不同品種糙米酚類物質(zhì)抗氧化及體外降血糖活性評價

杜昭換,姜忠麗,趙秀紅

(沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院,遼寧 沈陽 110034)

酚類物質(zhì)是廣泛存在于植物組織中的一類植物化學(xué)物質(zhì)。目前已報道酚類具有抗氧化、抑菌、降血脂、降血糖、降低農(nóng)藥對機體毒性、吸收紫外線和結(jié)合金屬離子等功效[1]。生物體內(nèi)自由基過多堆積造成的氧化損害,是導(dǎo)致生物衰老和誘發(fā)Ⅱ型糖尿病等相關(guān)代謝性疾病的重要原因[2]。研究表明,具有抗氧化活性的物質(zhì),能有效清除體內(nèi)多余的自由基,減少活性物質(zhì)對細胞的氧化損害,預(yù)防多種疾病的發(fā)生[3]。糖尿病是一種慢性代謝紊亂疾病,其特點是血糖過高,常因胰島素分泌不足或胰島素作用障礙而引起,而抑制消化酶的活性可減緩餐后血糖水平的提高,是治療糖尿病的有效手段之一。臨床上常通過檢測消化酶的活性抑制作用,用于初步判斷藥物是否具有降糖活性,并將降糖藥物和具有降糖作用的食物作為預(yù)防、改善糖尿病的重要措施之一[4]。

糙米是稻谷經(jīng)加工脫殼后的產(chǎn)品。與精米相比,糙米中的酚酸等生物活性物質(zhì)含量更高。這些生物活性物質(zhì)具有抗氧化[5]、抑菌[6]、消炎[7]及抗病毒[8]等功效。糙米多酚降血糖的臨床研究雖已有報道,但其與品種差異是否有關(guān)尚未見報道。

對比遼寧地區(qū)4個品種糙米的多酚、黃酮含量以及抑制DPPH·、超氧陰離子自由基、ABTS+·能力和葡萄糖苷酶、淀粉酶抑制活性的差異,在此基礎(chǔ)上進一步分析糙米多酚含量與其抗氧化能力和體外降糖能力的關(guān)系,探討糙米多酚抗氧化與降糖作用的關(guān)系,以期為闡明糙米多酚降血糖的機理提供一定研究思路,并為今后糙米的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料:挑選4個品種糙米,粉碎過40目篩,糙米粉備用。4個品種分別是小粒香、Type-619、軟米和龍粳,遼寧盛寶米業(yè)提供。

主要試劑:石油醚,天津市富宇精細化工公司;纖維素酶、福林酚試劑、PNPG,上海瑞永生物科技;檸檬酸、檸檬酸鈉,沈陽東興試劑廠;沒食子酸,南京源值生物有限公司;DPPH(1,2-二苦基-2-三硝基苯亞肼)、ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)、抗壞血酸,上海藍季生物發(fā)展有限公司;過硫酸鉀、葡萄糖苷酶、淀粉酶,天津市大茂化學(xué)試劑廠;HCl、阿卡波糖、DNS(3,5-二硝基水楊酸),國藥集團;Tris,北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司;鄰苯三酚,合肥巴斯夫生物科技有限公司;無水乙醇,恒興試劑;淀粉,上海麥克林生化科技有限公司;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀,沈陽市新西試劑廠。

1.2 儀器設(shè)備

ESJ120-4B電子分析天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-1200S分光儀,翱藝儀器(上海)有限公司;200T粉碎機,永康市鉑歐五金制品有限公司;HG-9146A鼓風干燥箱,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;15A481超聲清洗器,寧波新芝生物有限公司;冷凍離心機,阿凡提·貝克曼庫爾特股份有限公司;ZQPW-70恒溫振蕩保溫箱,天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司;HH-6恒溫水浴鍋,上海皓莊儀器有限公司;Scientz-12N冷凍烘干機,寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1糙米中多酚含量的測定

