半胱氨酸、蛋氨酸對體外培養(yǎng)絨山羊次級毛囊生長及毛乳頭細胞增殖的影響

康 佳,段香茹,尹雪姣,楊若晨,李太春,單新雨,陳美靜,張英杰,劉月琴

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,保定 071000)

燕山絨山羊是一種產(chǎn)絨量高、絨細且肉質(zhì)較好的絨肉兼用型山羊,具有經(jīng)濟價值高等優(yōu)異品質(zhì)。山羊絨是絨山羊皮膚次級毛囊產(chǎn)生的一種珍貴的動物纖維,主要用于生產(chǎn)高檔紡織品,具有極高的創(chuàng)匯能力[1]。次級毛囊是影響絨山羊羊絨產(chǎn)量和質(zhì)量的主要因素[2],毛乳頭細胞(DPCs)是早期毛囊形態(tài)變化時,由真皮層接受表皮層發(fā)出的傳導(dǎo)信號而凝集成的一種特殊成纖維細胞,能夠分泌多種生長調(diào)控因子,從而調(diào)節(jié)毛囊干細胞活性、毛囊角質(zhì)化細胞的增殖分化以及毛囊生長發(fā)育[3]。并且DPCs可在一定程度上影響毛囊的大小和粗細[4-6]。因此,研究絨山羊次級毛囊和毛乳頭細胞發(fā)育情況,對羊絨的生產(chǎn)至關(guān)重要。

半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)是在絨毛生長過程中重要的含硫氨基酸[7],是影響毛囊基因表達和發(fā)育的重要因素。Cys是一種天然氨基酸,常溫下呈白色結(jié)晶粉末,在許多生物學(xué)途徑發(fā)揮作用,它可以形成二硫鍵,最初發(fā)現(xiàn)于動物的毛發(fā)和結(jié)締組織中,是角蛋白的重要組成部分,在羊毛氨基酸中占據(jù)重要地位[8]。Met作為必需氨基酸中唯一的含硫氨基酸,在生物體內(nèi)既參與蛋白質(zhì)合成,又可以經(jīng)轉(zhuǎn)硫基作用生成半胱氨酸,對毛皮動物角蛋白合成具有重要的調(diào)控作用[9]。董曉玲[10]研究表明,Cys和Met作為內(nèi)蒙古絨山羊的限制性氨基酸,對絨毛生長量、絨毛細度和絨毛品質(zhì)具有重要的作用。王文楠[11]研究發(fā)現(xiàn),含硫氨基酸對絨毛的品質(zhì)起著關(guān)鍵性的作用。綿羊體內(nèi)含硫氨基酸含量會影響毛囊的生長發(fā)育,缺少含硫氨基酸會大幅度限制綿羊羊毛生長[12-13]。南韋肖[14]通過體外培養(yǎng)水貂毛乳頭細胞,發(fā)現(xiàn)8 μg·mL-1Met顯著促進DPCs增殖,間接調(diào)控毛發(fā)生長。但含硫氨基酸Cys和Met對于絨山羊羊毛生長的影響還有待研究,在絨山羊的適宜添加量還尚不清楚。

目前,絨毛生長過程中的限制性含硫氨基酸Cys和Met,對于絨山羊絨毛生長及DPCs增殖凋亡的影響報道較少。體外探究Cys和Met對次級毛囊生長以及毛乳頭細胞增殖的影響可以為提高燕山絨山羊產(chǎn)絨量提供良好的研究模型。因此,本試驗旨在探究體外添加Cys和Met對絨山羊次級毛囊形態(tài)、生長以及DPCs增殖凋亡的影響,為進一步探究Cys和Met對絨山羊羊絨生長及營養(yǎng)調(diào)控作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取1只1周歲左右健康雄性燕山絨山羊于9月份絨毛生長期采集山羊肩胛骨后緣皮膚組織。采集時剪去選定部位羊毛,使用碘伏進行消毒,試驗羊注射0.5 mL麻醉劑(procaine),用活體皮膚取樣器采取肩胛骨皮膚組織1 cm2若干,立即放入75%乙醇浸泡30～40 s,用PBS(含6%雙抗)反復(fù)清洗3遍至表皮無血,放入DMEM/F12(含6%雙抗)帶回實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 次級毛囊與DPCs體外分離培養(yǎng) 將帶回實驗室的皮膚組織用75%乙醇浸泡1 min,PBS快速清洗6次,去除脂肪和結(jié)締組織,PBS漂洗,切成1 mm2的組織小塊,超精密鑷子剝離毛囊,放入含有完全培養(yǎng)基、不同濃度Cys和Met工作培養(yǎng)基的24孔板中,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)。

