延邊地區(qū)一株野生羊肚菌的鑒定及其馴化栽培研究

崔林虎 孫闖 張鵬 姜立佳 趙麗

延邊地區(qū)一株野生羊肚菌的鑒定及其馴化栽培研究

崔林虎 孫闖 張鵬 姜立佳 趙麗*

（延邊林業(yè)科學(xué)研究院，吉林 延吉 133001）

以延邊地區(qū)一株野生羊肚菌資源為研究對(duì)象，母種分離后采用分子生物學(xué)鑒定法明確其品種，并設(shè)計(jì)6個(gè)母種培養(yǎng)基配方、14個(gè)原種培養(yǎng)料配方、8個(gè)外源營(yíng)養(yǎng)瓶配方、7個(gè)栽培基質(zhì)配方，篩選其母種、原種、外源營(yíng)養(yǎng)瓶及栽培的適宜基質(zhì)。鑒定結(jié)果顯示，該野生菌株“23-1”為六妹羊肚菌。配方篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，“23-1”母種培養(yǎng)適宜PDA培養(yǎng)基，菌絲生長(zhǎng)快、長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，接種后96 h即出現(xiàn)菌核；原種培養(yǎng)料以13號(hào)配方（硬雜木屑38%、麥粒40%、麥麩10%、草炭土10%、生石灰1%、石膏1%）菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)好，接種后15天滿袋，菌絲粗壯；外源營(yíng)養(yǎng)瓶配方中麥粒所含比例高，表現(xiàn)菌絲長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、滿瓶時(shí)間長(zhǎng)，綜合考慮原基形成時(shí)間及產(chǎn)量，適宜配方為麥粒50%～60%、硬雜木屑29%～39%、草炭土0～10%、生石灰1%；栽培基質(zhì)各配方出菇時(shí)間接近，平均產(chǎn)量以6號(hào)配方（園土88%、珍珠巖10%、生石灰2%）顯著高于其他處理，為107.46 g/筐。

延邊地區(qū)；羊肚菌；馴化栽培；外源營(yíng)養(yǎng)瓶；栽培基質(zhì)

羊肚菌（spp.）隸屬于子囊菌門(mén)（Ascomycota）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（），又名羊肚菜、羊肚蘑等，因其菌蓋呈羊肚狀而得名[1]。羊肚菌子實(shí)體肉質(zhì)脆嫩、味道鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)、大量人體必需氨基酸和維生素，而高含量的鋅、鐵以及多種礦質(zhì)元素是其有別于其他藥用菌的重要特征[2-3]。在我國(guó)，明代的《本草綱目》中記載羊肚菌“甘寒無(wú)毒，益腸胃，化痰利氣”[4]。羊肚菌性平，味甘寒，無(wú)毒，具有益腸胃、消化助食、補(bǔ)腦、提神等功能，其有機(jī)鍺含量較高，食用后可強(qiáng)身健體、預(yù)防感冒、增強(qiáng)人體免疫力，此外還具有抗氧化、降血脂和抗腫瘤等功效[5-7]，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上備受歡迎。

目前，已有較多研究報(bào)道羊肚菌的種屬問(wèn)題[8]、營(yíng)養(yǎng)特性問(wèn)題[9]、生活史[10]、藥用價(jià)值[11]等。其馴化栽培一直以來(lái)是國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于解決的問(wèn)題，至今已有130余年的歷史。前期主要以野外播種、模擬自然環(huán)境出菇的仿生栽培、菌根化仿生栽培、林下仿生栽培等為主[12]。2000—2010年期間，川渝地區(qū)的羊肚菌大田栽培在“外源營(yíng)養(yǎng)袋”技術(shù)和“易出菇品種”的支撐下逐漸成熟[13]，栽培面積逐年增加，2018—2019年栽培季面積達(dá)14 萬(wàn)畝（1畝≈ 667 m2），栽培區(qū)域遍布除海南之外的全國(guó)各地[14]。然而，由于羊肚菌菌種退化、連作障礙、環(huán)境條件等原因，導(dǎo)致每年有70%的種植者無(wú)法穩(wěn)定盈利[15]，嚴(yán)重制約了羊肚菌產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