根據(jù)姜忠麗等[9]的方法提取糙米多酚。具體方法如下:準確稱量脫脂糙米粉末1.0 g,并將緩沖液(檸檬酸-檸檬酸鈉溶液pH5.4)預(yù)熱。在樣品中依次加入1.0 g×0.5%纖維素酶和30 mL緩沖溶液,超聲(350 W、55℃、10 min)后以3 500 r/min的條件將提取液冷卻離心15 min取上清液,保存于-18℃冰箱。

多酚含量的測定采用福林-酚[10]法。配制0～5.0 μg/mL沒食子酸溶液,0.5 mL糙米樣品多酚萃取液或沒食子酸溶液,1.0 mL福林酚,Na2CO3(15%、2.0 mL)溶液,避光反應(yīng)2 h,于760 nm處測吸光度。其中X=0.016P-0.002 6,R2=0.999 8,X為吸光度,P為質(zhì)量濃度(μg/mL)。

糙米中多酚含量的計算公式:

式中:W為糙米多酚含量,mg/g;C為樣品中酚類質(zhì)量濃度,μg/mL;V1為稀釋的體積,mL;V2為待測液體積,mL;M為糙米粉的質(zhì)量,g;V3為取樣體積,mL。

1.3.2糙米中黃酮含量的測定

標準溶液配制:精確稱量蘆丁標準品10 mg,加少量30%乙醇溶解,超聲2 min溶化試樣,用乙醇定容于50 mL容量瓶中,即得蘆丁標準液0.2 mg/mL。

標準曲線制作:蘆丁標準液分別取0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL裝在25 mL容量瓶中,各加5%亞硝酸鈉0.7 mL搖勻,靜置5 min,加入10%硝酸鋁0.7 mL搖勻,放置6 min后加入1%氫氧化鈉5 mL,最后用30%乙醇定容至25 mL。靜置10 min,在510 nm下用試劑空白作參比,進行吸光度測定,并繪制標準曲線。得到回歸方程A=10.23C-0.017,R2=0.998。

根據(jù)姜忠麗等[11]的研究方法測定糙米中的黃酮含量。

1.3.3抗氧化試驗

1.3.3.1清除DPPH自由基能力測定[12]

配制0.2 mmol/L DPPH溶液并將吸光度值調(diào)至0.60±0.02,分別取2 mL糙米多酚提取液和2 mL DPPH溶液避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測吸光度。陽性對照為抗壞血酸。

式中:R1為DPPH自由基清除率;A1為待測溶液吸光度;A2為乙醇替代DPPH吸光度;A0為水替代樣液吸光度。

1.3.3.2超氧陰離子自由基清除率測定[13]

取糙米各提取物0.1 mL,添加0.1 mol/L pH 8.2的三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖溶液2.8 mL,混勻。25℃水浴10 min,加入3 mmol/L沒食子酚(焦性沒食子酸)溶液0.1 mL,每30 s于325 nm波長處測定一次吸光度值,連續(xù)測定5 min,記錄數(shù)據(jù),繪制其回歸方程,空白對照為蒸餾水,陽性對照為抗壞血酸。計算公式如下:

式中:R2為超氧陰離子自由基清除率;Va為蒸餾水斜率;Vb為樣品斜率。

1.3.3.3ABTS陽離子自由基清除率測定[14]

取7.4 mmol/L的ABTS原液與等量2.45 mmol/L的過硫酸鉀混合,在黑暗中放置12～16 h,用無水乙醇稀釋ABTS溶液至734 nm波長吸光度0.70±0.02,得到ABTS工作液。在4.0 mL ABTS工作液中加入1.0 mL糙米粗提液混合均勻,常溫下在暗處反應(yīng)6 min后,立即測定734 nm處吸光度。對照組選用抗壞血酸。糙米多酚粗提液對ABTS自由基清除率計算公式如下:

式中:R3為ABTS陽離子自由基清除率;A1為樣品吸光度;A2為水代替ABTS的吸光度;A0為水代替樣液的吸光度。

1.3.4體外降糖試驗

1.3.4.1葡萄糖苷酶活性抑制試驗[15]

