超聲波輔助紫米花青素提取及抗氧化活性研究

宋雪耐，王 燕，吳衛(wèi)國

（湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖南長沙 410125）

花青素是世界上被廣泛使用的水溶性天然植物色素，存在于植物的不同部位，是植物表現(xiàn)出不同色彩的因素[1]。花青素屬于類黃酮類酚類化合物[2]，其結(jié)構(gòu)是特征性極強的碳骨架結(jié)構(gòu)C6-C3-C6[3-4]。目前，花青素提取方法主要有水溶性提取、超聲臨界萃取、微波輔助提取、超高壓提取、超聲波輔助提取[4-8]。超聲波輔助技術(shù)是利用超聲頻率增加植物的水合作用促使該植物細胞壁孔的擴大，引起細胞壁破裂，同時物質(zhì)分子運動速度和頻率通過超聲頻率被升高，使溶劑穿透力增強，從而提高目標成分進入溶劑的速率，使提取時間縮短[9-11]。有研究表明，花青素具有抗氧化[12-13]、抗菌、降血糖等作用[14-15]。Callcott Esther T 等人[16-17]研究表明，食用紫米可以提高機體抗氧化能力。

紫米是一個稀有水稻品種，因為其米粒很細，種皮為紫色，因此被叫作紫米。紫米含有大量的蛋白質(zhì)、賴氨酸、核黃素等營養(yǎng)物質(zhì)，與普通大米相比，紫米中的花青素含量豐富[18]。賀江等人[19]檢測出市售紫米中含有6 種花青素。趙珊等人[20]通過超高效液相色譜法對紫米中含有花青素進行含量測定。目前，國內(nèi)外學者對于黑米[21]、黑玉米[22]等谷物中存在的花青素開展了大量研究，而對于紫米中花青素的提取及抗氧化活性研究報道較少。

因此，以紫米為原料，利用超聲波輔助法進行紫米花青素提取，研究6 個單因素對花青素含量的影響，在此基礎上利用PB 試驗和爬坡試驗及響應面優(yōu)化超聲波確定提取紫米花青素的最佳工藝；通過對DPPH 自由基、ABTS+自由基及羥基自由基的清除能力研究紫米花青素的抗氧化活性，為后續(xù)從紫米中提取花青素生產(chǎn)產(chǎn)品和紫米花青素純化及結(jié)構(gòu)鑒定分析提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫米，購自湖南常德桃園縣；無水乙醇、無水乙酸鈉、鹽酸、氯化鉀，均為分析純，國藥集團化學有限公司提供。

1.2 儀器與設備

DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海飛越實驗儀器有限公司產(chǎn)品；KM-600DV 型超聲波清洗機，昆山美美超聲儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3E 型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司產(chǎn)品；LD5-2A 型離心機，上海珂淮儀器有限公司產(chǎn)品；2500Y 型多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫米粉末的制備

將紫米通過粉碎機粉碎，過60 目篩，存放于4 ℃的冰箱中。

1.3.2 紫米花青素提取

精確稱取2.000 g 紫米粉于棕色錐形瓶中，根據(jù)料液比加入酸性乙醇充分混合、搖勻，在一定溫度下，采用超聲輔助法提取花青素，提取完成后以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心15 min，取上層清液。

1.3.3 緩沖溶液的制備

（1）pH 值1.0 的緩沖溶液。稱取1.86 g 氯化鉀，用超純水溶解，在氯化鉀完全溶解后，用pH 計測定其pH 值，用HCl 溶液調(diào)至pH 值為1.00±0.05。

（2）pH 值4.5 的緩沖溶液。稱取54.43 g 醋酸鈉，用超純水溶解，在醋酸鈉完全溶解后，用pH 計測定其pH 值，用HCl 溶液調(diào)至pH 值為4.50±0.05[23]。

1.3.4 最大吸收波長的確定

分別吸取2 mL 紫米花青素上清液置于10 mL 棕色容量瓶中，其中一個棕色容量瓶中用pH 值1.0 緩沖溶液稀釋5 倍；另一個棕色容量瓶中用pH 值4.5緩沖液稀釋5 倍，搖勻，靜置80 min 后，于波長400～800 nm 處使用紫外-可見分光光度計對該樣品進行掃描[24]，確定其紫米花青素的最大吸收波長。

1.3.5 紫米花青素含量的測定

采用pH 示差法[25]進行紫米花青素含量測定，吸取1 mL 紫米花青素上清液置于10 mL 棕色容量瓶中，然后向棕色容量瓶中分別加入9 mL pH 值1.0 緩沖液和pH 值4.5 緩沖液，搖勻，平衡靜置80 min[26]，空白對照選擇超純水，上清液與緩沖液平衡完成后，于最大波長和波長700 nm 下測定吸光度，計算出花青素含量，每個樣品做3 次重復試驗。紫米花青素含量按以下公式計算。

