高效液相色譜法測定菜用大豆鮮籽粒VC含量

鐘文娟，石盛佳，陳四維，戢沛城，龔一耘，牟方生

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所，四川 成都 610300）

菜用大豆（Glycine max(L.)Merr.）亦稱鮮食大豆、毛豆，鼓粒后期籽粒尚未完全飽滿，以幼嫩莢果和鮮籽粒作為蔬菜食用的一類專用大豆[1]，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維、維生素和多種礦物元素，口味獨(dú)特，深受消費(fèi)者青睞，是一種具有營養(yǎng)和保健功能的優(yōu)質(zhì)食品[2]。

維生素C（VC）又名抗壞血酸，廣泛存在于新鮮果蔬中，是維持人體正常生理代謝的一種重要化合物[3]，但人體自身不能合成VC，需要從食物中攝取。菜用大豆含有豐富的VC，是其重要的營養(yǎng)品質(zhì)之一[2]。已知VC 含量測定的主要方法有熒光法[1]、紫外-可見分光光度法[4]、2,6-二氯靛酚鈉鹽滴定法[5-7]、2,4-二硝基苯肼比較法[8-9]、高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）4 種[10-11]。陳華濤等[1]采用GB/T 5009.86—2003《蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定（熒光法）》測定出9個菜用大豆品種籽粒中VC平均含量為16.60～27.67 mg/100 mg。徐兆生等[7]采用2,6-二氯靛酚鈉鹽滴定法測定了55份菜用大豆VC含量，發(fā)現(xiàn)鮮籽粒中VC含量為14.70～40.80 mg/100 g，平均值為27.56 mg/100 g，變異系數(shù)為21.03%。

目前尚未見用其他方法測定菜用大豆VC 含量的研究報道。同時，菜用大豆鮮籽粒中蛋白質(zhì)和淀粉含量高[7]，采用2,4-二硝基苯肼比較法和熒光法測定時干擾因素較其他果蔬多。高效液相色譜法相對于其他方法具有高效、簡單、準(zhǔn)確性好、靈敏度高等特點(diǎn)，且不受樣品顏色的影響，廣泛用于果蔬中VC含量的測定[12-15]，但是目前尚未見用高效液相色譜法檢測菜用大豆鮮籽粒VC含量的報道。因此，本研究采用HPLC 對菜用大豆鮮籽粒VC 含量進(jìn)行檢測，同時優(yōu)化VC提取條件和方法，建立了菜用大豆鮮籽粒VC提取的前處理方法。采用HPLC測定菜用大豆鮮籽粒VC 方法具有簡便、穩(wěn)定和高效的特點(diǎn)，為測定菜用大豆鮮籽粒中VC含量提供理論參考，并為高VC菜用大豆品種的選育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

菜用大豆樣品于2021 年6 月采摘于四川省成都市青白江區(qū)試驗基地，采摘后于-20 ℃條件下保存，其他信息詳見表1。L（+）抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99.23%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；甲醇（色譜純），美國Fisher 公司；偏磷酸（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水，實(shí)驗室自制。

表1 供試菜用大豆信息Table 1 Test vegetable soybean information

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent-1200 型高效液相色譜儀（帶紫外檢測器和自動進(jìn)樣器），美國安捷倫公司；AUW220D 型電子分析天平（精確度0.000 01 g），日本島津公司；T-203型電子分析天平（精確度0.001 g），美國丹佛儀器公司；AvantiJ-E型大容量高速冷凍離心機(jī)，貝克曼庫爾特有限公司；JYL-C022E 型料理機(jī)，九陽股份有限公司；ECO-Q15 型純水機(jī)，上海和泰儀器有限公司；SCIENTZ-IIF型超聲萃取儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；GM-0.33Ⅱ型真空泵，天津市津騰實(shí)驗設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 VC標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.025 00 g L(+)抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品，采用30 g/L偏磷酸溶液將其溶解并定容至25 mL，得到質(zhì)量濃度為1 000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.05、0.10、0.20、0.40、0.70、1.00 mL 于棕色容量瓶中，用30 g/L偏磷酸溶液定容至25 mL，得到質(zhì)量濃度分別為2.0、4.0、8.0、16.0、28.0、40.0μg/mL 的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理與制備