將1 mm2組織小塊于0.25%中性蛋白酶37 ℃孵育2～4 h,體式顯微鏡下剝離真皮層和皮下層,輕輕拔出毛囊,放入1.5 mL離心管(含1 mL完全培養(yǎng)基),1 500 r·min-1離心5 min,棄廢液,400 μL IV型膠原酶37 ℃ 15 min,加三倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化,1 500 r·min-15 min,棄上清,PBS混勻,500 r·min-1離心5 min,棄上清,PBS再次混勻,800 r·min-1離心5 min,棄上清液,加1 mL完全培養(yǎng)基,混勻,過200目細胞篩接種到25 cm2培養(yǎng)瓶,加3 mL完全培養(yǎng)基,37 ℃,5% CO2培養(yǎng),每隔3 d換一次完全培養(yǎng)基。

純化DPCs,PBS清洗2次,每次2 mL,4 mL 0.25%胰蛋白酶消化3 min,4 mL 2 mg·mL-1的膠原酶D 20 min,接種于培養(yǎng)瓶,37 ℃孵育約2 h,棄去未貼壁細胞,已貼壁的細胞即為DPCs。

1.2.2 次級毛囊生長與生長速度檢測 將分離出來的毛囊隨機分成Cys試驗組和Met試驗組,每組各濃度3個重復(fù),每個重復(fù)8根毛囊,Cys試驗組添加濃度分別為0、40、80、120、160和200 μg·mL-1;Met試驗組添加濃度分別為0、10、15、20、25和30 μg·mL-1。每隔24 h在倒置顯微鏡下拍攝照片,觀察毛囊結(jié)構(gòu)形態(tài)變化,利用Image JV1.8.0軟件測量次級毛囊生長長度并計算生長速度。

每日生長長度(μm)=測量當(dāng)天長度-測量前一天長度;

生長速度(μm·d-1)=(結(jié)束長度-起始長度)/7 d;

累計生長長度(μm)=測量7 d長度-測量0 d長度。

1.2.3 細胞計數(shù)及生長曲線 收集狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的第5代DPCs細胞,0.25%胰酶消化重懸,細胞計數(shù)板計數(shù),以每孔0.5×104個細胞數(shù)均勻接種到24孔板,每隔24 h對3個孔細胞進行多次計數(shù)并計算平均值,共記錄10 d細胞數(shù)。

在細胞計數(shù)板中間放置細胞專用蓋玻片,將細胞懸液稀釋至適當(dāng)濃度混勻,取10 μL細胞懸液緩慢滴入蓋玻片,使其充滿蓋玻片與計數(shù)板之間的空隙,利用顯微鏡觀察并計數(shù),計數(shù)時只記錄完整細胞并記錄計數(shù)板4個角細胞總數(shù),細胞團按一個細胞計數(shù),同一方格中位于線上細胞,記錄上線和左線,不計下線和右線。

細胞數(shù)/L=(計數(shù)板4個角細胞總數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)。

1.2.4 DPCs細胞活性 選取第5代對數(shù)生長期DPCs細胞,0.25%胰酶消化重懸,細胞計數(shù)板計數(shù),以每孔1×104個細胞漿細胞均勻接種到96孔板中,每孔加100 μL細胞懸液,置37 ℃、5% CO2箱培養(yǎng)使細胞貼壁,培養(yǎng)2 h,待細胞生長匯合至70%～80%左右,分別加入10 μL不同濃度Cys工作培養(yǎng)基(0、20、40、60、80和100 μg·mL-1)和Met工作培養(yǎng)基(0、2、4、6、8和10 μg·mL-1),其中0為對照組,每組4個復(fù)孔,將96孔板放入培養(yǎng)箱孵育2 h(預(yù)試驗獲得最佳處理時間為2 h);棄上清,每孔加入100 mL完全培養(yǎng)基與10 μL CCK-8試劑,在37 ℃、5% CO2箱培養(yǎng)2.5 h,用酶標儀檢測450 nm時吸光度。