式中：A——（AmaxpH 值1.0-A700nmpH 值1.0）-（AmaxpH 值4.5-A700nmpH 值4.5）；

V——提取液總體積，mL；

DF——稀釋倍數(shù)；

M——相對分子質(zhì)量，為449.2 g/mol；

ε——消光系數(shù)，為26 900 L/（mol·cm）；

m——紫米粉的質(zhì)量，g。

1.3.6 超聲波輔助法提取紫米花青素單因素試驗

（1）乙醇體積分數(shù)對花青素提取量的影響。按照1.3.2 的提取方法，以1∶10 的料液比，加入pH 值為2 的提取劑，用超聲功率300 W 的超聲波于40 ℃條件下超聲提取30 min，以確定不同乙醇體積分數(shù)（50%，60%，70%，80%，90%）對紫米花青素提取量的影響。

（2）超聲溫度對花青素提取量的影響。選用最優(yōu)的乙醇體積分數(shù)，按照1.3.2 的提取方法，根據(jù)1∶10 的料液比，加入pH 值為2，體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，用超聲功率300 W的超聲波提取30 min，以確定不同超聲溫度（20，30，40，50 ℃）對紫米花青素提取量的影響。

（3）pH 值對花青素提取量的影響。選用最優(yōu)的乙醇體積分數(shù)、超聲溫度，按照1.3.2 的提取方法，以1∶10 的料液比，加入體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，用超聲功率300 W 于40 ℃條件下提取30 min，以確定不同pH 值（1，2，3，4，5）對紫米花青素提取量的影響。

（4）超聲時間對花青素提取量的影響。選用最優(yōu)的乙醇體積分數(shù)、超聲溫度、pH 值，按照1.3.2的提取方法，以1∶10 的料液比，加入pH 值為2，體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，用超聲功率300 W 于40 ℃條件下提取，以確定不同超聲時間（10，20，30，40，50 min）對紫米花青素提取量的影響。

（5）超聲功率對花青素提取量的影響。選用最優(yōu)的乙醇體積分數(shù)、超聲溫度、pH 值、超聲時間，按照1.3.2 的提取方法，以1∶10 的料液比，加入pH值為2，體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，于40 ℃條件下超聲提取20 min，以確定不同超聲功率（180，240，300，360，420 W）對紫米花青素提取量的影響。

（6）料液比對花青素提取量的影響。選用最優(yōu)的乙醇體積分數(shù)、超聲溫度、pH 值、超聲時間、超聲功率，按照1.3.2 的提取方法，根據(jù)料液比加入pH 值為2，體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，用超聲功率300 W 于40 ℃下超聲提取20 min，以確定不同料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（g∶mL））對紫米花青素提取量的影響。

1.3.7 Plackett-Burman（PB）試驗設計

PB 試驗是指使用較少的試驗次數(shù)，在多個因素中迅速地找出對試驗樣品有明顯影響的因素[27]。根據(jù)上述試驗結(jié)果選擇出各因素的最佳區(qū)間進行PB 試驗，試驗以花青素含量作為評價指標。

PB 試驗因素與水平設計見表1。

表1 PB 試驗因素與水平設計

1.3.8 最陡爬坡試驗

由上述PB 試驗獲得試驗結(jié)果，選取影響因素顯著的3 個因素進行最陡爬坡試驗，通過最陡爬坡試驗結(jié)果可知最佳條件區(qū)間，同時把最佳區(qū)間作為響應面中心點[29]。

1.3.9 響應面試驗設計

根據(jù)PB 試驗結(jié)果分析可知，對紫米花青素提取量最顯著的3 個因素分別是乙醇體積分數(shù)（A）、超聲時間（C）、超聲功率（E）；根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果可得出響應面的中心點，進而在此基礎上設計響應面試驗[29]。

響應面試驗水平與因素見表2。

表2 響應面試驗水平與因素

1.4 紫米花青素抗氧化活性

1.4.1 清除DPPH·能力的測定

參照周理紅[30]的方法，稍作修改。分別取不同質(zhì)量濃度樣品溶液2.0～5.0 mL 的離心管，加入70 μmol/L DPPH 工作液2.0 mL，劇烈搖動后，避光反應30 mim，以維C 為對照。以乙醇溶液調(diào)零，于波長517 nm 處測定吸光度。每組試驗重復3 次。

