鹽酸四環(huán)素長(zhǎng)期暴露對(duì)序批式反應(yīng)器性能、微生物酶活性及微生物群落的影響*

齊維毅, 王倩芝, 楚光玉, 陳文正, 張雨喬, 劉甲滕, 高 暢, 魯帥領(lǐng), 高孟春**

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266100; 2. 中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266100)

隨著水體污染和水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題的日益突出,污水處理技術(shù)逐漸從過(guò)去以單一的有機(jī)物去除,轉(zhuǎn)變?yōu)樘?、氮和磷的同步削減?；瘜W(xué)除磷具有良好的去除效果,現(xiàn)已在實(shí)際處理工程中普遍應(yīng)用,而氮的去除仍需通過(guò)生物法。因此,生物脫氮工藝仍為當(dāng)今污水處理領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[1]。傳統(tǒng)生物脫氮工藝主要包括硝化和反硝化過(guò)程,實(shí)際工程中,由于功能不同的微生物生理代謝特征具有差異性,為了彌補(bǔ)傳統(tǒng)生物脫氮工藝的不足,故衍生出序批式活性污泥法(Sequencing batch reactor,SBR)處理技術(shù),SBR技術(shù)具有脫氮除磷效果好、抗沖擊能力強(qiáng)等特點(diǎn),目前已在國(guó)內(nèi)外獲得廣泛應(yīng)用。SBR具有明顯的工藝優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景,穩(wěn)定的生物活性是其優(yōu)勢(shì)發(fā)揮的重要前提。溶解氧、溫度、pH值、有機(jī)負(fù)荷、進(jìn)水碳氮比和含毒性物質(zhì)(如抗生素和重金屬)等進(jìn)水水質(zhì)特征均會(huì)影響SBR活性污泥的微生物活性,進(jìn)而影響其對(duì)污染物的去除性能[2]。

四環(huán)素類抗生素是一種廣譜抗菌劑,廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)等行業(yè)。由于生物對(duì)其利用率較低,導(dǎo)致大量含四環(huán)素的醫(yī)療和養(yǎng)殖廢水進(jìn)入污水處理廠。四環(huán)素類抗生素具有低揮發(fā)性和高度親水性的特點(diǎn),在水環(huán)境中穩(wěn)定性好,污水中殘留的四環(huán)素可誘導(dǎo)水處理系統(tǒng)中抗生素抗性細(xì)菌和基因的產(chǎn)生,對(duì)公共健康構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。四環(huán)素類抗生素中,鹽酸四環(huán)素(TC)、土霉素和金霉素是最常用的[5]。其中TC是一種廣譜抗生素,能夠在核糖體水平抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成,進(jìn)而影響革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌的代謝水平和生理活性[6]。長(zhǎng)期暴露于含TC的水環(huán)境中脫氮微生物會(huì)受到不利影響。水體中TC的濃度一般在1 ng/L到129.3 μg/L之間,在制藥廠排放的廢水中TC濃度可達(dá)到11.9 mg/L[7-8]。低濃度的TC對(duì)生物處理系統(tǒng)的影響較小,隨著TC濃度的不斷增加,生物系統(tǒng)所受的影響隨之增加。Maria Matos等[9]研究發(fā)現(xiàn)50 μg/L TC對(duì)硝化過(guò)程沒(méi)有明顯影響,而Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn)0.2 mg/L的TC對(duì)生物脫氮的影響較小,且當(dāng)TC濃度升高到2 mg/L時(shí),反硝化過(guò)程受到明顯抑制,脫氮效果相應(yīng)下降。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)30 mg/L TC不同程度地降低了AMO、NOR、NR和NIR等脫氮相關(guān)酶的活性,并誘導(dǎo)了細(xì)菌TC抗性的外排泵和酶修飾機(jī)制。TC破壞微生物細(xì)胞膜完整性,誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生,增強(qiáng)了對(duì)微生物的毒性效應(yīng),從而抑制了脫氮相關(guān)的酶和功能基因的合成[12-13]。劉航[14]研究了TC長(zhǎng)期作用對(duì)脫氮除磷功能菌的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)雖然痕量TC雖然不會(huì)顯著降低生物處理系統(tǒng)的微生物群落豐富度,但會(huì)降低微生物群落多樣性。Zhang等[15]研究了TC對(duì)活性污泥微生物群落和抗生素抗性基因的影響,發(fā)現(xiàn)在TC長(zhǎng)期暴露下,Actinobacteria和抗生素抗性基因的豐度隨TC濃度增加而增加。

