水稻紋枯病田間抗性鑒定體系及種質(zhì)資源篩選研究

摘 要：水稻是我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)作物之一，我國(guó)60%以上的居民以稻米為主食，且隨著人口數(shù)量不斷增多，人類對(duì)糧食的產(chǎn)量需求也不斷增加。當(dāng)前，水稻紋枯病發(fā)病情況日趨嚴(yán)峻，對(duì)水稻產(chǎn)量造成了巨大影響。因此，開(kāi)展水稻紋枯病抗性種質(zhì)資源的篩選，探索高效水稻紋枯病田間抗性鑒定方法，對(duì)水稻紋枯病抗病新品種的育種工作具有重要意義，能夠?yàn)榭剐云贩N選育提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。基于此，闡述了水稻紋枯病病癥及危害，探究了水稻紋枯病田間鑒定體系的構(gòu)建，論述了水稻紋枯病抗源篩選及抗性種質(zhì)創(chuàng)新。

關(guān)鍵詞：水稻紋枯??；田間抗性鑒定；種質(zhì)資源

中圖分類號(hào)：S435.111 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：2095–3305（2024）12–00-03

水稻是世界主要糧食作物之一，也是全球超過(guò)50%人口每日最主要的主食，在種植范圍上僅次于小麥，也是僅次于小麥的第二大廣泛種植的糧食作物。紋枯病是由立枯絲核菌引起的水稻三大病害之一，該病可使水稻產(chǎn)量損失10%～30%，極端情況下?lián)p失甚至可高達(dá)半數(shù)。

魏京超于1934年首次記錄了紋枯病，水稻感染該病害后會(huì)出現(xiàn)米粒不飽滿、容易倒伏等現(xiàn)象，該病害主要分布在華南地區(qū)的高溫高濕地區(qū)，對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)均產(chǎn)生了極大的影響，已經(jīng)成為中國(guó)南方地區(qū)面臨的最嚴(yán)重的水稻病害之一[1]。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)14種不同的立枯絲核菌的菌絲融合群體，它們對(duì)同一種植物的侵害會(huì)造成不同的病癥。病害通常源自作物根部，隨后菌絲體通過(guò)葉鞘擴(kuò)散，決定病害嚴(yán)重性的不僅是病菌數(shù)量，還包括溫濕度以及作物的生長(zhǎng)高度和生育周期。水稻紋枯病的發(fā)病情況受到多種因素的影響，因此構(gòu)建完整的水稻紋枯病田間抗性鑒定體系，是培育抗病品種的關(guān)鍵。

1 水稻紋枯病病癥及危害

1.1 水稻紋枯病的發(fā)病癥狀

水稻從秧苗期到抽穗期均有感染水稻紋枯病的可能，該病害主要發(fā)生在水稻分蘗末期。水稻紋枯病病菌侵染植物可分為以下三個(gè)發(fā)展階段。

一是發(fā)病初期，水稻植株靠近水面的葉鞘部位會(huì)出現(xiàn)深綠色、類似水浸狀的細(xì)小斑塊；隨后，隨著侵染持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，這些斑點(diǎn)不斷擴(kuò)散，顏色也會(huì)從灰褐漸變?yōu)榛野?，患病的植株?shù)量開(kāi)始增加。

二是病情加劇至嚴(yán)重時(shí)期，許多小斑塊會(huì)融合成類似云紋的大斑塊，并蔓延至整片葉面及其附近的稻株葉片，引起葉子黃化枯死，提高植株受感染的可能性，導(dǎo)致患病植株的比例急劇上升。

三是發(fā)病末期，葉片開(kāi)始逐漸腐爛且腐爛現(xiàn)象較為明顯，根莖部位出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致水稻植株倒伏，使得植株中運(yùn)輸水分和無(wú)機(jī)鹽的輸導(dǎo)組織被破壞，

最終水稻植株受因合作用速率降低等而死亡。

1.2 水稻紋枯病的危害

陳德權(quán)[2]研究表明，水稻紋枯病對(duì)水稻產(chǎn)量影響大，空育131病情指數(shù)最高，產(chǎn)量損失最高可達(dá)到28.29%。桑海旭等[3]在研究中發(fā)現(xiàn)水稻紋枯病不但影響水稻的產(chǎn)量，還影響水稻光亮度、透明度等外觀性狀，谷粒厚度以及稻米加工品質(zhì)。2024年水稻紋枯病全國(guó)發(fā)生面積高達(dá)1 500.0萬(wàn)hm2[4]。這反映出紋枯病已成為水稻主要病害之一，嚴(yán)重影響水稻品質(zhì)等，會(huì)導(dǎo)致水稻結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量大幅降低，影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