取0.5 mL待測溶液或阿卡波糖與0.5 mL葡萄糖苷酶溶液(1.5 U/mL)混合,37℃下反應(yīng)10 min。將混合液加入0.5 mL、1 mmol/L PNPG反應(yīng)15 min后與2 mL、1 mol/L碳酸鈉溶液混合,并用PBS定容至5 mL,在沸水浴中反應(yīng)5 min后立即冷卻。于405 nm處檢測吸光度。阿卡波糖作為對照物。葡萄糖苷酶活性抑制率公式如下:

式中:X1為葡萄糖苷酶活性抑制率;A1為待測溶液吸光度;A2為PBS替代葡萄糖苷酶吸光度;A0為PBS替代樣液吸光度。

1.3.4.2淀粉酶活性抑制試驗[16]

將0.5 mL待測溶液或阿卡波糖與0.5 mL的淀粉酶溶液(2 U/mL)混合,在37 ℃條件下反應(yīng)10 min。將混合液加入0.5 mL、1%的淀粉溶液反應(yīng)10 min并與0.5 mL二硝基水楊酸(DNS)混合,用PBS定容混合物攪拌至相應(yīng)體積,沸騰反應(yīng)5 min后立即冷卻。于540 nm處對吸光度進行檢測。其中對照物為阿卡波糖,實驗每組重復(fù)3次。淀粉酶活性抑制率公式如下:

式中:X2為淀粉酶活性抑制率;A1為待測溶液吸光度;A2為PBS替代淀粉酶吸光度;A0為PBS替代樣液吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種糙米多酚和黃酮含量

不同品種糙米多酚含量比較見圖1。由圖1可知,糙米中的多酚類物質(zhì)含量因其品種的不同而有所差異,其中軟米和小粒香亦達到顯著水平(P<0.05)。4個品種糙米多酚含量從高到低依次為軟米>小粒香>Type-619>龍粳。該結(jié)果可能與其品種和生長情況有關(guān)。

圖1 不同品種糙米多酚含量對比

不同品種糙米黃酮含量對比見圖2。由圖2可知,4個品種糙米黃酮含量從高到低依次仍然為軟米>小粒香>Type-619>龍粳。結(jié)合圖1和圖2可知,軟米的多酚含量為8.33 mg/g,龍粳的多酚含量為4.81 mg/g,兩者相差較大;而軟米的黃酮含量為3.35 mg/g,龍粳的黃酮含量為2.89 mg/g,兩者相差較小。

圖2 不同品種糙米黃酮含量對比

2.2 糙米多酚清除DPPH自由基能力對比

以抗壞血酸標準品作為對照,不同品種糙米多酚對DPPH自由基的清除能力對比見圖3。

圖3 不同品種糙米DPPH自由基清除率對比

DPPH自由基清除是指氫氣或給電子的抗氧化劑還原DPPH-乙醇溶液,生成黃色的非自由基DPPH-H的過程[17]。DPPH-乙醇溶液在517 nm有特征峰。由圖3所示,不同品種糙米多酚均具有一定的清除自由基的作用,但具有很大的差異,其中軟米和龍粳品種之間達到了顯著水平(P<0.05)。清除DPPH?的能力表現(xiàn)從高到低依次為軟米>小粒香>Type-619>龍粳,軟米清除DPPH?的能力為48.95%,龍粳清除DPPH?的能力為35.55%,但均低于抗壞血酸清除DPPH?的能力。這表明糙米多酚具有清除DPPH?的能力,并且這與多酚含量的多少可能有一定的關(guān)系。

2.3 不同品種糙米多酚清除超氧陰離子自由基能力

以抗壞血酸標準品作為對照,不同品種糙米提取物對超氧陰離子自由基清除情況見圖4。

圖4 不同品種糙米超氧陰離子自由基清除率對比

由圖4可知,不同品種糙米多酚均有一定的清除超氧陰離子自由基作用,但差異較大,其中軟米和龍粳品種之間達到顯著水平(P<0.05),Type-619和小粒香無顯著差別。清除超氧陰離子自由基的能力表現(xiàn)從高到低依次為軟米>小粒香>Type-619>龍粳,其中軟米的超氧陰離子自由基清除率為72.95%,龍粳的超氧陰離子自由基清除率為55.93%。超氧陰離子自由基清能力相對DPPH自由基清除能力而言有所升高,但是尚沒有達到抗壞血酸的百分比要求。