細胞活性/%=(A試驗孔450-A空白450)/(A對照孔450-A空白孔450);

A(試驗孔)為具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的OD值;A(對照孔)為具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的OD值;A(空白孔)為具有CCK-8溶液,沒有細胞和藥物溶液的孔的OD值。

1.2.5 不同濃度Cys和Met對毛乳頭增殖凋亡相關(guān)基因mRNA表達的影響 DPCs以1.5×105個·mL-1密度接種于6孔板,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至75%～85%時,棄去舊培養(yǎng)液,加入2 mL不同濃度Cys工作培養(yǎng)基(0、20、40、60、80和100 μg·mL-1)和Met工作培養(yǎng)基(0、2、4、6、8和10 μg·mL-1)處理細胞2 h,按照RNAisoTM Plus 提取試劑盒提取總RNA,采用RT-PCR技術(shù)測定基因表達水平,引物序列見表1,以山羊GAPDH作為內(nèi)參基因,使用2-ΔΔCT法對以下目的基因的mRNA表達量進行相對定量數(shù)據(jù)分析,細胞增殖相關(guān)基因PCNA、CCND1、CDC42、CDK4;細胞凋亡相關(guān)基因P53、P21、BAX、Bcl-2、Caspase-3;角蛋白相關(guān)基因K10、K14;皮膚細胞分化標記相關(guān)基因IVL。

表1 引物序列

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 所有數(shù)據(jù)用 Excel 歸納整理后,采用SPSS軟件進行單因素方差統(tǒng)計學(xué)分析(ver. 22.0, IBM Corp.),差異顯著性采用LSD法進行多重比較。結(jié)果用“平均值±標準誤”表示。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 添加Cys與Met對次級毛囊生長形態(tài)的影響

添加Cys與Met對次級毛囊生長形態(tài)的影響見圖1。對照組(圖1A)、20 μg·mL-1Met(圖1B)和120 μg·mL-1Cys(圖1C)在體外培養(yǎng)下,毛球部形態(tài)均有不同變化。對照組培養(yǎng)至第4天(圖1D),毛球部形態(tài)發(fā)生變化,呈不規(guī)則狀,外層真皮鞘上皮細胞結(jié)構(gòu)松散模糊,毛囊生長速度逐漸變得緩慢;培養(yǎng)至第7天(圖1G),毛球部逐漸萎縮,毛乳頭與毛母質(zhì)界限逐漸模糊,此時毛囊逐漸停止生長。20 μg·mL-1Met次級毛囊體外培養(yǎng)至第4天(圖1E),毛球部形態(tài)保持較好,毛囊DPCs分裂增殖,促進內(nèi)外根鞘和毛干生長,此時毛囊生長速度逐漸變緩,但仍高于對照組,毛母質(zhì)與毛乳頭界限仍分明可見;培養(yǎng)至第7天(圖1H),毛球部與內(nèi)部結(jié)構(gòu)層次界限模糊,毛母質(zhì)與毛乳頭之間模糊,但毛乳頭輪廓仍清晰可見。120 μg·mL-1Cys次級毛囊體外培養(yǎng)第4天時毛囊形態(tài)未發(fā)生變化(圖1F),內(nèi)外根鞘模糊不清,毛球部保存較好,生長速度高于對照組;培養(yǎng)至第7天(圖1I),毛囊形態(tài)發(fā)生變化,內(nèi)外根鞘模糊不清,毛球部逐漸萎縮,且松散模糊,此時毛囊生長速度逐漸與對照組趨于一致。

A、D、G分別為對照組第1、4、7天;B、E、H分別為20 μg·mL-1 Met組第1、4、7天;C、F、I分別為120 μg·mL-1 Cys組第1、4、7天A, D, G are day 1,4, and 7 of the control group, respectively; B, E, H are day 1,4, and 7 for 20 μg·mL-1 Met group, respectively; C, F, I are day 1,4, and 7 for 120 μg·mL-1 Cys group, respectively