取菜用大豆鮮莢若干，剝殼后將鮮籽粒置于冰上。稱取鮮籽粒20.000 g（精確至0.001 g），置于制漿杯中，加入30 g/L 偏磷酸溶液40 mL，用料理機(jī)處理90 s 將其制成勻漿，用置于冰上的100 mL 燒杯收集勻漿。稱取15.000～20.000 g（精確至0.001 g）勻漿，置于離心管中，再向離心管中加入30 g/L 偏磷酸溶液20 mL。

將裝有勻漿的離心管放入超聲萃取儀低溫（4 ℃）提取20 min，完成后將其置于離心機(jī)中以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速在4 ℃下離心10 min。隨后將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用30 g/L偏磷酸溶液定容并搖勻，獲得樣液。用針式注射器吸取部分樣液，通過0.45μm濾膜過濾注入樣品瓶中，4 ℃保存待上機(jī)分析。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm×5μm），流動相為1 g/L偏磷酸溶液∶甲醇=96∶4（V/V），流速0.8 mL/min，檢測波長243 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20.0μL。

1.2.4 提取溶劑種類和濃度的選擇

VC具有較強(qiáng)的還原性，易受空氣、熱、光等因素影響，但在酸性溶液中有良好的穩(wěn)定性。菜用大豆籽粒中蛋白質(zhì)和淀粉含量多，為防止樣品VC的氧化分解，以及將VC與其他物質(zhì)有效分離，在李國秀等[12]研究的基礎(chǔ)上，并參考GB 5009.86—2016[16]中還原性抗壞血酸的浸取劑，選用偏磷酸溶液作為提取劑。分別用10、20、30、40、50 g/L偏磷酸溶液提取同一菜用大豆樣品VC，同時溶解標(biāo)準(zhǔn)樣品，測定出不同質(zhì)量濃度溶劑制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品及樣品所對應(yīng)的保留時間和峰面積，依照外標(biāo)對照法計算VC含量和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.5 流動相的選擇

流動相需考慮使VC 穩(wěn)定所需的酸性環(huán)境以及色譜柱的pH適用范圍，選擇1 g/L偏磷酸溶液作為流動相的主體，再配以適當(dāng)比例的甲醇作為流動相。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將VC 標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.45 μm 濾膜過濾到樣品瓶中，按“1.2.3”中的色譜條件進(jìn)行分析，測定其峰面積，以VC標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（mAU·s）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 精密度試驗設(shè)計

將菜用大豆樣品‘川鮮豆2 號’按“1.2.2”所述方法制得樣品溶液后，按照“1.2.3”中的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，計算樣品中VC含量和RSD值。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗設(shè)計

將菜用大豆樣品‘81-5’按照“1.2.2”所述方法制得樣品溶液后，于4 ℃條件下靜置8 h，按照“1.2.3”中的色譜條件分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h進(jìn)樣分析，計算樣品中VC含量和RSD值。

1.2.9 重復(fù)性試驗設(shè)計

將菜用大豆樣品‘川鮮豆1 號’按“1.2.2”所述方法平行制備6份供試樣品溶液，按照“1.2.3”中的色譜條件分別進(jìn)樣分析，計算樣品中VC含量和RSD值。

1.2.10 回收率試驗設(shè)計

精密稱取已知VC 含量的菜用大豆樣品‘81-5’，加入VC標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按照“1.2.2”所述方法制備6份供試樣品溶液和“1.2.3”中的色譜條件分別進(jìn)樣分析。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均用Excel 2007軟件計算處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑質(zhì)量濃度的確定

由表2可見，以質(zhì)量濃度為30、40、50 g/L 的偏磷酸溶液作為提取溶劑，檢測到的VC含量平均值無顯著性差異，因此選擇30 g/L偏磷酸溶液作為浸取劑提取菜用大豆鮮籽粒中VC。

表2 提取劑質(zhì)量濃度選擇試驗結(jié)果Table 2 Selection test results of extractant concentration

2.2 流動相的確定

以1 g/L 偏磷酸∶甲醇=96∶4（V/V）為流動相時，VC 與鄰近雜質(zhì)峰能夠達(dá)到基線分離，液相色譜峰尖銳且樣品分析時間短，因此，本研究以1 g/L 偏磷酸∶甲醇=96∶4（V/V）為流動相。圖1 為VC 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，圖2 為菜用大豆樣品溶液色譜圖。由圖1 和圖2可見，VC標(biāo)準(zhǔn)樣品和菜用大豆樣品中VC的保留時間分別為4.327 min和4.329 min。

圖1 VC標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of vitamin C standard solution by HPLC