2.4 不同品種糙米多酚ABTS+·清除能力測定

以抗壞血酸標準品作為對照,不同品種糙米提取物對ABTS+·清除率的影響見圖5。

圖5 不同品種糙米ABTS+自由基清除能力測定

ABTS+·是一種氧化反應(yīng)時會產(chǎn)生藍綠色等液體的氧化物酶底物,在抗氧化劑的作用下,ABTS+·會被清除,從而呈現(xiàn)出顏色變淺、吸光度降低的特點,因此樣品的抗氧化效果可以通過測定吸光度來得到很好的評價。由圖5可知,不同品種糙米的ABTS+·清除能力表現(xiàn)與DPPH·清除能力相似,最強同樣為軟米。

2.5 不同品種糙米對葡萄糖苷酶活性抑制率的影響

不同品種糙米對葡萄糖苷酶活性抑制率的影響見圖6。葡萄糖苷酶是碳水化合物消化和葡萄糖釋放的關(guān)鍵催化酶,位于小腸刷狀邊緣的葡萄糖苷酶可以將寡糖末端非還原性(1→4)鍵水解為腸道上皮細胞易吸收的單糖[18]。因此,降低葡萄糖苷酶活性的抑制率能有效地減緩單糖的產(chǎn)生,降低餐后高血糖的發(fā)生率。

圖6 不同品種糙米葡萄糖苷酶活性抑制率

不同品種的糙米對葡萄糖苷酶活性的抑制率范圍在28.11%～33.63%,抑制率從高到低依次為軟米>小粒香>Type-619>龍粳;其中軟米對葡萄糖苷酶活性的抑制率為33.63%,阿卡波糖對葡萄糖苷酶活性的抑制率為62.34%,軟米對葡萄糖苷酶活性的抑制率可達到阿卡波糖對葡萄糖苷酶活性抑制率的0.54倍。這表明糙米對葡萄糖苷酶活性的抑制作用相對較強,作為食品具有較為理想的抑制作用,具有深入研究及應(yīng)用的潛力。

2.6 不同品種糙米對淀粉酶活性的抑制作用

不同品種糙米對淀粉酶活性的抑制作用見圖7。淀粉酶是體內(nèi)將碳水化合物水解成葡萄糖以便于在細胞內(nèi)運輸?shù)年P(guān)鍵酶,淀粉被該酶降解為二糖或較低聚合度的糖,并進一步催化為單糖(葡萄糖),葡萄糖最終被吸收進生物血液循環(huán)系統(tǒng)中。因此,它已被作為控制餐后高血糖的一種治療方法。

圖7 不同品種糙米淀粉酶活性抑制率

4個糙米品種對淀粉酶活性的抑制率范圍在28.02%～33.16%,抑制率大小依次為軟米>小粒香>Type-619>龍粳;其中軟米對淀粉酶抑制率為33.16%,阿卡波糖對淀粉酶抑制率為55.48%,軟米對淀粉酶活性抑制率可達到阿卡波糖對淀粉酶活性抑制率的0.60倍。這表明糙米對淀粉酶活性的抑制作用相對較強,可通過大孔樹脂進一步純化提高其對淀粉酶活性的抑制率,達到更強的抑制效果。

2.7 糙米抗氧化和降血糖與多酚含量的相關(guān)性分析

為了探明糙米中多酚含量與其抗氧化能力和體外降血糖能力之間的關(guān)系,對測量指標這6者之間進行了相關(guān)性分析。

糙米多酚含量與抗氧化能力和體外降血糖能力的相關(guān)性分析見表1。由表1可知,糙米多酚含量與ABTS+自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。此外,糙米多酚含量與葡萄糖苷酶、淀粉酶活性抑制率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。徐金瑞等[19]發(fā)現(xiàn),番石榴多酚對葡萄糖苷酶活性抑制率隨多酚含量增加而增大,且劑量-效應(yīng)呈正相關(guān)關(guān)系,與本試驗結(jié)果一致;楊麗珍[20]發(fā)現(xiàn),荔枝殼的游離酚和結(jié)合酚對淀粉酶活性的抑制率隨著多酚濃度的增加而增加,這與本實驗的結(jié)果一致。以上研究結(jié)果表明,糙米多酚可能是其抗氧化與降血糖作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