2.2 不同濃度Cys對次級毛囊體外生長的影響

由圖2和表2可知,添加80、120 μg·mL-1Cys具有促進毛囊生長的效果,隨著濃度增加,促生長效果越明顯,且120 μg·mL-1Cys對次級毛囊體外生長具有極顯著影響(P<0.01),與對照組相比,7 d后累計生長長度與生長速度分別達到了64.81 μm和9.26 μm·d-1;80 μg·mL-1Cys對毛囊體外生長影響顯著(P<0.05),與對照組相比,7 d后累計生長長度與生長速度分別達到了62.77 μm和8.97 μm·d-1;40、160、200 μg·mL-1Cys培養(yǎng)7 d后累計生長長度和生長速率與對照組差異不顯著(P> 0.05),因此,120 μg·mL-1Cys對次級毛囊體外生長效果最好。

“#”、“*”分別表示80、120 μg·mL-1 Cys組與對照組相比差異顯著(P<0.05)“#”and“*” indicate that 80 and 120 μg·mL-1 Cys groups are significantly different from the control group (P<0.05)

表2 不同Cys濃度對絨山羊次級毛囊體外生長的影響

2.3 不同濃度Met對次級毛囊體外生長的影響

由圖3和表3可知,添加Met對絨山羊次級毛囊體外生長具有促進作用,隨著濃度增加,促生長效果越明顯。添加10、15、20、25 μg·mL-1Met組次級毛囊累計生長長度和生長速度均極顯著高于對照組(P<0.01),其中20 μg·mL-1Met組次級毛囊體外生長效果最好,7 d后累計長度和生長速度達到了103.12 μm和14.59 μm·d-1;30 μg·mL-1Met 7 d后累計生長長度和生長速率與對照組相比差異不顯著(P>0.05),因此,20 μg·mL-1Met對次級毛囊體外生長效果最好。

“★”、“#”、“*”、“&”分別表示10、15、20、25 μg·mL-1 Met組與對照組相比差異顯著(P<0.05)“★”、“#”、“*”and“&” indicate that 10, 15, 20 and 25 μg·mL-1 Met groups are significantly different from the control group (P<0.05)

表3 不同Met濃度對絨山羊次級毛囊體外生長的影響

2.4 DPCs分離培養(yǎng)及生長曲線

分離出單個毛囊,其結(jié)構(gòu)完整,DPCs清晰可見(圖4A),分離出的DPCs培養(yǎng)至第5天有DPCs遷出,DPCs呈梭形或者梨形(圖4B);在培養(yǎng)至第10天可明顯看到DPCs遷出,細胞逐漸從毛乳頭向外遷出(圖4C),呈放射狀增長,培養(yǎng)至第20天左右,培養(yǎng)瓶中有大量DPCs(圖4D)。隨著DPCs不斷向外增殖,細胞凝集成毛乳頭狀形態(tài)(圖4E),距生長中心越近的位置DPCs較小,細胞聚集的數(shù)量越多,呈現(xiàn)出多層聚集特征。由中心向外細胞間距逐漸增大,細胞則會顯著變大,細胞逐漸由開始的三角形變?yōu)殚L梭形,形態(tài)與成纖維細胞相似。純化后將DPCs培養(yǎng)至第3代(圖4F)、第5代(圖4G)時,仍能觀察到其細胞形態(tài),并能正常生長、增殖。

A為毛囊毛球內(nèi)部DPCs;B、C、D、E分別為DPCs第5、10、20、22天;F、G分別為DPCs第3、第5代A shows the internal DPCs in the hair follicle bulb; B, C, D, E are day 5,10,20 and 22 of DPCs, respectively; F, G are the generation 3 and 5 of DPCs, respectively

圖5為DPCs生長曲線,由圖中可以看出,DPCs的生長過程可以分為幾個階段,第1天左右,細胞逐漸貼壁;到第2天,細胞開始緩慢增殖;而2～5天,細胞增殖速度逐漸加快;第6天,細胞進入快速增殖時期,呈現(xiàn)出對數(shù)增長;在第9天,細胞進入了平穩(wěn)期,此時細胞的增殖速度開始減緩,并逐漸進入衰退期。絨山羊DPCs的生長曲線呈現(xiàn)出典型的 “S” 型,符合細胞生長曲線形態(tài)。