目前,多數(shù)研究集中于環(huán)境濃度(ng/L—μg/L)下TC對(duì)活性污泥性能的影響,實(shí)際工程中的TC濃度可能達(dá)mg/L水平,低濃度的TC不會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生明顯的抗性,但當(dāng)TC濃度達(dá)到mg/L水平時(shí),會(huì)導(dǎo)致抗性基因的產(chǎn)生和傳遞,從而影響污水處理系統(tǒng)的性能。因此,本研究考察了0.5 mg/L TC長(zhǎng)期暴露對(duì)SBR活性污泥系統(tǒng)污染物去除性能、脫氮相關(guān)酶活性和微生物群落的影響,評(píng)價(jià)了0.5 mg/L TC對(duì)微生物的毒性,分析了活性污泥微生物抗氧化酶的響應(yīng)特征,研究結(jié)果可為評(píng)估四環(huán)素類抗生素的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置及運(yùn)行條件

本研究采用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的SBR作為反應(yīng)裝置,其由有機(jī)玻璃制成,直徑為14 cm,有效高度為50 cm,有效容積為7.7 L,容積交換比為50%。SBR的運(yùn)行由時(shí)間繼電器控制,每天運(yùn)行3個(gè)周期,每個(gè)周期包括5 min進(jìn)水、300 min好氧曝氣、140 min缺氧攪拌、30 min沉降和5 min出水。進(jìn)水由蠕動(dòng)泵從反應(yīng)器頂部的進(jìn)水口泵入,空氣通過(guò)曝氣泵從反應(yīng)器底部的曝氣頭通入。好氧階段SBR中溶解氧(DO)濃度在2～3 mg/L之間。在缺氧階段,采用磁力攪拌器對(duì)SBR中的污泥和廢水進(jìn)行攪拌,DO濃度小于0.5 mg/L。

1.2 接種污泥及水質(zhì)

本研究接種污泥取自青島市海泊河污水處理廠二沉池污泥,接種污泥濃度4 000 mg/L,進(jìn)水根據(jù)生活污水人工配制,其具體組分如下(mg/L):CH3COONa(508.0);NH4Cl(158.0);KH2PO4(2.2);微量元素(1 mL/L)。進(jìn)水COD和氨氮濃度分別為400 mg/L和40 mg/L。微量元素的組成如下(mg/L):H3BO3(1.0);AlCl3·6H2O(1.8);NiCl2·6H2O(1.8);MnSO4·H2O(1.0);CoCl2·6H2O(1.0);CuSO4·5H2O(1.0);ZnSO4·7H2O(1.0)。在加入TC之前,SBR系統(tǒng)經(jīng)過(guò)11 d達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),從第12天開(kāi)始,投加TC使進(jìn)水中TC濃度為0.5 mg/L。

1.3 分析方法

2 結(jié)果與討論

2.1 TC長(zhǎng)期暴露對(duì)SBR性能的影響

圖1 TC長(zhǎng)期暴露對(duì)SBR性能的影響

2.2 TC長(zhǎng)期暴露對(duì)微生物酶活性的影響

((a)AMO和NOR;(b)NR和NIR,“*”表示與未投加四環(huán)素的第11天相比具有顯著性差異(p<0.05),誤差線表示三次實(shí)驗(yàn)測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)差。(a)AMO and NOR activities,(b)NR and NIR activities. Asterisks indicate the statistical difference (p<0.05) from the microbial activity under long-term exposure of TC.)