表1 糙米的抗氧化能力、體外降血糖能力和總酚含量的相關(guān)系數(shù)

2.8 基于主成分分析篩選評價抗氧化能力和體外降血糖的指標

本研究的主成分分析是利用降維的思想,將6個指標轉(zhuǎn)換成若干個綜合指標的多元統(tǒng)計方法,以確保在最大程度上保留6個指標的信息,其中每個綜合指標(主要成分)都是原始變量的線性組合,互不相干,這就使得主成分比原始的6個指標更能評價糙米的抗氧化性和降血糖指標。

2.8.1數(shù)據(jù)標準化處理

由于多酚含量與這幾個指標考核不是統(tǒng)一的指標,因此需對6個原始數(shù)據(jù)進行標準化處理。4個糙米品種的多酚含量與所有原始指標的標準化處理見表2。

表2 不同品種糙米各項指標標準化結(jié)果

2.8.2主成分提取和貢獻率

從表3可以看出,成分1的特征值為5.776,遠遠超過1;并且成分1的累計貢獻率為96.267%,說明了原有變量總方差的96.627%可以表示大多數(shù)原有指標的信息,并在此基礎(chǔ)上,利用該主成分取代原有的6個指標變量。這個主成分主要以葡萄糖苷酶活性抑制率、DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和淀粉酶活性抑制率為主,多酚含量和超氧陰離子自由基清除率為輔。

表3 主成分的特征值及貢獻率

2.8.3特征向量計算

表4是不同品種糙米各指標能力的載荷矩陣,它反映了各變量對主成分的影響程度,而絕對值越大,則對主成分的影響就越大。根據(jù)表3中的特征值和表4中各主成分載荷系數(shù)除以主成分相對應(yīng)的特征值開平方根,可以得到表5中各性狀指標的成分系數(shù)得分矩陣,進而可以算出其特征向量。

表4 不同品種糙米各指標能力載荷矩陣

表5 各指標的成分系數(shù)得分矩陣

由表5可以得到這個主成分的函數(shù)表達式F1:

F1=0.403X1+0.41X2+0.406X3+
0.408X4+0.413X5+0.408X6

將主成分函數(shù)以及各主成分對應(yīng)的方差貢獻率作為權(quán)重,得到綜合評價函數(shù):

F=0.39X1+0.396X2+0.392X3+
0.394X4+0.4X5+0.394X6

式中:X1為多酚含量;X2為DPPH自由基清除率;X3為超氧陰離子自由基清除率;X4為ABTS+自由基清除率;X5為葡萄糖苷酶活性抑制率;X6為淀粉酶活性抑制率。

2.8.4糙米各個指標綜合評價

表6為4種糙米品種的主成分分析綜合得分與排名,分數(shù)越高代表糙米品種的各個指標越強,其中F1表示主成分的得分,結(jié)合上述分析可知測定的糙米各個指標差異性顯著,且多酚含量分別與DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、葡萄糖苷酶活性抑制率和淀粉酶活性抑制率相關(guān)性顯著。從主成分分析綜合評分得到的各個指標最強的是軟米,其次是小粒香;而最弱的是龍粳。

表6 4種糙米品種的主成分分析綜合得分與排名

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明,4個品種糙米在體外抗氧化和降血糖方面表現(xiàn)良好,且在多酚含量、抗氧化能力、葡萄糖苷酶和淀粉酶活性抑制率等指標上均有明顯差異,從主成分分析綜合評分得到的抗氧化能力和體外降血糖指標最強的是軟米,其次是小粒香;而最弱的是龍粳。