真武湯對(duì)糖尿病腎病大鼠腎功能、蛋白尿和血液流變學(xué)的影響

戴臨風(fēng) 張煥 陳旭 馮月男 張瑤

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥,也是許多終末期腎病(ESRD)的主要原因。糖尿病腎病的特征是腎小球?yàn)V過率增加, 伴有腎小球內(nèi)高血壓和臨床進(jìn)行性蛋白尿, 隨后最終喪失腎功能。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分［1］, 在糖尿病腎病的腎功能損傷中起著關(guān)鍵作用。足細(xì)胞損傷主要表現(xiàn)為足突回縮、脫落以及足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin 的異常表達(dá), 導(dǎo)致腎小球基底層增厚、系膜擴(kuò)張和腎小球硬化等一系列腎臟結(jié)構(gòu)異常［2］, 高血糖和高血壓的多種干預(yù)措施并不能有效降低或逆轉(zhuǎn)腎病的進(jìn)展, 相當(dāng)一部分糖尿病患者仍患有進(jìn)行性和嚴(yán)重的腎損傷。因此,迫切需要開發(fā)新的、有效的腎臟保護(hù)方法來治療糖尿病腎病。真武湯出自東漢張仲景的《傷寒論》, 是溫陽(yáng)利水的經(jīng)典組方, 由附子、白術(shù)、茯苓、白芍和生姜組成, 目前, 已有研究表明真武湯能有效治療糖尿病腎?。?］, 但是其治療機(jī)制尚不清楚, 本研究使用誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠模型來評(píng)估真武湯對(duì)腎功能和血液流變學(xué)的影響及其潛在的因果機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 24 只6 周雄性的健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(240～280 g), 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物被飼養(yǎng)在溫度23～25℃下, 明暗周期12 h,自由飲食、飲水。本研究根據(jù)中國(guó)科學(xué)技術(shù)部《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》的建議進(jìn)行。

1.2 試劑 真武湯(附子9 g、生姜9 g、茯苓9 g、白術(shù)6 g、白芍9 g)原料由本院中藥房提供, 每種藥品的憑證標(biāo)本存放在黑龍江省醫(yī)院。將生藥用蒸餾水浸泡30 min 后再煎附子30 min, 加入其他藥物煮1 h 并過濾。將過濾后的液體濃縮液儲(chǔ)存于4 ℃下, 使用前用蒸餾水稀釋。檸檬酸三鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán), STZ 購(gòu)自Sigma。

1.3 研究方法 24 只大鼠被分為正常組(8 只)和模型組(16 只), 正常喂養(yǎng)1 周后, 模型組大鼠高脂高糖喂養(yǎng)8 周, 禁食8～12 h 后腹膜內(nèi)注射給予溶于檸檬酸鹽緩沖液(0.1 mol/L, pH=4.5)的STZ 65 mg/kg, 2 周后測(cè)定血糖和尿蛋白, 以血糖＞16.7 mmol/L、24 h 尿蛋白定量＞50 mg 判定為糖尿病腎臟疾病建模成功, 正常組大鼠腹膜內(nèi)注射等體積的檸檬酸鹽緩沖液, 建模成功后將模型組動(dòng)物分為模型對(duì)照組(8 只)和真武湯組(8 只),真武湯組同時(shí)給予5.0 g/(kg·d)、10 ml/kg 的真武湯灌胃給藥, 模型對(duì)照組和正常組給予等體積去離子水灌胃, 連續(xù)喂養(yǎng)16 周。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí), 通過頸椎脫位處死大鼠, 切除腎臟并在測(cè)試前保持在液氮中。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 生化指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)第27 周, 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉, 從股動(dòng)脈抽取血樣, 采用酶聯(lián)免疫法測(cè)量FBG、BUN、Cr, 通過代謝籠單獨(dú)收集大鼠24 h 尿液。采用BCA 蛋白法測(cè)定24 h 尿蛋白定量。