2 水稻紋枯病田間鑒定體系的構(gòu)建

2.1 田間鑒定方法

當(dāng)前，水稻紋枯病抗性鑒定技術(shù)的體系較為完善，

大量試驗(yàn)結(jié)果顯示，水稻在自然生長(zhǎng)環(huán)境條件下的生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，適合田間種植，且此條件下抗性評(píng)價(jià)指標(biāo)數(shù)據(jù)具有較強(qiáng)的準(zhǔn)確性和可靠性。潘學(xué)彪等[5]采用5種不同的水稻紋枯病抗性接種方法，探討了這5種不同的接種方式對(duì)水稻紋枯病遺傳特性的影響，具體如下。

2.1.1 撒施法

按照一份稻谷搭配兩份稻殼的配比進(jìn)行混合，置入錐形瓶中進(jìn)行無(wú)菌接種，之后培養(yǎng)15～20 d，直至瓶?jī)?nèi)充滿菌絲并形成菌核。再經(jīng)過(guò)3 d的增殖培養(yǎng)，將其均勻施撒在水稻植株的根部周圍，接種量約為30 mL/m行長(zhǎng)。

2.1.2 捆扎法

將經(jīng)過(guò)消毒處理15 cm的稻稈放入培養(yǎng)瓶中培育約10 d，待稻稈表面密布菌落后，用于農(nóng)田接種。將長(zhǎng)滿菌絲的稻稈置于稻植株中央部位，每株稻植株根部放一段短稻稈，并用膠帶固定在大部分稻莖上，利用繩子或膠帶將稻稈與植株捆扎在一起，在種植7～10 d后撤掉膠帶或松開(kāi)繩子，使水稻恢復(fù)自然的生長(zhǎng)狀態(tài)。

2.1.3 外貼法

利用膠帶將按照前述步驟處理過(guò)的牙簽緊貼于水稻作物的基部區(qū)域，每一叢植株接種三根牙簽，且接種處位于水平面以上大約2 cm的高度。為了驗(yàn)證牙簽攜帶的病菌情況，各取100根經(jīng)過(guò)接種處理的短牙簽，將其放置在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果顯示，每根牙簽周邊都出現(xiàn)了菌落生長(zhǎng)，牙簽的攜菌率達(dá)到100%。

2.1.4 注射法

在28 ℃條件下的PSA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)紋枯病病原菌，48 h后去除其菌核，在研缽中將其研磨為乳白色液體。利用注射器準(zhǔn)確注入0.25 mL該菌液至初期抽穗期倒三葉鞘的莖稈內(nèi)部。

2.1.5 牙簽嵌入法

將木質(zhì)的牙簽裁剪成0.8～1.0 cm，將其均勻地?cái)[放在培養(yǎng)皿底部，加入適量的PDA營(yíng)養(yǎng)液，確保液位剛好沒(méi)過(guò)牙簽。高溫消毒培養(yǎng)基后進(jìn)行接種，并維持

3 d，待菌絲遍布整個(gè)培養(yǎng)基表面時(shí)，進(jìn)行下一輪的純種擴(kuò)增培養(yǎng)。每株水稻植株需接種3根莖稈，用鑷子將牙簽插入每株的倒三葉鞘內(nèi)部，同時(shí)標(biāo)記所接種的莖稈部位。接種完成后，水稻仍可自然生長(zhǎng)。

撒施法的操作簡(jiǎn)易、方便，并在抗病品種培育過(guò)程中，對(duì)抗性或抗病性植物進(jìn)行初期篩查極為有效，但撒施法不適用于高精度的抗性研究。捆扎法和外貼法經(jīng)試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)仍存在諸多不足，目前基本不使用。注射法取得了較好的接種效果，但此方法較為煩瑣，需要投入較多的時(shí)間。牙簽嵌入法同樣獲得較為理想的實(shí)驗(yàn)效果，特別適用于對(duì)精確性要求較高的抗病遺傳學(xué)研究。該方法的顯著優(yōu)勢(shì)在于能夠?yàn)椴≡鷦?chuàng)造最優(yōu)的微環(huán)境，確保感病品種表現(xiàn)出適度的發(fā)病程度，以及不同品種的抗性和感病性差異極為突出。然而，采用牙簽嵌入法的工作量相對(duì)較大，如勞動(dòng)力不足，將難以在短時(shí)間內(nèi)完成大批量接種，這可能會(huì)干擾病情發(fā)展的同步性和試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，研究和發(fā)展新型接種方法以提高工作效率，對(duì)研究水稻紋枯病抗性的遺傳育種具有重要意義。

