熒光顯微，看透生命

開欄語

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)，一個將基礎(chǔ)科學(xué)研究與臨床實踐緊密結(jié)合的領(lǐng)域，不僅僅是一個概念，更是一場變革，旨在縮短從發(fā)現(xiàn)到應(yīng)用的距離，加速新療法、新藥物和新診斷工具的開發(fā)與應(yīng)用。轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)國家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施（四川）由四川大學(xué)、華西醫(yī)院共同承建，是“中華人民共和國國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展第十二個五年規(guī)劃綱要”期間批復(fù)建立的五個轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)國家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施之一，是我國首個生物治療轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)大設(shè)施，建立了從基礎(chǔ)到臨床、上下游結(jié)合的完整的生物治療研發(fā)轉(zhuǎn)化“技術(shù)鏈”，致力于縮短生物治療成果從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的時間，未來5-10年內(nèi)，將支撐50-100個自主創(chuàng)新研發(fā)的候選生物治療產(chǎn)品實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。本利專設(shè)“轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)科普專欄”，特邀四川大學(xué)華西醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)國家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施的研究者，介紹轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)知識，報道轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域掀起的醫(yī)學(xué)健康新浪潮，分享科研工作中的趣聞和故事。

2009年，科學(xué)家首次拍攝并記錄下HIV病毒在細(xì)胞間的傳播過程。他們用綠色熒光蛋白標(biāo)記感染T細(xì)胞（免疫細(xì)胞），發(fā)現(xiàn)一旦被感染的T細(xì)胞靠近健康的人體細(xì)胞，兩個細(xì)胞之間就會形成小小的“橋”，T細(xì)胞中的HIV病毒通過這些“橋”迅速入侵健康細(xì)胞。

記錄下病毒的傳播過程，在很長一段時間里被認(rèn)為是無法實現(xiàn)的。病毒極小，大多數(shù)病毒的直徑約為0.1微米，只有心肌細(xì)胞的1/500。光學(xué)顯微鏡能讓我們看到細(xì)胞的細(xì)節(jié)，但通過它觀察病毒就有點兒力不從心了。電子顯微鏡可以看到病毒，但問題在于電子顯微鏡只可以研究靜態(tài)結(jié)構(gòu)，要還原動態(tài)過程就不行了。

熒光顯微技術(shù)的出現(xiàn)，不僅能讓我們看清極小的結(jié)構(gòu)，還能記錄其動態(tài)全過程。這種技術(shù)的出現(xiàn)，將生命科學(xué)觀測引入了全新領(lǐng)域。

基于大自然的熒光物質(zhì)一GFP（綠色熒光蛋白）

GFP的發(fā)現(xiàn)

綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，簡稱GFP）是一種在生物科學(xué)研究中廣泛使用的熒光標(biāo)記蛋白，G-FP在紫外線或藍(lán)光照射下會發(fā)出綠色熒光。

秀麗隱桿線蟲是一種堪稱完美的實驗動物，它們基因組簡單、好養(yǎng)活、繁殖周期短、身體透明易于觀察……但這些特征也并非總是優(yōu)點。20世紀(jì)80年代，美國科學(xué)家馬丁·查爾菲苦于找不到合適的方法來研究這種小線蟲的神經(jīng)活動——神經(jīng)元和身體一樣都是透明的，觀察根本無從下手。

機(jī)緣巧合下，馬丁·查爾菲參加了一個關(guān)于GFP的講座，了解到日本生物學(xué)家下村修從一種水母體內(nèi)分離出的一種特殊蛋白質(zhì)，能在紫外線照射下發(fā)出明亮的綠色熒光。

回去后不久，一個靈感沖進(jìn)馬丁，查爾菲的腦海：既然GFP是蛋白質(zhì)，他就可以將編碼GFP的基因插入到秀麗隱桿線蟲的神經(jīng)元基因中，將這些小線蟲的神經(jīng)元改造成熒光神經(jīng)元。馬丁，查爾菲的方法奏效了。從此，一度無法觀測的細(xì)胞活動變得顯而易見，生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究迎來了新紀(jì)元。

GFP由238個氨基酸組成，能夠吸收藍(lán)光并發(fā)出綠光。為了方便觀察：在美籍華裔生物學(xué)家錢永健的努力下，更亮、顏色更多樣化的GFP衍生物接二連三地被研發(fā)出來，G'FP的發(fā)光機(jī)制也得到了破解。