圖5 DPCs生長曲線Fig.5 Growth curve of DPCs

2.5 添加不同濃度Cys、Met對DPCs增殖的影響

由圖6A可見,培養(yǎng)DPCs 2 h,細胞增殖活性隨著Cys濃度增高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,其中,添加40 μg·mL-1Cys組細胞增殖活性顯著高于對照組和其它濃度組(P<0.05),添加20 μg·mL-1Cys組顯著高于對照組、80和100 μg·mL-1Cys組(P<0.05),但與添加60 μg·mL-1Cys組差異不顯著(P>0.05)。80、100 μg·mL-1Cys組與對照組差異不顯著(P>0.05)。說明添加40 μg·mL-1Cys培養(yǎng)細胞2 h細胞增殖活性最高。

數(shù)據(jù)柱標注相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),數(shù)據(jù)柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)The same lowercase letter on columns indicate no significant difference (P>0.05), different lowercase letters on columns indicate the significant difference (P<0.05)

2.6 添加不同濃度Cys對毛乳頭細胞增殖分化相關(guān)基因mRNA表達量的影響

由表4可知,隨著Cys濃度升高,PCNA、CCND1、CDK4、Bcl-2、mRNA表達量呈先上升后下降的趨勢;基因CDC42、P21、P53、Bax、Caspase-3等基因mRNA表達量呈先下降后上升的趨勢;K10、K14、IVL等基因mRNA表達量呈逐漸上升趨勢。與對照組相比,不同濃度Cys組DPCs增殖分化及相關(guān)基因PCNA、CCND1、CDC42、CDK4、P53、P21、Bax、Bcl-2、Caspase-3、K10、K14、IVLmRNA的表達量差異顯著(P<0.05);添加40 μg·mL-1Cys,顯著上調(diào)PCNA、CCND1、CDK4、Bcl-2、K14、IVL等基因mRNA表達量,顯著下調(diào)CDC42、P21、P53、Bax、Caspase-3等基因mRNA表達量,與細胞增殖活力檢測的結(jié)果一致,表明40 μg·mL-1Cys通過調(diào)節(jié)PCNA、CCND1、CDC42、CDK4、P53、P21、Bax、Bcl-2、Caspase-3、K10、K14、IVL等基因的表達來促進細胞增殖抑制細胞凋亡。

表4 不同濃度Cys對毛乳頭細胞增殖分化相關(guān)基因mRNA表達量的影響

2.7 添加不同濃度Met對毛乳頭細胞增殖分化相關(guān)基因mRNA表達量的影響

由表5可知,隨著Met濃度升高,PCNA、CCND1、CDK4、P21、Bcl-2、K10、IVLmRNA表達量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢;Bax、Caspase-3等基因mRNA表達量呈先下降后上升趨勢;K14、P53等基因mRNA表達量呈逐漸上升趨勢。與對照組相比,不同濃度Met組DPCs增殖分化及相關(guān)基因PCNA、CCND1、CDC42、CDK4、P21、Bax、Bcl-2、Caspase-3、K10、K14、IVLmRNA的表達量差異顯著(P<0.05);添加6 μg·mL-1Met,顯著上調(diào)PCNA、CCND1、CDK4、P21、Bcl-2、K10、K14等基因mRNA表達量,顯著下調(diào)Bax、Caspase-3等基因mRNA表達量,與細胞增殖活力檢測的結(jié)果一致,表明6 μg·mL-1Met通過調(diào)節(jié)PCNA、CCND1、CDC42、CDK4、P21、Bax、Bcl-2、Caspase-3、K10、K14、IVL等基因的表達來促進細胞增殖抑制細胞凋亡。