本研究以延邊地區(qū)一株野生羊肚菌為研究對(duì)象，分離純培養(yǎng)菌種，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。在此基礎(chǔ)上，篩選其母種、原種、外源營(yíng)養(yǎng)瓶及栽培基質(zhì)的適宜配方，進(jìn)行羊肚菌設(shè)施栽培，為延邊地區(qū)羊肚菌科學(xué)規(guī)范栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：羊肚菌菌株23-1，為采自吉林省琿春市的野生羊肚菌經(jīng)組織分離獲得，保存于延邊林業(yè)科學(xué)研究院中心實(shí)驗(yàn)室。

培養(yǎng)基：PDA、PDB培養(yǎng)基，購(gòu)于美國(guó)BD公司（Becton，Dickinson and Company）。

主要試劑：Ezup真菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工），DNA凝膠回收試劑盒、Dream Taq-TM DNA Polymerase、DNA marker、瓊脂糖等。

1.2 儀器與設(shè)備

水浴鍋、電熱鼓風(fēng)干燥箱、醫(yī)用離心機(jī)、電子天平、移液器等。

1.3 試驗(yàn)方法

（1）分子生物學(xué)鑒定。使用 Ezup真菌基因組DNA抽提試劑盒，依據(jù)說(shuō)明書(shū)提取標(biāo)本基因組DNA，對(duì)其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火復(fù)性30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min 4 ℃保溫。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行BLAST（basic local alignment search tool）比對(duì)分析。

（2）母種培養(yǎng)基配方篩選。設(shè)6個(gè)母種培養(yǎng)基配方（表1），按配方配制培養(yǎng)基制作培養(yǎng)皿，分別取直徑6 mm經(jīng)鑒定的羊肚菌菌株23-1的菌絲塊接種于不同培養(yǎng)基中，20 ℃暗培養(yǎng)。每處理設(shè)3次重復(fù)，分別記錄接種后48 h、60 h的菌落直徑，并實(shí)時(shí)觀察菌落形態(tài)、顏色，菌核形成時(shí)間、數(shù)量及形態(tài)等。

（3）原種培養(yǎng)料配方篩選。設(shè)14個(gè)原種培養(yǎng)料配方（表2），培養(yǎng)料按配方配制，裝入17 cm×33 cm的聚丙烯菌種袋中，每袋裝濕料1 kg，滅菌、冷卻后接入菌株23-1母種，20 ℃暗培養(yǎng)。每處理設(shè)3次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)接種后5天和15天的菌絲生長(zhǎng)量，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度，并實(shí)時(shí)觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)、顏色、滿袋時(shí)間等。

表1 母種培養(yǎng)基試驗(yàn)配方

表2 原種培養(yǎng)料試驗(yàn)配方（%）

注：培養(yǎng)料含水量均為60%。

（4）外源營(yíng)養(yǎng)瓶配方篩選。設(shè)8個(gè)外源營(yíng)養(yǎng)瓶培養(yǎng)料配方（表3），每處理設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)料按配方配制，裝入200 mL玻璃瓶（直徑68 mm、高度90 mm、口徑50 mm）中，每瓶裝料130 g，滅菌冷卻后開(kāi)蓋，扣于已接種并暗培養(yǎng)10天的栽培料面上（栽培基質(zhì)選擇園土98%，生石灰2%），15～18 ℃暗培養(yǎng)，3天后開(kāi)始觀察營(yíng)養(yǎng)瓶?jī)?nèi)菌絲顏色、長(zhǎng)勢(shì)、滿瓶時(shí)間等，記錄出現(xiàn)原基時(shí)間及原基密度，出菇后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)量。