1.4.2 血液流變學(xué)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第27 周, 使用全自動(dòng)血液流變學(xué)檢測(cè)儀(Suceder, SA-5600)對(duì)采集的大鼠血液進(jìn)行血液流變檢測(cè), 包括紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞變形指數(shù)。

1.4.3 nephrin、podocin 表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)第27 周,用Trizol 試劑(Invitrogen) 從SD 大鼠的腎組織中提取總RNA, 定量后, 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 使用熒光定量PCR 試劑盒說明書擴(kuò)增大鼠nephrin、podocin 和組成型表達(dá)的管家基因β-肌動(dòng)蛋白的cDNA, 引物設(shè)計(jì)如下：nephrin：上游AACGGGCATTACTGGTCTG, 下游TTCAGGCCTGGC CAATCAAT；podocin：上游TGACCTGTGTTTGGGGC ATC, 下游CAGCAATCACCCGCACTTTG。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)使用SPSS26.0 進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 多組比較采用方差分析, 兩組比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。P＜ 0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠的生化指標(biāo)比較 實(shí)驗(yàn)第27 周, 三組大鼠的FBG、24 h 尿蛋白定量、BUN、Cr 比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與正常組比較, 模型對(duì)照組及真武湯組的FBG、24 h 尿蛋白定量、BUN、Cr 均明顯升高(P＜0.05)；與模型對(duì)照組比較, 真武湯組的24 h尿蛋白定量、BUN、Cr 均明顯降低(P＜0.05)。見表1。

表1 三組大鼠的生化指標(biāo)比較( ±s)

表1 三組大鼠的生化指標(biāo)比較( ±s)

注：與正常組比較, aP＜0.05；與模型對(duì)照組比較, bP＜0.05

組別只數(shù)FBG(mmol/L)24 h 尿蛋白定量(mg/24 h)BUN(mmol/L)Cr(μmol/L)正常組8 6.42±0.83 5.12±0.76 8.41±0.42104.48±18.72模型對(duì)照組821.24±2.22a27.23±4.10a26.27±1.74a 311.91±19.94a真武湯組820.22±2.19a 10.12±1.87ab 12.94±2.02ab 194.95±17.42ab F 157.917176.558324.570282.119 P 0.0000.0000.0000.000

2.2 三組大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)比較 實(shí)驗(yàn)第27 周,三組大鼠的紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞變形指數(shù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與正常組比較, 模型對(duì)照組及真武湯組的紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均明顯升高, 模型對(duì)照組的紅細(xì)胞變形指數(shù)明顯降低(P＜0.05)；與模型對(duì)照組比較, 真武湯組的紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均明顯降低, 紅細(xì)胞變形指數(shù)明顯升高(P＜0.05)。見表2。

表2 三組大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)比較( x-±s)

2.3 三組大鼠的nephrin、podocin 表達(dá)水平比較 實(shí)驗(yàn)第27 周, 三組大鼠的nephrin、podocin 表達(dá)水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與正常組比較, 模型對(duì)照組及真武湯組的nephrin、podocin 均明顯降低(P＜0.05)；與模型對(duì)照組比較, 真武湯組的nephrin、podocin 均明顯升高(P＜0.05)。見表3。

表3 三組大鼠的nephrin、podocin 表達(dá)水平比較( ±s)

表3 三組大鼠的nephrin、podocin 表達(dá)水平比較( ±s)

注：與正常組比較, aP＜0.05；與模型對(duì)照組比較, bP＜0.05

組別只數(shù)nephrinpodocin正常組81.80±0.091.94±0.08模型對(duì)照組8 1.00±0.07a 0.99±0.05a真武湯組8 1.54±0.06ab 1.61±0.07ab F 275.167462.377 P 0.0000.000