GFP的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用對生物科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，下村修、馬丁。查爾菲和錢永健因在熒光蛋白領(lǐng)域的貢獻(xiàn)，共同獲得了2008年的諾貝爾化學(xué)獎。

特異性

僅有夠亮、顏色夠豐富的GFP還不夠，它們還必須只與被觀測的結(jié)構(gòu)或分子結(jié)合。如果GFP的結(jié)合過程很隨意，弄得細(xì)胞里到處都，是熒光點，這樣的觀測會是一場噩夢。為了讓GFP只和某些結(jié)構(gòu)或分子結(jié)合，觀測者會先派出一些特異性抗體，讓它們與需要觀測的結(jié)構(gòu)或分子結(jié)合，形成復(fù)合物，再用GFP與這些復(fù)合物結(jié)合，使只有被觀測者才顯熒光。

GPP基因編輯動物

GFP基因也可以被插入到實驗動物的基因組中。為了驗證小鼠這樣的動物，能夠表達(dá)GFP基因，科學(xué)家們改造出了能在紫外線照射下發(fā)出熒光的小鼠和兔。

除了GFP，熒光顯微學(xué)中還會用到許多種熒光染料，例如FITC、TRITC和DAPI。這些熒光染料在熒光顯微學(xué)中的應(yīng)用，非常廣泛。它們既可以單獨使用，也可以組合使用進(jìn)行多色標(biāo)記和成像。

熒光顯微鏡

熒光顯微鏡使用熒光來研究標(biāo)本的微觀結(jié)構(gòu)，也可以被用來觀察細(xì)胞或病毒的活動。在許多方面，熒光顯微鏡的構(gòu)造與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡相似。

熒光顯微鏡的兩大特點

熒光顯微鏡使用非常強(qiáng)大的光源。

熒光顯微鏡使用專門的濾光片，如激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片。

熒光顯微鏡最常用的光源包括氙弧燈和汞蒸氣燈，有些也使用超連續(xù)光源、LED或激光。汞蒸氣燈的亮度比傳統(tǒng)顯微鏡照明系統(tǒng)明亮10 - 100倍，并且發(fā)出的光線頻譜更廣。同時，激發(fā)和發(fā)射濾光片能只讓特定波長的光照亮樣本，達(dá)到只讓特定結(jié)構(gòu)或物質(zhì)發(fā)出熒光的目的，而利于觀察。

熒光顯微技術(shù)的魔力

熒光顯微技術(shù)通過使人體的細(xì)胞和組織顯出特定熒光，讓醫(yī)生和科學(xué)家們清晰地看到細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，追蹤疾病的源頭。在癌癥的戰(zhàn)場上，熒光顯微技術(shù)能幫助我們找到那些隱藏的壞蛋——癌細(xì)胞，并監(jiān)視它們的一舉一動。在藥物開發(fā)的實驗室里，它又變成了一位嚴(yán)格的考官，測試新藥是否能夠精準(zhǔn)打擊目標(biāo)。

無論是在手術(shù)臺上，還是在研究者的顯微鏡下，熒光顯微技術(shù)都以其獨特的“火眼金睛”，讓我們對生命的理解更加深入，為疾病的診斷和治療帶來了變革。這，就是熒光顯微技術(shù)的魔力。

熒光顯微鏡下的微觀世界

四川大學(xué)華西醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)國家重大科技基礎(chǔ)設(shè)的研究者拍攝到的熒光顯微圖片

蝶戀花：粉紅單端孢霉

切開一個外表無任何異樣的蘋果，卻發(fā)現(xiàn)蘋果核已經(jīng)腐爛，這是蘋果心腐病，造成腐壞的元兇是粉紅單端孢霉。被這種真菌感染的蘋果，果實外觀常表現(xiàn)正常，而里面已經(jīng)腐爛，而且感染嚴(yán)重的幼果常早期脫落。心腐病是蘋果生產(chǎn)的重要病害之一，除了蘋果，粉紅單端孢霉還能感染梨、桃、棉鈴等作物。

研究者說

粉紅單端孢霉具有分隔的菌絲，菌絲頂端有數(shù)個較大的梨形分生孢子。粉紅單端孢霉偶爾可感染人類，感染部位多為指甲、皮膚、角膜、鼻竇，免疫低下者會出現(xiàn)肺部、腹膜和血液感染。