（5）羊肚菌栽培基質(zhì)選擇。栽培室為長(zhǎng)4 m、寬4 m的密閉栽培室，室內(nèi)配備空調(diào)、加濕器、光譜燈、溫濕度表。將園土、草炭土、河沙、珍珠巖和生石灰按照表4所示配方拌制，混合均勻后裝入邊長(zhǎng)42 cm、高9 cm的栽培筐內(nèi)，裝料厚度8 cm，表面壓實(shí)，澆透水后過(guò)夜備用。將原種分成1 cm大小的菌種塊，接種于料面下2 cm處，每筐接種9個(gè)點(diǎn)、接種60 g。接種后覆土，使筐內(nèi)料面中間略高于四周，最高處不超過(guò)筐高。15 ℃暗培養(yǎng)10天后擺放外源營(yíng)養(yǎng)瓶，外源營(yíng)養(yǎng)瓶配方選擇6號(hào)外源營(yíng)養(yǎng)瓶配方（麥粒60%，硬雜木屑39%，生石灰1%），繼續(xù)控制溫度15～18 ℃，空氣相對(duì)濕度60%～70%暗培養(yǎng)。50天后，日間增光，滴灌催菇，降低溫度至10～12 ℃，提高空氣相對(duì)濕度至80%～90%，14天后可見(jiàn)原基產(chǎn)生。此時(shí)，注意通風(fēng)，控制土壤相對(duì)濕度，待20天左右，羊肚菌子實(shí)體膨大，菌帽褶皺充分展開(kāi)后適時(shí)采收。采收時(shí)使用經(jīng)消毒的非金屬刀片齊土面切斷菌柄，輕放于筐內(nèi)，統(tǒng)計(jì)羊肚菌產(chǎn)量。每處理設(shè)置3次重復(fù)。

表3 外源營(yíng)養(yǎng)瓶試驗(yàn)配方

注：培養(yǎng)料含水量均為60%。

表4 栽培基質(zhì)試驗(yàn)配方

1.4 數(shù)據(jù)測(cè)定與處理

菌絲長(zhǎng)速使用游標(biāo)卡尺測(cè)量，羊肚菌產(chǎn)量使用電子天平進(jìn)行稱量，數(shù)據(jù)均精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位，原始數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理，所得結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分子生物學(xué)鑒定

組織分離獲得的菌株經(jīng)rDNA-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增后，獲得大小為642 bp的片段，通過(guò)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索，發(fā)現(xiàn)所獲片段的rDNA-ITS 區(qū)序列與GenBank中登錄號(hào)為MK955410.1:56-697、MK937624.1:58-699、MK955444.1:54-695等的sp. 菌株序列的相似性均高達(dá)100%，選取相似菌株繪制進(jìn)化樹(shù)，可以看出它們?yōu)橥晃锓N（圖1），即菌株23-1屬六妹羊肚菌。

圖1 菌株23-1 PCR結(jié)果（左）和基于rDNA-ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（右）

2.2 不同配方母種培養(yǎng)基的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)

菌株23-1在6種母種供試培養(yǎng)基的菌絲生長(zhǎng)和菌核形成情況見(jiàn)表5，各培養(yǎng)基菌絲均可生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度差異較大，其中以配方1（PDA培養(yǎng)基）和配方6（麥麩汁黃豆粉培養(yǎng)基）顯著快于其他培養(yǎng)基，生長(zhǎng)速度分別為1.384 mm·h-1和1.358 mm·h-1；配方2（YPD培養(yǎng)基）的菌絲生長(zhǎng)速度最慢，為0.834 mm·h-1。配方1和配方5（馬鈴薯酵母粉培養(yǎng)基）菌絲濃密，長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)。

表5 不同配方母種培養(yǎng)基的菌絲長(zhǎng)速及菌核特征

注：菌核形成時(shí)間為3次重復(fù)的平均值；菌核數(shù)量“+”越多，表示菌核越多；菌絲長(zhǎng)勢(shì)“+”越多，表示菌絲長(zhǎng)勢(shì)越好；同列數(shù)據(jù)后無(wú)相同小寫(xiě)字母表示差異顯著（＜0.05），下同。

研究認(rèn)為，菌核是羊肚菌子實(shí)體形成過(guò)程的重要階段，羊肚菌生活史以菌核為中心，菌絲形成菌核，菌核萌發(fā)再由菌絲扭結(jié)成原基，菌核形成有無(wú)與子實(shí)體是否形成存在密不可分的關(guān)系[16-17]。試驗(yàn)顯示，配方1、配方3（PDA加富培養(yǎng)基）和配方5接種后96 h出現(xiàn)菌核，前兩者顏色較深，呈棕色，后者色稍淺，呈深黃色（圖2）。配方2和配方4（CYM培養(yǎng)基）在接種后120 h形成淺黃色菌核，且在接種點(diǎn)附近呈聚集狀態(tài)。配方6（麥麩汁黃豆粉培養(yǎng)基）在接種后144 h才出現(xiàn)菌核，菌核密度較小，集中在培養(yǎng)基邊緣處。

