甲酰基肽受體1 對(duì)脊髓損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的影響

宋 揚(yáng)，錢 澍，魏飛龍，周程沛，袁一方，郭時(shí)空，高浩然，錢濟(jì)先，高全有

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，西安 710038

脊髓損傷（SCI）是外力直接或間接作用于脊髓造成的損傷，致殘率極高，給患者及其家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)［1］。SCI 主要包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷往往不可逆轉(zhuǎn)，繼發(fā)性損傷包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎性反應(yīng)、外周免疫細(xì)胞浸潤、出血、缺氧和軸突脫髓鞘等，其中，炎性反應(yīng)被認(rèn)為是SCI 患者預(yù)后較差的重要因素，抑制炎性反應(yīng)能夠顯著降低患者的致死率和致殘率［2-3］。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的免疫細(xì)胞，其活化在SCI 相關(guān)的神經(jīng)病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［4-5］。病原相關(guān)分子模式（PAMP）和損傷相關(guān)分子模式（DAMP）能夠與模式識(shí)別受體（PRR）結(jié)合，從而發(fā)揮免疫調(diào)控作用［6］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，PRR 主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞［7］。近幾年，甲?；氖荏w1（Fpr1）作為被關(guān)注較多的PRR，被發(fā)現(xiàn)在人體固有免疫反應(yīng)中扮演著重要角色，其病理機(jī)制已在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中得到進(jìn)一步研究，如腦出血［8］、腦缺血［9］、創(chuàng)傷性腦損傷［10］等。然而，F(xiàn)pr1在SCI中的作用尚不明確。因此，本研究以Fpr1 為切入點(diǎn)，探究Fpr1 在SCI 發(fā)生、發(fā)展過程中的可能機(jī)制，旨在為SCI 臨床治療和功能康復(fù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 ～ 8 周C57BL/6 雄性小鼠由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，小鼠在空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)條件：溫度22 ～ 25℃、空氣濕度50%、正常晝夜交替（12 h 光照/12 h 黑暗），并給予充足的水和食物。所有實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照動(dòng)物倫理相關(guān)要求進(jìn)行，本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到空軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員委員會(huì)批準(zhǔn)（動(dòng)物倫理審批號(hào)：IACUC-20201003）。

1.2 造模與分組

將30只小鼠隨機(jī)分為5組，假手術(shù)組（sham組）和SCI 造模后1、3、5、7 d 組，每組6 只。SCI 造模采用文獻(xiàn)［11］的方法：①采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，俯臥位置于解剖板上；②定位T9脊髓對(duì)應(yīng)錐體，切開皮膚，暴露脊柱，切除椎板，充分暴露脊髓；③利用血管夾鉗夾脊髓1 min 形成脊髓擠壓傷，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行鉗夾的部位為半脊髓，每只動(dòng)物鉗夾的時(shí)間與部位均一致，鉗夾完成后可見損傷部位充血，小鼠身體出現(xiàn)痙攣，雙下肢回縮；④縫合傷口，使用碘伏消毒，術(shù)后觀察切口愈合情況。Sham組僅手術(shù)暴露脊髓，不鉗夾脊髓，縫合切口，使用碘伏消毒，術(shù)后觀察切口愈合情況。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組小鼠實(shí)施安樂死，取脊髓組織等進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)印跡檢測和免疫熒光實(shí)驗(yàn)。

第一步實(shí)驗(yàn)后選擇Fpr1 蛋白表達(dá)水平最高時(shí)間點(diǎn)制作小鼠模型進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，將小鼠隨機(jī)分為SCI 組和Fpr1 抑制劑（HCH6-1）干預(yù)組（HCH6-1 干預(yù)組），每組6 只，并與sham 組比較。SCI 組的小鼠按照上述方法施行手術(shù)。HCH6-1 干預(yù)組小鼠術(shù)后即刻接受腹腔注射HCH6-1（50 mg/kg），之后隔日進(jìn)行腹腔注射1 次［8，12］。Fpr1 蛋白表達(dá)水平最高時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組小鼠實(shí)施安樂死，取脊髓組織等進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)印跡檢測和免疫熒光實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用免疫熒光實(shí)驗(yàn)評(píng)估各組小膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度，通過蛋白質(zhì)印跡檢測各組炎性因子［白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）］以及炎性小體（NLRP3、ASC 和Caspase-1）蛋白的表達(dá)情況。