表5 不同濃度Met對毛乳頭細胞增殖分化相關(guān)基因mRNA表達量的影響

3 討 論

3.1 添加Cys、Met對體外培養(yǎng)絨山羊次級毛囊的影響

毛囊作為絨山羊的皮膚附屬器官,控制著羊絨的生長與品質(zhì),具有獨特且復(fù)雜的結(jié)構(gòu)形態(tài)[15]和周期性生長的特點[16]。在絨山羊毛囊生長期,毛囊由真皮層向下發(fā)育,其內(nèi)部間質(zhì)細胞起到信號調(diào)節(jié)作用,在這個過程中DPCs起到核心作用[17-18]。本試驗采用機械分離法[19]和酶消化法[20]提取絨山羊次級毛囊,成功分離純化出毛乳頭細胞,此方法可以保留次級毛囊完整性,且分離速度較快。在分離毛囊時發(fā)現(xiàn)毛囊位于絨山羊皮膚真皮層,包含初級毛囊與次級毛囊,通過毛囊形態(tài)較易區(qū)分。本試驗中次級毛囊生長速度(7.64 μm·d-1)高于遼寧絨山羊(4.53 μm·d-1)[21],低于蘇格蘭絨山羊(10.62 μm·d-1)[22]。次級毛囊生長狀態(tài)和生長速度的差異可能與絨山羊品種有關(guān)[23],同品種絨山羊也會受到年齡、性別、自身營養(yǎng)條件以及周圍環(huán)境等諸多因素影響[24]。

Cys和Met是重要的含硫氨基酸,缺乏Cys和Met會影響絨山羊毛囊生長發(fā)育以及絨毛纖維品質(zhì)。Galbraith[25]通過體外培養(yǎng)次級毛囊發(fā)現(xiàn),添加Met使羊絨纖維產(chǎn)量和直徑均得到提高,表明蛋氨酸有助于體外培養(yǎng)次級毛囊以及絨毛纖維的生長發(fā)育。宋玲玲[26]研究發(fā)現(xiàn),日糧中單獨添加或同時添加過瘤胃半胱氨酸與過瘤胃蛋氨酸均可顯著提高遼寧絨山羊次級毛囊活性、毛囊密度和羊絨品質(zhì)。本試驗結(jié)果表明,培養(yǎng)基中添加Cys(120 μg·mL-1)和Met(20 μg·mL-1)均顯著促進次級毛囊生長,所有添加Met組毛囊生長長度均高于Cys組和對照組;與對照組相比,添加Cys和Met可更長時間維持次級毛囊毛球部完整性,增加毛囊累計生長長度。這與Souri等[27]在體外培養(yǎng)絨山羊次級毛囊時添加不同濃度Met和Cys能夠促進毛干伸長和增加毛囊活力的研究結(jié)果一致。因此體外培養(yǎng)次級毛囊時,添加Cys和Met可以提高次級毛囊的活性和生長長度。

3.2 添加Cys、Met對DPCs增殖的影響

次級毛囊毛球部含有大量增殖和未分化的細胞,包括毛囊干細胞、內(nèi)(外)根鞘細胞、成纖維細胞等[28]。本試驗研究發(fā)現(xiàn),細胞增殖活性隨著Met添加濃度的增加呈先上升后下降的趨勢,與張婧婧[29]對內(nèi)根鞘細胞增殖活性的研究結(jié)果趨勢基本一致。謝貝[30]研究表明,在一定條件下能夠誘導(dǎo)成纖維細胞向毛乳頭細胞轉(zhuǎn)化,進而促進毛囊生長發(fā)育。李萌萌[31]研究表明,不同濃度Cys對成纖維細胞增殖活性有促進作用,且隨著Cys濃度增加,成纖維細胞的增殖活性呈現(xiàn)出上升趨勢,而本試驗中,添加不同濃度Cys后DPCs增殖活性呈先上升后下降的趨勢,可能是由于細胞類型及添加濃度不同;另外,該試驗單獨添加不同濃度Met,成纖維細胞增殖活性呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢,與本試驗添加不同濃度Met對DPCs增殖率結(jié)果趨勢一致。本試驗結(jié)果表明,在培養(yǎng)基中添加40 μg·mL-1Cys、6 μg·mL-1Met可以提高DPCs細胞活力、抑制細胞凋亡;添加120 μg·mL-1Cys和20 μg·mL-1Met可促進次級毛囊生長。次級毛囊與DPCs細胞添加Cys與Met的最適濃度不同,可能是由于次級毛囊與DPCs接受Cys、Met兩種氨基酸的能力不同。

