCs的多向分化能力則是 MSCs鑒定的重要依據(jù)。細胞在體外能分化為骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等[34-36]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),魯西黃牛LR-MSCs具有向成骨、成脂兩種分化能力。在此基礎(chǔ)上,利用荷斯坦牛LR-MSCs向中胚層骨、脂肪和軟骨細胞定向分化,并在細胞水平上對LR-MSCs定向分化能力進行初步驗證。前期研究發(fā)現(xiàn),成骨細胞標(biāo)志基因(如CollagetypeI、OPN等)與脂肪細胞標(biāo)志基因(如LPL、PPAR-γ等)密切相關(guān),但其分子機制尚不清楚。其中,ACAN、SOX9是主要的軟骨細胞標(biāo)志基因。蛋白質(zhì)聚糖(protein polygonuclein．ACAN)是 ECM的重要組分。SOX9作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,可通過時序特異性地調(diào)節(jié)一系列下游基因,從而影響軟骨分化過程[37]。本試驗結(jié)果表明,對于成骨、成軟骨細胞的分化,其融合率應(yīng)該在50%左右,而對于成脂肪細胞的分化,則應(yīng)該在80%左右。這一現(xiàn)象的發(fā)生,主要原因是在脂肪組織的成脂過程中,細胞停止了增殖,開始了細胞的凋亡。此外,對LR-MSCs的體內(nèi)特征(生物分布、生物利用率,靶向性等)進行了探討。藥動學(xué)等和它們的用途(給藥途徑、給藥劑量、給藥時間間隔;藥效評價等)尚需深入研究。近年來,人們在皮膚、脂肪、肌肉等非血液系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了一種具有組織特征的干細胞。近50年來,LR-MSCs在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注[38]。充質(zhì)干細胞(LR-MSCs)是一種具有高度特異性的干細胞,在組織修復(fù)與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義,是當(dāng)前組織修復(fù)與再生領(lǐng)域的熱點。但是,目前還未見荷斯坦牛肺臟組織來源的LR-MSCs的相關(guān)研究。為此,本研究從荷斯坦牛的肺臟細胞中分離出了LR-MSCs,并分析了LR-MSCs的生物學(xué)特征;本研究將為肺臟成體干細胞的體外培養(yǎng)和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[39]。

LR-MSCs的組織培養(yǎng)、 exosomes的提取、制備、篩選適宜的培養(yǎng)基及誘導(dǎo)因素是LR-MSCs組織修復(fù)的關(guān)鍵。另外,LR-MSCs的組織及 exosomes的保存、轉(zhuǎn)運及存儲也是LR-MSCs研究的重點。用于臨床的細胞組織制品,其安全及不良反應(yīng)均需密切監(jiān)控。雖然存在著上述問題,但以LR-MSCs為基礎(chǔ)的組織工程技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域仍具有廣闊的應(yīng)用前景[40]。

4 結(jié) 論

本課題組前期已從荷斯坦牛胎牛肺中獲得了LR-MSCs,其體外培養(yǎng)的LR-MSCs具有很強的自我更新能力,且具有很好的體外培養(yǎng)條件。荷斯坦牛LR-MSCs可表達與 MSCs有關(guān)的表面標(biāo)志基因,如CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166;而CD34、CD45不表達;荷斯坦牛LR-MSCs具有向成脂、成骨和成軟骨分化的能力,這將可能成為一種新型的組織工程種子細胞。牛肺間充質(zhì)干細胞(LR-MSCs)具有自我更新、多向分化和免疫調(diào)節(jié)等特性,是當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。同時,合適的低氧預(yù)處理、物理刺激、基因修飾、可降解載體等也能有效提高LR-MSCs的組織修復(fù)能力。同時,LR-MSCs及 exosomes可作為一種自然載體,實現(xiàn)對生物活性物質(zhì)及藥物的靶向遞送。牛肺間充質(zhì)干細胞(LR-MSCs)不僅具有多向分化潛能,而且可分泌多種組織因子,具有調(diào)控機體免疫、促造血等作用。由于LR-MSCs特有的生物學(xué)性質(zhì),使LR-MSCs在組織治療、基因治療及組織工程化等領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。