1.3 蛋白質(zhì)印跡檢測

小鼠處死后，取正常脊髓組織和損傷周圍脊髓組織進(jìn)行蛋白提取及定量，蛋白定量采取BCA 蛋白定量測定法，實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［13］。取15 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗：anti-Fpr1（1∶1 000，Abclonal，中國），anti-IL-1β（1∶1 000，Proteintech，美國），anti-IL-18（1∶1 000，Proteintech，美國），anti-TNF-α（1∶1 000，Proteintech，美國），anti-NLRP3（1∶1 000，Proteintech，美國），anti-ASC（1∶1 000，Proteintech，美國），anti-Caspase-1（1∶1 000，Proteintech，美國）和anti-β-actin（1∶3 000，Abclonal，中國）。4℃過夜后，室溫孵育相應(yīng)二抗。最后使用化學(xué)發(fā)光試劑盒和成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶。

1.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)［14］。小鼠麻醉后，依次使用PBS 和4%多聚甲醛灌注，然后將脊髓組織依次進(jìn)行10%、20%、30%蔗糖梯度脫水。根據(jù)冰凍切片常規(guī)流程進(jìn)行切片，使用0.5% Triton 打孔15 min 后封閉0.5 h，然后將切片同時(shí)孵育一抗anti-Fpr1（1∶200，Abclonal，中國）和anti-Iba1（1∶200，Invitrogen，美國），4℃孵育過夜。使用PBS 對(duì)切片進(jìn)行漂洗，然后加入熒光二抗避光孵育，PBS漂洗干凈后，使用封片劑封片，最后使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍攝觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。柱狀圖采用GraphPad Prism 8.3.0 軟件繪制。

2 結(jié) 果

2.1 Fpr1蛋白表達(dá)情況

與sham 組相比，F(xiàn)pr1 在SCI 后第1 天開始表達(dá)增多，第3 天最高，第5 天下降，第7 天下降至與sham 組水平相當(dāng)（圖1）。結(jié)果提示，F(xiàn)pr1 在SCI急性期表達(dá)顯著增加，可能發(fā)揮重要的損傷作用。Fpr1 表達(dá)水平在SCI 后第3 天最高，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采取SCI 后第3 天作為研究時(shí)間點(diǎn)制作模型。

圖1 Fpr1蛋白表達(dá)水平Fig. 1 Expression level of Fpr1 protein

2.2 Fpr1的細(xì)胞定位

Sham組小膠質(zhì)細(xì)胞呈高度分支化，細(xì)胞間的分支基本不重疊，是未激活的狀態(tài)；SCI 后第3 天，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生明顯活化，表現(xiàn)為突起回縮，胞體增大，呈巨噬細(xì)胞樣，數(shù)量增多，進(jìn)一步證實(shí)Fpr1 在SCI 后表達(dá)顯著增加。免疫熒光染色結(jié)果示Fpr1 主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞（圖2）。以上結(jié)果提示Fpr1 可能參與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化過程。

圖2 Fpr1的細(xì)胞定位（×50）Fig. 2 Cell localization of Fpr1（×50）

2.3 Fpr1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與sham 組相比，SCI組小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生明顯活化，HCH6-1 干預(yù)能顯著減輕SCI 后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，表現(xiàn)為胞體減小，數(shù)量減少（圖3）。

圖3 小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況（×50）Fig. 3 Microglia activation（×50）

2.4 抑制Fpr1對(duì)SCI后炎性因子和炎性小體的影響

蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果表明，與sham 組相比，SCI 組小鼠損傷部位周圍脊髓組織的炎性因子（IL-1β、IL-18 和TNF-α）和炎性小體（NLRP3、ASC 和Caspase-1）的蛋白表達(dá)顯著增加；與SCI 組相比，HCH6-1 干預(yù)組小鼠損傷部位周圍脊髓組織的炎性因子（IL-1β、IL-18 和TNF-α）和炎性小體（NLRP3、ASC 和Caspase-1）的蛋白表達(dá)顯著減少（圖4、5）。