3.3 添加Cys、Met對DPCs增殖、分化及相關(guān)基因mRNA表達量的影響

PCNA在DNA復(fù)制過程中充當(dāng)DNA聚合酶活動的夾子,在細胞增殖中發(fā)揮著重要的作用,可作為細胞增殖的標記物。宗波[32]的研究表明,在初級毛囊DPCs添加褪黑素提高PCNAmRNA表達量;CCND1和CDK4是細胞周期調(diào)控機制的重要組成部分[33],且CCND1-CDK4復(fù)合物水平的升高會促進細胞增殖,縮短細胞增殖周期[34]。P53可誘導(dǎo)CCND1和CDK4抑制劑P21的可變表達,而P21可調(diào)節(jié)正常細胞增殖和加速衰老細胞凋亡并能夠與CCND1和CDK4結(jié)合,對CCND1-CDK4活性進行抑制[35]。本試驗與前人研究結(jié)果一致,添加6 μg·mL-1Met顯著上調(diào)PCNA、CCND1、CDK4、P21基因mRNA表達量,添加40 μg·mL-1Cys顯著上調(diào)PCNA、CCND1、CDK4基因mRNA表達量,表明添加Cys、Met可以通過上調(diào)細胞增殖相關(guān)基因促進DPCs維持穩(wěn)定的細胞增殖周期并避免異常增殖。CDC42作為細胞信號傳導(dǎo)因子,在成纖維細胞和上皮細胞形狀變化中具有調(diào)節(jié)功能[36]。本試驗中,添加Met對CDC42基因mRNA表達量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,添加Cys對CDC42基因mRNA表達量呈現(xiàn)出先下降后升高的趨勢,這表明添加Cys、Met能通過調(diào)控CDC42基因表達量來調(diào)節(jié)DPCs細胞形態(tài)變化。

Bcl-2與Bax共屬于Bcl-2家族,通過控制線粒體膜的通透性來調(diào)節(jié)凋亡激活物[37]。而caspase-3屬于半胱天冬酶家族,在caspase通路中具有執(zhí)行凋亡的功能[38-39],Bcl-2和Bax是caspase-3的上游信號[40],本試驗中分別添加40 μg·mL-1Cys、6 μg·mL-1Met均顯著上調(diào)Bcl-2基因mRNA表達量,顯著下調(diào)Bax、Caspase-3基因mRNA表達量;Bcl-2水平的升高和Bax的降低表明DPCs抗凋亡作用增強,而caspase-3基因mRNA表達量下降,說明添加Cys、Met可能依賴caspase通路中caspase-3來控制DPCs凋亡。K10、K14屬于KRT角蛋白基因家族,可作為毛囊的標志物,K10存在于角質(zhì)化的終端角質(zhì)細胞中,K14主要存在于表皮基底層的DPCs區(qū)域中,K10與K14起到維持DPCs結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并參與維持毛囊的結(jié)構(gòu)和功能[41]。Fratini等[42]的研究表明,靜脈注射半胱氨酸或蛋氨酸,Cys的角蛋白及相關(guān)蛋白的mRNA表達量增加,與本研究結(jié)果一致,本試驗中分別添加Cys及Met均顯著上調(diào)角蛋白相關(guān)基因K10、K14 mRNA的表達量,說明添加Cys、Met能夠促進角蛋白合成。Ma等[43]構(gòu)建體外細胞模型,發(fā)現(xiàn)上調(diào)IVL基因的表達,可促進DPCs持續(xù)增殖和分化,導(dǎo)致毛囊快速生長,本試驗添加40 μg·mL-1Cys顯著上調(diào)IVL基因mRNA表達,表明添加Cys可促進DPCs持續(xù)增殖分化,進而影響次級毛囊生長。綜上,Cys、Met可能通過調(diào)控毛囊中DPCs細胞增殖來影響次級毛囊生長。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下,添加Cys和Met可以顯著促進長絨期燕山絨山羊次級毛囊生長,最適添加量分別為120 μg·mL-1和20 μg·mL-1;添加Cys和Met可通過上調(diào)細胞增殖、分化、角蛋白等基因mRNA、下調(diào)細胞凋亡基因mRNA表達,促進毛乳頭細胞增殖、抑制細胞凋亡進而促進燕山絨山羊次級毛囊生長。