不同發(fā)酵劑對玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)及微生物多樣性的影響

佘 龍

(商洛市藥品檢驗所,陜西 商洛 726099)

隨著我國畜牧業(yè)規(guī)模的擴大,蛋白飼料出現(xiàn)短缺,而如何解決蛋白飼料短缺成為人們關(guān)注的重點[1-2]。目前,傳統(tǒng)的方式是對秸稈、豆渣、蘋果渣、馬鈴薯薯渣等飼料進(jìn)行發(fā)酵,以降低飼料中粗纖維的含量,提高飼料中的粗蛋白含量[3-5]。研究發(fā)現(xiàn),對玉米秸稈進(jìn)行青貯可降解纖維素或者木質(zhì)素,但直接對玉米秸稈進(jìn)行青貯,會出現(xiàn)發(fā)酵品質(zhì)不穩(wěn)定,甚至出現(xiàn)變質(zhì)。為解決該問題,往往會在發(fā)酵過程中添加一些發(fā)酵劑,如乳酸菌和碳源物質(zhì)等[6-7]。通過這些發(fā)酵劑,促進(jìn)微生物的生長,提升發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌群的數(shù)量和發(fā)酵品質(zhì)。本研究以玉米秸稈發(fā)酵為研究對象,將不同發(fā)酵劑添加至玉米秸稈中,進(jìn)而分析玉米秸稈的青貯品質(zhì)和微生物菌群變化,為改善發(fā)酵飼料的品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要原材料

玉米秸稈(購自農(nóng)戶,長度為2～3 cm);植物乳酸菌(活菌數(shù)100億CFU/g),濟南榮正化工;酵母菌(99%),廣西農(nóng)保生物工程;纖維素酶(酶活≥30 000 U/g),南寧東恒華道生物科技;木質(zhì)素酶(酶活≥20 000 U/g),南寧東恒華道生物科技。

1.2 實驗方案設(shè)計

采用試驗對比的方式,將試驗分為三組,其中A組作為空白組,B組添加植物乳酸菌、纖維素酶和木質(zhì)素酶,C組添加植物乳酸菌、酵母菌、木質(zhì)素酶、纖維素酶。其中,添加比例按照每1 kg玉米秸稈中添加1 g纖維素酶和木質(zhì)素酶,添加植物乳酸菌和酵母菌為0.02 g。

具體試驗步驟為:首先將玉米秸稈切碎,然后添加適量的水與秸稈混勻,并控制玉米秸稈的含水量在58%～62%;混勻后,將玉米秸稈放入30 cm×45 cm的聚乙烯青貯袋中發(fā)酵,每個聚乙烯青貯袋中裝600 g的玉米秸稈,以及通過真空密封方式在室溫下發(fā)酵45 d;根據(jù)試驗組設(shè)置3個平行試驗,試驗后取樣,對不同試驗組玉米秸稈的營養(yǎng)成分、微生物群落等進(jìn)行測定分析。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1營養(yǎng)成分測定

取出三個試驗組發(fā)酵后的玉米秸稈250 g,平攤在托盤中進(jìn)行鼓風(fēng)干燥。其中,先在105℃的溫度下進(jìn)行酶滅活,然后降低到65℃后繼續(xù)干燥,至恒重后進(jìn)行營養(yǎng)成分的測定,包括粗蛋白含量、粗灰分含量、干物質(zhì)含量、中性洗滌纖維含量、酸性洗滌纖維含量、粗纖維含量。

1.3.2pH值與發(fā)酵品質(zhì)測定

取三個試驗組玉米秸稈樣品10 g,加入90 mL蒸餾水在4℃的溫度下浸提24 h,然后用紗布過濾得濾液,即為玉米秸稈發(fā)酵樣品的浸提液。分別對浸提液的pH值、乳酸(LA)含量、丁酸(BA)含量、丙酸(PA)含量、乙酸(AA)含量、銨態(tài)氮含量進(jìn)行測定。其中,pH值采用酸度計測定,采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定發(fā)酵玉米秸稈中的氨態(tài)氮含量,其余用高效液相色譜法測定上述酸的含量。