圖2 菜用大豆樣品溶液高效液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of vegetable soybean sample solution by HPLC

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

如圖3 所示，VC 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=80.751x-6.409 4，R2=1.000，表明VC 質(zhì)量濃度范圍為2～40μg/mL時，其峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好。

圖3 VC標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of VC

2.4 精密度試驗結(jié)果

由表3可見：RSD值為0.13%，說明本試驗方法測定菜用大豆鮮籽粒VC含量的精密度良好。

表3 精密度試驗結(jié)果Table 3 Precision test results

2.5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

表4 顯示：8 h 時樣品VC 含量為23.34 mg/100 g，RSD 值為0.30%，說明供試樣品溶液在4 ℃低溫下可保持8 h穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 4 Stability test results

2.6 重復(fù)性試驗結(jié)果

由表5可見：RSD值為1.03%，說明本試驗方法測定菜用大豆鮮籽粒VC含量的重復(fù)性良好。

表5 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 5 Repeatability test results

2.7 回收率試驗結(jié)果

由表6可見：平均加標(biāo)回收率為108.14%，6次測定結(jié)果的RSD 值為1.70%，表明本試驗方法準(zhǔn)確度良好。

表6 回收率試驗結(jié)果Table 6 Recovery rate test results

2.8 樣品測定

將12 個菜用大豆樣品按照“1.2.2”所述方法和“1.2.3”中的色譜條件，分別制備3份供試溶液進(jìn)樣分析，依照外標(biāo)對照法計算VC含量，結(jié)果見表7。由表7 可見，12 個菜用大豆品種鮮籽粒中VC 平均含量范圍為19.63～27.59 mg/100 g。與陳華濤等[1]采用熒光法測定9 個菜用大豆品種籽粒中VC 的平均含量（16.60～27.67 mg/100 g）范圍較一致。表明此方法能有效檢測出菜用大豆鮮籽粒中的VC含量。

表7 不同菜用大豆品種中VC含量測定結(jié)果Table 7 Determination results of VC content in different vegetable soybean varieties 單位：mg/100 g

3 討論與結(jié)論

菜用大豆鮮籽粒質(zhì)地較硬且含有豐富的蛋白質(zhì)和淀粉[10]，將樣品進(jìn)行勻漿處理比較困難，不易得到較高質(zhì)量的勻漿樣品。本研究優(yōu)化的菜用大豆鮮籽粒前處理方法能有效地將鮮籽粒進(jìn)行勻漿處理，得到品質(zhì)較好的鮮籽粒勻漿，提高了樣品中VC 萃取率，并配合低溫提取減少鮮籽粒中VC 的氧化，盡量減少測定樣品中VC 含量的損耗，降低試驗誤差，是一種有效的前處理方法。同時，該樣品前處理方法也可為菜用大豆鮮籽粒中其他營養(yǎng)成分檢測提供參考。

菜用大豆鮮籽粒中的VC 含量沒有獼猴桃樣品中的含量高[12]，采用提取試劑10 g/L偏磷酸濃度試驗效果不理想，同時采用GB 5009.86—2016[16]中提供的參考質(zhì)量濃度20 g/L 檢測時VC 也沒有目標(biāo)峰，因此對菜用大豆鮮籽粒VC 提取的最適偏磷酸質(zhì)量濃度進(jìn)行了探究。試驗結(jié)果表明：不同提取劑質(zhì)量濃度對檢測結(jié)果影響較大，30 g/L偏磷酸適宜用于菜用大豆鮮籽粒VC 的提取，因此建議在檢測不同作物VC含量時需要對相應(yīng)的提取試劑質(zhì)量濃度進(jìn)行篩選，以獲得更加精準(zhǔn)的試驗數(shù)據(jù)。

本研究采用高效液相色譜法測定菜用大豆鮮籽粒中VC含量，以30 g/L偏磷酸溶液作為提取溶劑，低溫提取菜用大豆鮮籽粒中VC，操作簡便，可避免樣品中VC 被氧化和其他基質(zhì)成分的干擾。從穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)可以看出，8 h 內(nèi)VC 含量變化不顯著，能夠保證樣品和對照品溶液在測定的時間內(nèi)穩(wěn)定。供試樣品色譜峰對稱性良好，既能達(dá)到基線分離的要求，又有適宜的保留時間，測定結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確，且靈敏度高。綜上所述，該方法適用于測定菜用大豆鮮籽粒中VC含量。