圖2 不同母種培養(yǎng)基菌株23-1的菌絲生長(zhǎng)及菌核形成情況

2.3 不同配方原種培養(yǎng)料的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)

羊肚菌菌株23-1在不同配方原種培養(yǎng)料中均能正常生長(zhǎng)（表6、圖3），菌絲生長(zhǎng)速度以配方1為快，但菌絲細(xì)弱，發(fā)菌前期菌絲幾乎觀察不到，隨著配方中硬雜木屑比例降低，麥粒比例提高，菌絲長(zhǎng)速減慢，顏色漸深，趨于粗壯。菌絲生長(zhǎng)后期，硬雜木屑比例較高的處理菌絲趨于粗壯，生長(zhǎng)速度明顯減弱，導(dǎo)致滿袋時(shí)間有所延緩。配方13最先長(zhǎng)滿，且菌絲粗壯，接種后第5天時(shí)菌絲生長(zhǎng)已過(guò)半，推測(cè)是因?yàn)榕囵B(yǎng)料中添加了草炭土，有助于菌絲生長(zhǎng)。

2.4 不同配方外源營(yíng)養(yǎng)瓶原基形成與產(chǎn)量表現(xiàn)

不同配方外源營(yíng)養(yǎng)瓶擺放后羊肚菌菌絲均正常生長(zhǎng)（表7），滿瓶時(shí)間在11～17天不等，菌絲長(zhǎng)勢(shì)存在明顯差異，以1號(hào)配方100%麥粒的菌絲長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，滿瓶時(shí)間為17天；6號(hào)、8號(hào)配方菌絲滿瓶快而細(xì)弱，很難觀察到菌絲生長(zhǎng)情況。不同配方在接種后68～79天可觀察到原基，1號(hào)、4號(hào)、5號(hào)和6號(hào)配方可觀察到的原基數(shù)量相對(duì)較多，最多超50個(gè)，但不同處理及同一處理的不同重復(fù)之間均存在較大差異。統(tǒng)計(jì)分析顯示，6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)3個(gè)處理之間產(chǎn)量無(wú)顯著差異，但顯著優(yōu)于其他5個(gè)處理，因而認(rèn)為，外源營(yíng)養(yǎng)瓶麥粒含量宜在50%～60%范圍內(nèi)。

表6 供試原種培養(yǎng)料配方對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖3 不同原種培養(yǎng)料配方菌絲生長(zhǎng)情況

表7 供試外源營(yíng)養(yǎng)瓶配方對(duì)羊肚菌原基形成及產(chǎn)量的影響

2.5 不同配方栽培基質(zhì)原基形成與產(chǎn)量表現(xiàn)

不同配方栽培基質(zhì)均能形成子實(shí)體（表8），出現(xiàn)原基時(shí)間較接近，但原基數(shù)量及產(chǎn)量差異較大，原基數(shù)量以4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)和7號(hào)配方較多；平均產(chǎn)量則以6號(hào)配方顯著優(yōu)于其他處理，為107.46 g/筐，其次是5號(hào)和7號(hào)配方，1號(hào)配方最低，僅為53.00 g/筐。

表8 供試栽培基質(zhì)配方對(duì)羊肚菌原基形成及產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論與討論

本文以延邊地區(qū)野生羊肚菌菌株23-1為研究對(duì)象，母種分離后經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，確定為六妹羊肚菌，在此基礎(chǔ)上對(duì)其母種、原種、外源營(yíng)養(yǎng)瓶及栽培基質(zhì)進(jìn)行配方篩選。結(jié)果表明，菌株23-1母種在6種供試培養(yǎng)基中均可生長(zhǎng)，但最適PDA培養(yǎng)基，菌絲生長(zhǎng)快，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，接種后96 h即出現(xiàn)菌核。原種在不同配方培養(yǎng)基則表現(xiàn)隨著硬雜木屑比例降低，麥粒比例提高，菌絲長(zhǎng)速減慢，但顏色變深，更趨粗壯。其中13號(hào)配方（硬雜木屑38%、麥粒40%、麥麩10%、草炭土10%、生石灰1%、石膏1%）培養(yǎng)料在接種15天后菌絲滿袋且粗壯，以其作為栽培試驗(yàn)的原種培養(yǎng)基進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