1.3.3微生物多樣性測定

取三個試驗組玉米秸稈樣品10 g,然后通過DNA提取試劑盒提取微生物組的DNA;測定DNA的純度和濃度后,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,采用PCR擴增細(xì)菌16S rDNA,上游引物的核苷酸序列為(5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'),下游引物的核苷酸序列為(5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3')。對擴增產(chǎn)物進(jìn)行純化后,并使用實時熒光定量PCR儀進(jìn)行定量,將純化的擴增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合,連接測序接頭,構(gòu)建測序文庫,采用Hiseq2500測序儀上機測序[8]。

測序后,得到不同發(fā)酵劑發(fā)酵玉米秸稈的原始數(shù)據(jù),過濾掉其中的低質(zhì)量數(shù)據(jù)后進(jìn)行序列拼接、序列去嵌合體等處理,得優(yōu)化后的序列[9]。對優(yōu)化后的各組樣品序列進(jìn)行一致性檢驗,聚類得操作分類單元(OTU),然后通過Omicsmart在線平臺分析微生物相對豐度,并進(jìn)行Alpha多樣性分析、OTU分析和微生物群落結(jié)構(gòu)分析[10]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行整理后,通過SPSS19.0進(jìn)行分析,結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示;以P<0.05為顯著差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵劑對發(fā)酵玉米秸稈營養(yǎng)成分的影響

不同發(fā)酵劑的玉米秸稈營養(yǎng)成分見表1。

表1 不同發(fā)酵劑的玉米秸稈營養(yǎng)成分

由表1可知,與A組空白組相比,B組和C組發(fā)酵玉米秸稈的干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪含量顯著提高;B組和C組發(fā)酵玉米秸稈在粗纖維質(zhì)量占比、酸性洗滌纖維質(zhì)量占比、中性洗滌纖維質(zhì)量占比等方面,相比于A組空白組顯著降低。

2.2 不同發(fā)酵劑對玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)的影響

不同發(fā)酵劑的玉米秸稈的發(fā)酵品質(zhì)測定結(jié)果見表2。由表2可知,C組發(fā)酵的玉米秸稈品質(zhì)最好,其中乳酸和乙酸含量顯著提高,且銨態(tài)氮/全氮的比值降低。

表2 不同發(fā)酵劑的玉米秸稈的發(fā)酵品質(zhì)

2.3 不同發(fā)酵劑的發(fā)酵玉米秸稈微生物多樣性

2.3.1Alpha多樣性分析

對三組發(fā)酵玉米秸稈進(jìn)行Alpha多樣性分析,其結(jié)果見表3。由表3可見,三組的覆蓋度均大于0.99。相比于A組,B組、C組的Simpson指數(shù)降低,說明玉米秸稈發(fā)酵飼料中的菌群多樣性降低;Ace指數(shù)和Chao指數(shù)降低,說明玉米秸稈發(fā)酵飼料中的菌群豐度降低,這是由于添加的植物乳酸菌、酵母菌的生長,影響了發(fā)酵體系中的微生物體系,抑制了一些微生物的生長。由此可以得出結(jié)論,在玉米秸稈發(fā)酵過程中添加植物乳酸菌、酵母菌、纖維素酶和木質(zhì)素酶對微生物的菌群多樣性產(chǎn)生影響。

表3 不同發(fā)酵劑的發(fā)酵玉米秸稈飼料Alpha多樣性

2.3.2微生物群落結(jié)構(gòu)分析

通過測定,得到A組空白組的優(yōu)勢菌群所在屬主要包括魏斯氏菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬,屬的相對豐度依次為58.24%、17.26%、6.13%,B組(添加纖維素酶和木質(zhì)素酶)優(yōu)勢菌群所在屬主要包括腸球菌屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬,屬的相對豐度依次為40.17%、35.19%、12.64%;C組(植物乳酸菌、酵母菌、纖維素酶和木質(zhì)素酶)的優(yōu)勢菌群所在屬主要包括腸球菌屬、乳桿菌屬和酵母菌屬,屬的相對豐度分別依次為52.56%、20.68%、9.71%。