2.2 接種時(shí)期和調(diào)查時(shí)期

接種時(shí)期和病情調(diào)查時(shí)期是水稻紋枯病田間抗性鑒定體系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，能夠真實(shí)地反映水稻紋枯病抗性水平，同時(shí)得到更精確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。左示敏等[6]指出盡管水稻可在任何時(shí)期受到水稻紋枯病病原菌的侵染，但是田間水稻紋枯病主要存在兩個(gè)危害時(shí)期：一是在分蘗末期，由于水稻群體存在封行“假象”，濕度大且郁閉度較大，此時(shí)期接種發(fā)病迅速，有利于發(fā)??；二是自孕穗期起至抽穗期前后，這一時(shí)期水稻發(fā)病十分迅速，病情調(diào)查應(yīng)選擇在感病對(duì)照植株開(kāi)始死亡且在病情基本穩(wěn)定時(shí)，其中病情基本穩(wěn)定時(shí)期常在抽穗后15～30 d，病原菌菌絲擴(kuò)展速度較慢且水稻植株群體整體普遍老化，因此應(yīng)在抽穗期30 d前后開(kāi)展病情調(diào)查工作，目前在已經(jīng)研究的報(bào)道中多數(shù)學(xué)者選擇在此期間進(jìn)行病情調(diào)查，獲取的數(shù)據(jù)較為科學(xué)且合理。

2.3 鑒定標(biāo)準(zhǔn)及調(diào)查指標(biāo)

水稻紋枯病田間發(fā)病等級(jí)的鑒定主要采用鄭君海等[7]提出的0～9級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，2006年左示敏等在此標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上結(jié)合已有的QTL評(píng)價(jià)、精細(xì)定位及克隆研究對(duì)其進(jìn)行了完善，常適用于水稻紋枯病田間抗性鑒定體系。作為改進(jìn)后的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，該方法使鑒定結(jié)果更加精準(zhǔn)。

目前水稻紋枯病抗性鑒定指標(biāo)中，病級(jí)指數(shù)應(yīng)用最為廣泛，這也是最基本的考察指標(biāo)。1992年陳志誼等[8]提出以葉片蠟質(zhì)含量為指標(biāo)評(píng)價(jià)品種抗性，該指標(biāo)與病情指數(shù)呈顯著的負(fù)相關(guān)；潘學(xué)彪等[9]提出以相對(duì)病斑高度和絕對(duì)病斑高度為抗性指標(biāo)，其中相對(duì)病斑高度計(jì)算方法為（病斑高度/該病斑所在莖稈的劍葉葉枕高度），病斑上界至土表距離為絕對(duì)病斑高度的計(jì)算方式。在多數(shù)田間抗性鑒定的試驗(yàn)中，通常將部分抗性指標(biāo)結(jié)合應(yīng)用，從而增強(qiáng)鑒定結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

3 水稻紋枯病抗源篩選及抗性種質(zhì)創(chuàng)新

3.1 抗性種質(zhì)資源篩選

不同水稻品種在抗病性方面存在明顯的差異，抗性種質(zhì)資源是抗性育種的前提，而培養(yǎng)抗病品種是增強(qiáng)抗性育種效果的核心。因此，挖掘抗病性資源對(duì)水稻紋枯病的有效防治具有至關(guān)重要的作用。

易崇粉等[10]在水稻分蘗期，對(duì)貴州省758份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行離體葉片接種，鑒定結(jié)果表明大部分為高感材料，極少部分為中抗材料，無(wú)免疫或高抗材料。徐羨明等[11]鑒定2021份普通野生稻種質(zhì)資源對(duì)紋枯病的抗性情況，鑒定結(jié)果表明中抗及以上的僅有23份，品種數(shù)占比為1.14%。

在2001—2005年，陳志誼等[12]對(duì)808份江蘇省水稻區(qū)的試驗(yàn)品種進(jìn)行抗性研究，鑒定結(jié)果表明被測(cè)的各種水稻類型中，在防御稻瘟病方面秈稻優(yōu)于粳稻，而大部分水稻品種（系）對(duì)紋枯病的抗性較差。劉曉梅等[13]對(duì)收集的86份吉林省主栽水稻品種進(jìn)行了紋枯病鑒定，明確其對(duì)該病的抗性表現(xiàn)。具體表現(xiàn)為抗病品種僅有5份，占參試品種的5.8%。