2.3 TC長(zhǎng)期暴露對(duì)微生物毒性及抗氧化酶的影響

TC長(zhǎng)期暴露對(duì)微生物酶活性有明顯的抑制作用,因此,評(píng)價(jià)TC長(zhǎng)期暴露條件下活性污泥受到的毒性及對(duì)微生物抗氧化酶的影響至關(guān)重要。ROS的生成量是評(píng)價(jià)微生物毒性的重要指標(biāo)之一[20],當(dāng)受到TC脅迫時(shí),微生物內(nèi)ROS增加,產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),破壞活性污泥中微生物的細(xì)胞膜。ROS的相對(duì)產(chǎn)生量和LDH的相對(duì)釋放量如圖3(a)所示,在添加TC后,ROS的產(chǎn)量在第25天時(shí)增加了12%,表明TC使活性污泥細(xì)胞產(chǎn)生了輕微的氧化應(yīng)激反應(yīng)。與第25天相比,ROS在第42、57和70天時(shí)分別增加了32%、45%和62%,說(shuō)明TC長(zhǎng)期作用導(dǎo)致活性污泥產(chǎn)生更多的ROS,微生物的毒性增加。LDH是評(píng)價(jià)細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)[21],投加TC后第14天時(shí),LDH釋放量顯著增加了19%,這說(shuō)明TC破壞了細(xì)胞膜的完整性,投加TC后第31、46和59天時(shí),LDH釋放量分別增加了68%、100%和168%,表明TC長(zhǎng)期暴露導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性嚴(yán)重受損,促進(jìn)LDH產(chǎn)生,進(jìn)而影響微生物對(duì)COD和氮的去除能力。SOD、CAT、POD、APX和GPX是重要的抗氧化酶,主要清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的活性氧,在維持活性氧平衡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[22-26]。TC長(zhǎng)期暴露對(duì)SOD、CAT、POD、APX和GPX活性的影響如圖3(b)所示,反應(yīng)器運(yùn)行第25天時(shí),與第11天相比,SOD和GPX相對(duì)活性略有升高,CAT、POD和GPX相對(duì)活性明顯升高。SOD的相對(duì)活性在第42、57和70天分別增加了46%、76%和94%,CAT的相對(duì)活性分別增加了61%、70%和80%,POD的相對(duì)活性分別增加了73%、80%和85%,APX的相對(duì)活性分別增加了43%、59%、72%和93%,GPX的相對(duì)活性分別增加了73%、122%和230%,這說(shuō)明TC長(zhǎng)期暴露作用下,SOD、CAT、POD、APX和GPX的抗氧化機(jī)制均發(fā)生明顯變化。在本研究中,TC作用初期,CAT、POD和APX活性變化更大,說(shuō)明CAT、POD和APX發(fā)揮更大的作用,隨著TC暴露時(shí)間的延長(zhǎng),SOD和GPX逐漸發(fā)揮更大作用,在消除活性氧方面,這些抗氧化酶相互協(xié)同補(bǔ)償,表明TC長(zhǎng)期暴露影響了活性污泥整體的生理活動(dòng)。

((a)ROS和LDH;(b)SOD,CAT,POD,APX和GPX,“*”表示與未投加四環(huán)素的第11天相比具有顯著性差異(p<0.05),誤差線表示三次實(shí)驗(yàn)測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)差。(a) Relative ROS activity and relative LDH release, (b) relative SOD, CAT, POD, APX and GPX activities. Asterisks indicate the statistical difference (p<0.05) from the microbial biotoxicity and antioxidants under long-term exposure of TC.)