3 討論

粗蛋白含量是評價發(fā)酵玉米秸稈飼料的主要指標(biāo)之一。在本試驗中,B組和C組發(fā)酵玉米秸稈的粗蛋白含量在一定程度上有所增加,說明玉米秸稈發(fā)酵后其粗蛋白含量有所提高。其中B組和C組發(fā)酵玉米秸稈的干物質(zhì)含量的增加主要是由于發(fā)酵過程中添加了乳酸菌,產(chǎn)生了乳酸,抑制了雜菌的生長,在一定程度上減少了發(fā)酵過程中的干物質(zhì)的損失,與學(xué)者張新平的研究結(jié)果一致[11]。

B組和C組發(fā)酵玉米秸稈的可溶性碳水化合物質(zhì)量占比在一定程度上提高,是由于發(fā)酵過程中酵母菌和乳酸菌的增殖,提高了發(fā)酵品質(zhì)。

B組和C組的發(fā)酵玉米秸稈的粗纖維質(zhì)量占比、酸性洗滌纖維質(zhì)量占比、中性洗滌纖維質(zhì)量占比降低,是由于發(fā)酵過程中添加的纖維素酶和木質(zhì)素酶對玉米秸稈中的纖維素和木質(zhì)素進(jìn)行了降解,這與任海偉等[12-13]研究結(jié)果一致,主要是因為纖維素酶的添加破壞了纖維素間的氫鍵,生成了單糖,也可能是由于較低的pH值造成的酸性環(huán)境促進(jìn)了細(xì)胞壁成分的酸解[14]。

發(fā)酵玉米秸稈飼料發(fā)酵品質(zhì)的衡量指標(biāo)還包括有機酸和pH值。B組和C組的發(fā)酵玉米秸稈飼料pH值處于4.12～4.13,說明發(fā)酵玉米秸稈飼料的品質(zhì)較好;B組(添加植物乳酸菌、酵母菌和纖維素酶)和C組(植物乳酸菌、酵母菌、纖維素酶和木質(zhì)素酶)均額外添加了乳酸菌,乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸,所以發(fā)酵玉米秸稈飼料的乳酸含量高,口感好。其中,C組的乳酸含量最高,說明植物乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵過程中可能存在協(xié)同增強作用;同時丁酸的含量越高,說明發(fā)酵玉米秸稈的品質(zhì)愈加不好,但是各組均未檢測出丁酸,說明發(fā)酵玉米秸稈的品質(zhì)好;銨態(tài)氮/全氮的比值代表了發(fā)酵玉米秸稈飼料中的銨態(tài)氮的含量,各組的銨態(tài)氮/全氮的比值低說明發(fā)酵玉米秸稈飼料的品質(zhì)好。B組和C組的銨態(tài)氮/全氮的比值顯著低于A組空白組,這主要是A組在玉米秸稈發(fā)酵過程中未額外添加菌株和酶類,且發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有害微生物較多,從而產(chǎn)生的銨態(tài)氮多。

在微生物多樣性方面,由于發(fā)酵過程中的微生物體系比較復(fù)雜,各種微生物共存,微生物的多樣性和屬的豐度直接影響著玉米秸稈的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)成分。研究過程中,對添加不同發(fā)酵劑組的微生物Alpha多樣性和屬水平的相對豐度進(jìn)行了研究。Alpha多樣性分析的覆蓋度均在0.99以上,可知發(fā)酵過程中發(fā)酵劑的添加對微生物的群落結(jié)構(gòu)確實產(chǎn)生了影響。B組和C組的乳酸菌成為優(yōu)勢菌群,產(chǎn)生乳酸的能力強,進(jìn)一步抑制了玉米秸稈發(fā)酵過程中有害微生物的繁殖。

4 結(jié)論

本研究通過添加不同的發(fā)酵劑發(fā)酵玉米秸稈,得到在發(fā)酵玉米秸稈中添加植物乳酸菌、酵母菌、纖維素酶和木質(zhì)素酶的發(fā)酵效果最佳,發(fā)酵玉米秸稈的營養(yǎng)價值高,發(fā)酵品質(zhì)好。