不同外源營(yíng)養(yǎng)瓶擺放后均可觀察到菌絲正常生長(zhǎng)，麥粒所含比例高，菌絲長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，但滿瓶時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，綜合原基形成數(shù)量及產(chǎn)量情況，認(rèn)為麥粒含量在50%～60%較適合，即外源營(yíng)養(yǎng)瓶適宜配方為麥粒50%～60%、硬雜木屑29%～39%、草炭土0%～10%、生石灰1%。使用不同培養(yǎng)基質(zhì)栽培羊肚菌，各處理出現(xiàn)原基時(shí)間比較接近，平均產(chǎn)量以6號(hào)配方（園土88%、珍珠巖10%、生石灰2%）最高，為107.46 g/筐，顯著優(yōu)于其他處理。

研究表明，羊肚菌正常的原基形成、子實(shí)體分化及生長(zhǎng)均需要相對(duì)較低的溫度，低于15 ℃環(huán)境生長(zhǎng)的子囊果品質(zhì)較好，高于20 ℃則品質(zhì)較差[4]。所以，羊肚菌栽培除菌種和技術(shù)外，最大的博弈是自然氣候，尤其是溫度（即冷資源）。延邊地區(qū)地處吉林省東部，森林覆蓋率高達(dá)80.8%，安圖、敦化、琿春、汪清等多個(gè)縣市均分布有野生羊肚菌資源，且近年來(lái)延邊地區(qū)黑木耳、靈芝、桑黃等食藥用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2021年延邊州食用菌總產(chǎn)量達(dá)73萬(wàn)噸[18]，具備發(fā)展羊肚菌產(chǎn)業(yè)的環(huán)境條件和技術(shù)基礎(chǔ)。以延邊地區(qū)野生羊肚菌為研究對(duì)象，探明其菌絲生長(zhǎng)及子實(shí)體形成特性，可為延邊地區(qū)發(fā)展羊肚菌產(chǎn)業(yè)提供技術(shù)支持。

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Identification and domestic cultivation of a wild morel () strain in Yanbian area

CUI Linhu SUN Chuang ZHANG Peng JIANG Lijia ZHAO Li*

（Yanbian Academy of Forestry, Yanji 133001, China）

In this study, A wildmorel () strain in Yanbian area as the research object, was isolated and identified by molecular biology. Six stock culture medium formulations, 14 mother spawn medium formulations, 8 exogenous nutrient bottle formulations and 7 cultivation substrate formulations were designed to screen the suitable cultivation substrate for the stock culture, mother spawn, exogenous nutrient bottle and cultivation. The identification results showed that the wild strain "23-1" was. The results of formula screening test showed that "23-1"stock culture was suitable for PDA medium, then mycelium growth is fast and strong, sclerotium appeared at 96 h after inoculation. The mycelium growth of the mother spawn medium was good in formula 13 (mixed sawdust 38%, wheat 40%, wheat bran 10%, turf soil 10%, quick lime 1%, gypsum 1%), the culture bag was full at 15 days after inoculation, and the mycelium was robust. Enhanced the proportion of wheat in the exogenous nutrient bottle formula, indicating strong mycelial growth and long filling time. Considering the formation time and yield of the primordium, the appropriate formula was wheat 50% ～ 60%, mixed wood chips 29% ～ 39%, turf soil 0 ～ 10% and quicklime 1%. The time of mushroom production is close to that of different cultivation substrate formulations, the average yield of formula 6 (garden soil 88%, perlite 10%, quicklime 2%) was significantly higher than other treatments, it is 107.46 g/ basket.

Yanbian;;domestication and cultivation；exogenous nutrient bottle; cultivation substrate

S646

A

2095-0934（2024）01-065-07

延邊州科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2022NS19）；延邊州科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目（2020ZH01）

崔林虎（1983—），男，工程師，主要從事食藥用菌栽培研究。E-mail：86257149@qq.com。

趙麗（1986—），女，碩士，高級(jí)工程師，主要從事食藥用菌栽培育種研究。E-mail：zhaoli_19861213@163.com。