橫梗霉（毛霉日）

毛霉目真菌普遍存在于土壤等自然環(huán)境中，它們繁殖迅速，向空氣中釋放大量孢子。我們每天都會吸入這些真菌的孢子，但只要我們的免疫系統(tǒng)健全、呼吸道屏障完備，毛霉菌的孢子會被纖毛從呼吸道清除，少數(shù)進(jìn)入肺部的孢子也會被免疫系統(tǒng)及時消滅。然而，當(dāng)人們因為疾病而抵抗力變?nèi)鯐r，毛霉真菌的孢子便會乘虛而入……

犬小孢子菌

犬小孢子菌是全球最常見的皮膚感染致病菌之一，主要感染貓、狗和人類。約99%的貓皮膚癬，罪魁禍?zhǔn)锥际侨℃咦泳?/p>

犬小孢子菌非常喜歡動物皮膚上的角蛋白，它們寄生于人、貓和狗的皮膚角質(zhì)層，通過角蛋白酶分解角質(zhì)。

“白吃白喝”也就罷了，這群小家伙的代謝產(chǎn)物還會引起皮膚的嚴(yán)重炎癥。

研究者說

犬小孢子菌這類皮膚癬菌，一般只侵犯指甲和毛發(fā)，但在少數(shù)情況下，這類皮膚癬菌可導(dǎo)致真皮和皮下組織感染，引起深在型皮膚癬菌病。

研究者說

毛霉目真菌感染人體后，有兩條入侵路徑：一條是“鼻—眼眶—腦”：另一條是進(jìn)入肺部。

鼻眶腦毛霉病是一種急性、進(jìn)展快速而兇險的感染，常繼發(fā)于嚴(yán)重的糖尿病酮癥酸中毒患者。

肺毛霉病死亡率達(dá)50%～70%。印度的毛霉病發(fā)病率一直居高不下，其原因可能是印度氣候多雨潮濕，較適宜毛霉菌繁殖。

值得一提的是，毛霉目中的根霉菌在發(fā)酵食品領(lǐng)域可謂大放光彩。甜甜的米酒，其釀造過程就需要根霉菌的淀粉酶將糯米淀粉切割成小段的糖；根霉菌的蛋白酶可以將豆腐的蛋白質(zhì)切割成小段的氨基酸，賦予腐乳細(xì)膩的口感和復(fù)雜的鮮味。

星形膠質(zhì)細(xì)胞

圖為SD大鼠乳鼠脊髓原代星形膠質(zhì)細(xì)胞染色結(jié)果，其中藍(lán)色部分是細(xì)胞核，黃色部分是星形膠質(zhì)細(xì)胞。整幅圖如夜空中綻放的禮花。

研究者說

我們的大腦除了神經(jīng)元（神經(jīng)細(xì)胞）這類負(fù)責(zé)處理信息的細(xì)胞，還有各種支持型細(xì)胞，例如星形膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞對大腦意義重大，它們身兼多職。

星形膠質(zhì)細(xì)胞的四大功能

星形膠質(zhì)細(xì)胞就像神經(jīng)元的保鏢，繞著神經(jīng)元轉(zhuǎn)，幫忙維持神經(jīng)元的穩(wěn)定。

星形膠質(zhì)，細(xì)胞就像清潔工，能吸收和清除神經(jīng)元活動產(chǎn)生的多余化學(xué)物質(zhì)。

它們可以參與炎癥反應(yīng)并招募免疫細(xì)胞，幫助神經(jīng)系統(tǒng)抵抗感染和參與修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞，對神經(jīng)元提供強(qiáng)大的支持和保護(hù)。

通過釋放化學(xué)信號分子，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元之間的連接，影響神經(jīng)元的興奮和抑制。

研究者說

血管是機(jī)體運(yùn)輸血液的管道，在血管的周圍分布有許多間充質(zhì)干細(xì)胞，并與血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及其他類型的細(xì)胞相互聯(lián)系，在組織損傷修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。運(yùn)用多重免疫熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察，這些細(xì)胞的細(xì)胞核被標(biāo)記為藍(lán)色，其細(xì)胞表面或內(nèi)部，的不同抗原與抗體結(jié)合，并被不同熒光染料標(biāo)記為黃色、紅色、綠色、橙色等多種顏色，最終無數(shù)細(xì)胞圍繞血管，形成一幅如同星系的畫面。