劉毅[14]對(duì)選自中國(guó)的159份水稻微核心種質(zhì)資源和取自“全球水稻分子育種”計(jì)劃的137份親本資源，共計(jì)296個(gè)水稻樣本開(kāi)展了紋枯病抗性鑒定。在檢測(cè)的樣本中，僅有4個(gè)品種顯示出抗病，約占全體樣本的1.4%，同時(shí)有68個(gè)具有中等抗病能力的品種，占樣本總數(shù)的23%。

過(guò)崇儉等[15]對(duì)72 208個(gè)水稻品種或品系進(jìn)行了抗性測(cè)定試驗(yàn)，卻未發(fā)現(xiàn)任何一個(gè)品種或品系表現(xiàn)出高度抗病或完全免疫的特點(diǎn)，只有少數(shù)表現(xiàn)為中等抗性，同時(shí)超過(guò)95%的品種或品系表現(xiàn)為中感或高感。綜合抗性資源篩選結(jié)果表明：水稻紋枯病高抗資源較少，大多數(shù)為中抗品種（系），導(dǎo)致水稻整體抗性親本選擇資源較為缺乏，抗性育種進(jìn)程緩慢，因此需要獲得更為理想的抗性種質(zhì)，挖掘高抗水稻種質(zhì)資源，這對(duì)抗性種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。

3.2 抗性種質(zhì)創(chuàng)新

毛碧增等[16]將從水稻中克隆出的幾丁質(zhì)酶基因和從苜蓿中克隆的葡聚糖酶基因同時(shí)置于載體上，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入水稻秀水11和臺(tái)北309中，結(jié)果顯示獲得了具有抗性T1代植株，有助于進(jìn)一步進(jìn)行水稻抗性遺傳分析。

何登驥等[17]的研究表明已成功將對(duì)水稻紋枯病菌表現(xiàn)出高抗性的野生茭白的抗性基因片段導(dǎo)入感病材料秈型水稻品種“90519”中，培育成抗紋枯病水稻新品系“4011”，此過(guò)程中應(yīng)用花粉管通道法。

2009年左示敏等[18]從秈粳交后代群體中篩選了一份抗紋枯病水稻新種質(zhì)YSBR1，試驗(yàn)結(jié)果表明新種質(zhì)抗性明顯優(yōu)于其他參試品種，在田間接種試驗(yàn)中水稻紋枯病病級(jí)平均在2.39±0.23級(jí)，且長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良，達(dá)到“抗病”水平。

2014年左示敏等[19]的研究結(jié)果顯示，在299份水稻品種通過(guò)溫室苗期紋枯病菌接種鑒定中，共選出7份抗病新種質(zhì)，抗性高于YSBR1且接近高抗水平的品種有1份，擁有可靠的應(yīng)用前景。

已有研究結(jié)果顯示，在67份全世界的野生水稻種質(zhì)中，篩選出具有較強(qiáng)的抗紋枯病、抗倒伏能力的高稈野生稻，并在高稈野生稻中鑒定出部分R基因[20]。獲得的穩(wěn)定性高、可靠性強(qiáng)且具有較高抗性水平的抗性種質(zhì)資源，可為水稻紋枯病的抗性育種提供新的材料。

4 結(jié)束語(yǔ)

水稻紋枯病給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失，科學(xué)有效的田間鑒定方法和評(píng)價(jià)體系可為抗性品種的親本選擇提供技術(shù)支持，同時(shí)也為水稻紋枯病抗性分子機(jī)理研究提供可靠的分析數(shù)據(jù)。如何采用多種手段來(lái)開(kāi)展水稻紋枯病高抗種質(zhì)創(chuàng)新是紋枯病抗性研究中亟待解決的問(wèn)題。隨著轉(zhuǎn)錄組、代謝組等組學(xué)的應(yīng)用分析，可深入挖掘主效基因和重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為水稻紋枯病抗性材料的分子育種提供新的途徑。

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收稿日期：2024-09-11

基金項(xiàng)目：2023年度黑龍江省省屬本科高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（2023-KYYWF-0642）。

作者簡(jiǎn)介：張宏亮（2000—），男，黑龍江佳木斯人，研究方向?yàn)楹厮炯y枯病。#通信作者：李修平（1981—），女，山東萊西人，教授，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種，E-mail：lixiuping200@163.com。