2.4 TC長(zhǎng)期暴露對(duì)微生物群落的影響

在第0、42和70天取SBR中活性污泥樣品,分別命名為S0、S42和S70。如表1所示,S0、S42和S70的Goods_coverage均為1,說(shuō)明測(cè)序深度完全覆蓋了樣品的所有物種。Chao1指數(shù)和OTUs數(shù)目常用來(lái)表示物第70天時(shí)Chao1降低至710.8,OTUs數(shù)目從1 683降低至709,這表明TC長(zhǎng)期暴露明顯降低了微生物豐富度。Pielou_e指數(shù)常用來(lái)表示物種的均勻度,在添加TC之后,污泥的Pielou_e指數(shù)逐漸降低,表明TC降低了物種的均勻度。Shannon和Simpson指數(shù)分別為9.313和0.995,樣品具有較高的多樣性和均勻度,在反應(yīng)器運(yùn)行第42天時(shí),Shannon和Simpson指數(shù)分別降低至7.379和0.965,隨著TC暴露時(shí)間的延長(zhǎng),Shannon指數(shù)繼續(xù)降低至0.672,表明在TC長(zhǎng)期暴露下,微生物群落的多樣性和均勻性均降低。

表1 四環(huán)素長(zhǎng)期暴露對(duì)微生物群落的豐富度和多樣性指數(shù)的影響

((a)門(mén)水平;(b)屬水平。(a)Phyla level,(b)Genus level.)圖4 TC長(zhǎng)期暴露下微生物群落在門(mén)和屬水平上的豐度

2.5 LEfSe分析TC長(zhǎng)期暴露下微生物群落的差異物種

為了確定TC長(zhǎng)期暴露下產(chǎn)生顯著性差異影響的物種類群,本研究進(jìn)行了LEfSe分析,進(jìn)一步比較了不同運(yùn)行時(shí)間下起顯著作用的微生物。由內(nèi)到外的圓圈分別表示從門(mén)到屬的分類級(jí)別,在圓圈上標(biāo)記為不同顏色的節(jié)點(diǎn)表示發(fā)揮重要作用的微生物。如圖5(b)所示,在LDA閾值為4.0處出現(xiàn)41個(gè)生物標(biāo)志物,包括4個(gè)門(mén)水平微生物、8個(gè)綱水平微生物、10個(gè)目水平微生物、10個(gè)科水平微生物和9個(gè)屬水平微生物,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Proteobacteria、Planctomycetota、Acidobacteriota和Acidobacteriota是污水處理廠污泥中的優(yōu)勢(shì)微生物。在反應(yīng)器運(yùn)行第42天時(shí),微生物在門(mén)和綱水平上沒(méi)有顯著性差異,在目水平上,Chitinophagales是S42中的標(biāo)志微生物,而在科水平上,Saprospiraceae和Comamonadaceae是S42中的標(biāo)志微生物。在屬水平上,Ahniella在接種污泥中發(fā)揮重要作用,而在0.5 mg/L TC長(zhǎng)期影響下,在反應(yīng)器運(yùn)行第70天時(shí),Zoogloea、Thauera、Dechloromonas和Candidatus_Competibacter成為了標(biāo)志微生物,Zoogloea、Thauera和Dechloromonas均是參與反硝化作用的相關(guān)屬,說(shuō)明在0.5 mg/L TC長(zhǎng)期暴露下,這些屬具有較好的耐受性。以上結(jié)果表明在0.5 mg/L TC長(zhǎng)期作用下,微生物群落具有顯著性差異。

((a)進(jìn)化分枝圖,(b)LDA值分布柱狀圖。(a) A cladogram of the all samples,(b) The LDA score of the abundant biomarkers from all samples.)