圖4 脊髓組織中炎性因子蛋白水平Fig. 4 Protein levels of inflammatory factors

圖5 脊髓組織中炎性小體蛋白水平Fig. 5 Protein levels of inflammasomes

3 討 論

目前，SCI 的發(fā)生率逐年遞增，其致殘致死率高、預(yù)后差、治療及康復(fù)費(fèi)用昂貴［1］。其中，SCI 后繼發(fā)性損傷（出血、水腫、炎性反應(yīng)、脫髓鞘等）是導(dǎo)致患者致死致殘的重要原因［2］。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的免疫細(xì)胞，占中樞所有細(xì)胞的5% ～ 10%，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)第一道免疫防線［15］。SCI 后小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變并向損傷灶遷移，可以發(fā)揮吞噬功能清除細(xì)胞碎片，促進(jìn)神經(jīng)元和突觸的可塑性，但過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞呈阿米巴樣（球形）狀態(tài)，誘導(dǎo)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生炎性損傷作用［4］。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化對(duì)于預(yù)防SCI 后的神經(jīng)炎性反應(yīng)至關(guān)重要。既往研究發(fā)現(xiàn)，PRR 參與小膠質(zhì)細(xì)胞在SCI 后的炎性和免疫反應(yīng)。Bell 等［16］的研究顯示，toll 樣受體4（TLR4）在SCI 后表達(dá)升高，抑制TLR4 能夠顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活并減輕炎性反應(yīng)。Hao 等［17］在缺血性腦損傷后，通過使用TLR4 拮抗劑Stepharine，證實(shí)了抑制TLR4 能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。髓系細(xì)胞觸發(fā)受體1（TREM-1）是TREM家族的一員，與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，如腦出血［18］、腦缺血［19］、阿爾茲海默?。?0］等。在SCI 中，抑制TREM-1 能夠顯著減輕機(jī)體氧化應(yīng)激和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活［21］。上述研究均表明，PRR 在小膠質(zhì)細(xì)胞的活化中起著關(guān)鍵作用，因此，明確PRR 在SCI 中的作用對(duì)于減輕繼發(fā)性損傷具有重要意義。

Fpr1 是G 蛋白偶聯(lián)的趨化受體，也是PRR 的一種，最初在吞噬相關(guān)白細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞）中被發(fā)現(xiàn)，主要介導(dǎo)細(xì)胞趨化和激活，F(xiàn)pr1的激活能夠啟動(dòng)PI3K、PKC、MAPKs、NF-κB等信號(hào)通路，參與宿主對(duì)微生物的防御過程［22］。Li等［8］的研究表明，在腦出血疾病模型中，循環(huán)線粒體N-甲?；氖荈pr1 的內(nèi)源性配體，甲?；呐cFpr1 的相互作用促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞激活、中性粒細(xì)胞趨化以及神經(jīng)功能惡化，通過使用Fpr1 抑制劑，證實(shí)了抑制Fpr1 能夠減輕腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和腦水腫等繼發(fā)性損傷，提示Fpr1 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中扮演著重要角色。在創(chuàng)傷性腦損傷模型中，F(xiàn)pr1可以激活MAPKs、NF-κB 等信號(hào)通路，促進(jìn)炎性小體的激活，加重機(jī)體的氧化應(yīng)激［10］。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中，F(xiàn)pr1 高表達(dá)，并與AKT 和ERK 等通路密切相關(guān)［23］。對(duì)于Fpr1 的細(xì)胞定位，有研究［24］指出，通過對(duì)人神經(jīng)組織進(jìn)行單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)pr1 是特異性表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志基因。Li 等［8］在腦出血疾病模型中證實(shí)Fpr1 主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞。Schr?der 等［25］在阿爾茨海默病的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，抑制Fpr1 能夠減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，而對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞無影響，也側(cè)面證實(shí)了Fpr1 主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞。因此，本研究組猜測Fpr1 可能參與SCI 后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，抑制Fpr1 能夠減輕SCI 后的炎性反應(yīng)。Xia 等［26］的研究表明，NLRP3 炎性小體作為固有免疫的重要組分，在機(jī)體先天性免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)發(fā)生過程中具有重要作用，其介導(dǎo)的Caspase-1 激活能夠切割I(lǐng)L-1β 和IL-18 的前體，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的成熟細(xì)胞因子，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。Jiang等［27］的研究表明，在SCI 急性期，抑制NLRP3 炎性小體的激活和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，有利于減輕機(jī)體繼發(fā)炎性反應(yīng)和膠質(zhì)瘢痕的產(chǎn)生，并促進(jìn)軸突生長。因此，NLRP3 可作為治療SCI 的潛在靶點(diǎn)。本研究組通過蛋白質(zhì)印跡檢測以及免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Fpr1 在SCI 后小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)顯著增加，抑制Fpr1 能夠減少小膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及炎性因子的產(chǎn)生，并減少NLRP3 炎性小體的形成，推測Fpr1可能是SCI 治療的重要靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究以Fpr1 為出發(fā)點(diǎn)，利用小鼠SCI 模型，為SCI 后減輕小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)提供了一個(gè)新的治療途徑，也為HCH6-1 的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供了理論支持。