3 討論

糖尿病腎病是一種慢性腎疾病, 主要表現(xiàn)為腎毛細(xì)血管破裂、腎小球毛細(xì)血管和腎小管間質(zhì)損傷［4,5］。高糖高脂飲食與STZ 注射液相結(jié)合, 可引起胰島素抵抗, 并顯著增加血糖水平, 進(jìn)而引發(fā)糖尿病, 進(jìn)而建立成功的糖尿病大鼠模型, 與先前的研究報(bào)告相似［6-8］。糖尿病會(huì)導(dǎo)致大量的高血糖從腎臟排出, 導(dǎo)致腎小球的濾過率增加, 最終導(dǎo)致腎臟功能喪失, 目前, 糖尿病腎病的治療通常集中在胰島素、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素受體阻滯劑上, 但這些方法仍不能有效的降低或逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病患者進(jìn)展為ESRD, 傳統(tǒng)草藥化合物通過多種方式為糖尿病腎病的管理提供了顯著的優(yōu)勢(shì)和實(shí)用性, 并被公認(rèn)為傳統(tǒng)藥物的有效替代品。本研究旨在觀察真武湯對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟功能的影響。

糖尿病腎病屬于“消渴”、“尿濁”、“水腫”、“腎消”等范疇, 其發(fā)病機(jī)制主要是會(huì)增加尿蛋白的排除,從而損害腎臟功能。本研究結(jié)果顯示, 與模型對(duì)照組比較, 真武湯組24 h 尿蛋白定量、BUN、Cr 均明顯下降(P＜0.05), 這說明真武湯可能有效改善糖尿病腎病大鼠腎功能, 改善蛋白代謝紊亂, 分析原因真武湯方劑中附子溫腎陽(yáng), 可用于腎陽(yáng)不振, 無力化氣行水, 以至尿少之水腫；茯苓、白術(shù)為臣藥, 淡滲利水, 健脾燥濕,使水有所制；白芍以養(yǎng)血柔肝為主, 具有通脈、利小便的功能。另外, 現(xiàn)代藥理研究表明［9］, 真武湯能增加尿量, 促鈉、鉀離子的排出, 改善腎小球?yàn)V過膜的通透性的同時(shí), 也促進(jìn)Cr、BUN 等代謝產(chǎn)物的排出, 減少蛋白的過量損失。

血液流變學(xué)變化與腎病的進(jìn)展密切相關(guān)［10］。血液流變學(xué)變化, 如高凝狀態(tài)、高粘度和血流緩慢, 可能加速腎損傷。本研究顯示糖尿病腎病大鼠紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著升高。紅細(xì)胞壓積與全血粘度密切相關(guān)。紅細(xì)胞聚集水平升高會(huì)使紅細(xì)胞容易聚集成一串, 并導(dǎo)致血液粘度升高真武湯治療可顯著降低紅細(xì)胞聚集指數(shù), 其藥理作用可能與降低血液粘度有關(guān)。本研究結(jié)果沒有觀察到真武湯對(duì)高血糖的顯著影響(P＞0.05), 一項(xiàng)研究表明［11］, 通過足細(xì)胞特異性缺失葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員4 來保護(hù)足細(xì)胞免受高血糖的影響, 可不通過降低血糖水平預(yù)防腎小球疾病和糖尿病相關(guān)蛋白尿的進(jìn)展, 故本研究推測(cè)真武湯在預(yù)防蛋白尿和改善腎功能方面具有潛在的應(yīng)用潛力, 不依賴于血糖降低途徑。nephrin 和podocin 是足細(xì)胞相關(guān)蛋白, podocin 是足細(xì)胞中唯一整合膜蛋白,能夠與nephrin 相互作用形成足細(xì)胞裂孔膜支架, 控制腎小球?yàn)V過膜通透性, nephrin 表達(dá)缺失或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)異常將導(dǎo)致足細(xì)胞形態(tài)改變和蛋白尿產(chǎn)生, 本研究結(jié)果與模型對(duì)照組比較, 真武湯組nephrin、podocin均明顯提高(P＜0.05), 這提示真武湯可減輕腎小球肥大,改善高血糖癥, 對(duì)足膠質(zhì)細(xì)胞損傷具有多重保護(hù)作用。

綜上所述, 真武湯可通過改善代謝紊亂、增加nephrin 和podocin 基因表達(dá), 有效減輕糖尿病腎病大鼠的腎損傷, 改善腎功能, 真武湯可能是治療糖尿病腎病的有效途徑。