2.6 鹽酸四環(huán)素長(zhǎng)期暴露對(duì)微生物群落共現(xiàn)性的影響

本研究以接種污泥為對(duì)照,在微生物屬水平上構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖,確定了關(guān)鍵微生物。節(jié)點(diǎn)數(shù)量和平均節(jié)點(diǎn)相鄰數(shù)可以反映微生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的復(fù)雜性和穩(wěn)定性[41]。如表2所示,在S42中,節(jié)點(diǎn)數(shù)量和平均節(jié)點(diǎn)相鄰數(shù)分別為29和23.586,在S70中,節(jié)點(diǎn)數(shù)量和平均節(jié)點(diǎn)相鄰數(shù)分別為30和24.667,隨著反應(yīng)器運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng),微生物網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性逐漸增強(qiáng)。聚類系數(shù)和網(wǎng)絡(luò)密度可以反映網(wǎng)絡(luò)圖的重要性質(zhì),S70的聚類系數(shù)和網(wǎng)絡(luò)密度高于S42,說(shuō)明在TC長(zhǎng)期作用下,微生物之間的作用關(guān)系更加復(fù)雜。在網(wǎng)絡(luò)圖中,微生物之間存在著正相關(guān)和負(fù)相關(guān),正相關(guān)表示微生物之間的合作行為,負(fù)相關(guān)表示微生物之間的捕食和競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[42]。如圖6所示,TC長(zhǎng)期暴露改變了微生物在生態(tài)位中的作用,在S42中,正相關(guān)的比例為46%,而在S70中,正相關(guān)比例為55%,這可能是因?yàn)樵赥C長(zhǎng)期脅迫下,微生物間相互合作,以保持微生物系統(tǒng)的穩(wěn)定性。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的改變可能導(dǎo)致微生物的變化,根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)確定了具有較高中心度的關(guān)鍵微生物。微生物網(wǎng)絡(luò)與生態(tài)系統(tǒng)功能緊密相關(guān),在TC長(zhǎng)期暴露下,SBR活性污泥的關(guān)鍵微生物存在顯著差異,當(dāng)反應(yīng)器運(yùn)行至第42天時(shí),SBR活性污泥中關(guān)鍵微生物包括Acidibacter、Thiothrix、JG30-KF-CM45、OLB14和Conexibacter,而在第70天時(shí),SBR活性污泥中關(guān)鍵微生物包括Conexibacter、Sulfuritalea、RBG-13-54-9、Candidatus_Accumulibacter和Dokdonella。Conexibacter能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[43],Lei等[44]研究發(fā)現(xiàn)Conexibactersp. LD01可以以林可霉素作為唯一的碳源、氮源和能源生長(zhǎng)。盡管S42和S70中關(guān)鍵微生物不一致,但Conexibacter在投加TC后第31—59天一直是反應(yīng)器中的關(guān)鍵微生物,其在S0、S42和S70中的相對(duì)豐度分別為1.13%、0.26%和0.14%,雖然其在TC長(zhǎng)期暴露下不是豐度最高的微生物,但Conexibacter仍然發(fā)揮著重要作用。Candidatus_Accumulibacter和Dokdonella分別是與生物除磷過(guò)程和反硝化過(guò)程相關(guān)的微生物,在TC長(zhǎng)期暴露下,Candidatus_Accumulibacter的相對(duì)豐度逐漸升高,Dokdonella的相對(duì)豐度逐漸降低,關(guān)鍵微生物及其豐度的變化說(shuō)明在投加TC后第59天時(shí),反應(yīng)器的脫氮除磷性能發(fā)生變化。雖然有些關(guān)鍵微生物在活性污泥中的相對(duì)豐度并不高,但之前的研究也發(fā)現(xiàn)低豐度的微生物可能在生物反應(yīng)器中發(fā)揮重要作用[45]。因此,在今后的研究中,應(yīng)更加關(guān)注關(guān)鍵微生物的作用,將關(guān)鍵微生物之間的相互關(guān)系和反應(yīng)器性能聯(lián)系起來(lái)。

表2 TC長(zhǎng)期暴露下的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮匦?/p>

((a)運(yùn)行時(shí)間從第0天至第42天,(b)運(yùn)行時(shí)間從第0天至第70天,選擇了相對(duì)豐度前30的屬,藍(lán)色實(shí)線表示顯著正相關(guān)(r>0.85),紅線表示顯著負(fù)相關(guān)(r<-0.85),節(jié)點(diǎn)大小代表每個(gè)屬的豐度。(a) Operation time from Day 0 to Day 42, (b) Operation time from Day 0 to Day 70, the top 30 genera with relative abundances were selected. Blue solid lines represent significantly strong positive (r>0.85) linear relationships and red lines represent strong negative (r<-0.85) linear relationships. Node sizes represent the abundances of each genus.)

3 結(jié)語(yǔ)