錦鯉——細(xì)胞骨架

膀胱上皮細(xì)胞類器官培養(yǎng)的細(xì)胞骨架染色，其中藍(lán)色部分是細(xì)胞核，紅色部分是F-actin骨架染色，共聚焦層掃后復(fù)合到一起，像一條活靈活現(xiàn)的小鯉魚。

研究者說

類器官是一種在體外培育而成的具備三維結(jié)構(gòu)的微器官，擁有類似真實器官的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，能部分模擬來源組織器官的生理功能。我們在進(jìn)行膀胱類器官構(gòu)：建骨架表征時采集了這張照片。

圖中藍(lán)色和粉紅色部分是復(fù)合材料自發(fā)熒光，綠色部分是鈣黃綠素染色的細(xì)胞，通過雙光子激光共聚焦層掃后復(fù)合到一起，在黑色背景下像漂亮的孔雀翎羽。

細(xì)胞能夠維持形態(tài)，要感謝細(xì)胞骨架。由微絲、微管和中間纖維構(gòu)成的細(xì)胞骨架，不僅發(fā)揮著“細(xì)胞鋼筋”的作用，還是細(xì)胞中的“高速公路”，對細(xì)胞自噬和細(xì)胞分裂等細(xì)胞活動發(fā)揮著重要作用。

研究者說

我們從事的主要工作是進(jìn)行體外宏觀意義上的組織器官工程化構(gòu)建，支架材料是工程化構(gòu)建的關(guān)鍵因素，理想的支架材料需要有良好的生物相容性及誘導(dǎo)活性，在引導(dǎo)組織再生的同時具有響應(yīng)的降解速率b圖片中展示的就是我們合成的復(fù)合材料，它能夠支持細(xì)胞生長存活，且其各組分可自發(fā)熒光，有利于在修復(fù)過程中對材料進(jìn)行示蹤，評估其降解速率和組織再生的匹配程度。

名為FIONA的熒光顯微成像技術(shù)，甚至能達(dá)到1納米的超高分辨率。熒光顯微技術(shù)讓人類得以窺探“納米尺度”，并且能“實時”觀察活細(xì)胞內(nèi)的分子運(yùn)動，為疾病治療和藥物研發(fā)帶來革命性變化。在這項“神器”的幫助下，細(xì)胞內(nèi)部的微小結(jié)構(gòu)和復(fù)雜過程將不再對人類隱形。

熒光——額外的色彩

當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的人射光（通常是紫外線或X射線）照射時，它會在吸收光能后進(jìn)人激發(fā)態(tài)，退激發(fā)后釋放出射光（通常出射光的波長比入射光的波長長，在可見光波段）；而且一旦入射光停止照射，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。其實，熒光現(xiàn)象在自然界比比皆是。

海洋動物

GFP能使水母在藍(lán)光和紫外線下發(fā)出綠色光。某些品種的魚類、珊瑚、?？Ⅱ狎婧蜆镒泐愇⑸矬w內(nèi)都被發(fā)現(xiàn)存在GFP。綠光能充分震懾水母的天敵，讓它們不敢輕易靠近。有的水母還能將數(shù)千個發(fā)光的顆粒釋放到水中，以此模仿小型浮游生物來迷惑天敵；許多海洋微生物都有趨光性，利用這一點，水母能吸引大量微生物主動靠近自己。當(dāng)感知到洋流、鹽度、溫度等變化時，有的水母也會發(fā)出熒光以通知同伴……在昏暗的深海，熒光可謂相當(dāng)有用。

熒光礦物

螢石、方解石、方鉛礦、磷灰石等熒光礦物在紫外線或X射線的照射下，能發(fā)出鮮艷的熒光。在人類已發(fā)現(xiàn)的6000多種礦物中，有200多種具有熒光效應(yīng)。熒光效應(yīng)在鉆石、紅寶石、翡翠等寶石中也十分常見。

蝎子

在黑暗環(huán)境中用紫外光照射蝎子，它們竟然能發(fā)出綠色或藍(lán)色的熒光。蝎子、蜘蛛、蜈蚣、甲蟲等節(jié)肢動物一般都有外骨骼。蝎子的外骨骼比較特殊，還有一層獨特的“透明質(zhì)層”，這層結(jié)構(gòu)讓蝎子具有熒光特性。