式中：A

0——空白對照的吸光度；

A1——樣品組的吸光度；

A2——本底的吸光度。

1.4.2 ABTS+自由基測定

參考Huang Wu-yang 等人[31]的方法并加以修改。分別取不同濃度樣品溶液0.3～5.0 mL 的離心管，加入7 mmoL/L ABTS 工作液2.70 mL，劇烈搖動后，避光反應10 mim，以維C 為對照。以乙醇溶液調(diào)零，于波長734 nm 處測定吸光度。每組試驗重復3 次。

式中：A0——空白對照的吸光度；

A1——樣品組的吸光度；

A2——本底的吸光度。

1.4.3 羥基自由基的測定

采用水楊酸法，分別取不同質(zhì)量濃度樣品溶液1.0～10.0 mL 的離心管中，依次加入濃度為0.9 mmol/L的FESO 溶液1.0 mL、9 mmol/L 的水楊酸溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液，劇烈搖勻后，避光反應10 min，以維C 為對照。以乙醇調(diào)零，于波長510 nm 處測定吸光度。每組試驗重復3 次。

式中：A0——空白對照的吸光度；

A1——樣品組的吸光度；

A2——本底的吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019，SPSS 26.0，Origin 2021，Design Expert 10 完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

紫米花青素紫外-可見吸收光譜圖見圖1。

圖1 紫米花青素紫外-可見吸收光譜圖

由圖1 可知，紫米花青素在pH 值1.0 緩沖溶液下的吸光度和在pH 值4.5 緩沖溶液下的吸光度最大差值是在波長515 nm處。因此，最大吸收波長為515 nm。

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對花青素提取量的影響

乙醇體積分數(shù)對花青素提取量的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數(shù)對花青素提取量的影響

由圖2 可知，紫米花青素提取量在乙醇體積分數(shù)小于70%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增大而增大，當乙醇體積分數(shù)為50%～70%時，提取劑的滲透能力會隨著乙醇體積分數(shù)的升高而增強，有助于花青素可溶性成分溶解。然而，當乙醇體積分數(shù)大于70%時，由于花青素在較低的極性條件下很難溶出。所以，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，提取量降低。由此可見，當乙醇體積分數(shù)為70%時，花青素提取量達到最大值28.393 mg/100 g。因此，確定最佳體積分數(shù)為70%。

2.2.2 超聲溫度對花青素提取量的影響

超聲溫度對花青素提取量的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對花青素提取量的影響

由圖3 可知，隨著超聲溫度的升高，紫米花青素提取量先上升然后降低，在40 ℃時達到最大值26.523 mg/100 g。隨著超聲溫度升高，花青素的溶解度和擴散系數(shù)也會增加，因此花青素的提取量上升；由于花青素在高溫的情況下容易發(fā)生氧化反應，使花青素的提取量降低。因此，選擇40 ℃作為最佳超聲溫度。

2.2.3 pH 值對花青素提取量的影響

pH 值對花青素提取量的影響見圖4。

由圖4 可知，隨著pH 值的增加，花青素含量先上升后下降，在pH 值為2 時，含量達到最高點25.382 mg/100 g?；ㄇ嗨睾懿环€(wěn)定，在pH 值過高或過低的條件下都容易降低其穩(wěn)定性，從而影響花青素的提取量[32]。因此，選擇pH 值2 為最佳提取條件。

2.2.4 超聲時間對花青素提取量的影響

超聲時間對花青素提取量的影響見圖5。

圖5 超聲時間對花青素提取量的影響

由圖5 可知，花青素含量隨超聲時間延長先上升后下降，在20 min 時達到最大值23.351 mg/100 g。剛提取時花青素基本都存在于紫米中，而提取劑中基本不存在花青素，從而加速花青素溶出?；ㄇ嗨匦再|(zhì)不穩(wěn)定、容易氧化，隨著超聲時間的延長，提取出來的花青素會因接觸空氣導致氧化，從而降低花青素含量。因此，選擇20 min 為最佳超聲時間。

2.2.5 超聲功率對花青素提取量的影響

超聲功率對紫米花青素影響見圖6。

圖6 超聲功率對紫米花青素影響

由圖6 可知，隨著超聲功率的增大，花青素含量先升高后降低，超聲功率為300 W 時，達到最大值26.106 mg/100 g。超聲功率越大，越能提高傳質(zhì)效率，使花青素提取量升高，但是達到一定值后，如果再增加超聲功率，則會破壞花青素的結(jié)構(gòu)，使花青素的提取量下降。因此，選擇超聲功率300 W為最佳提取條件。

2.2.6 料液比對花青素提取量的影響

料液比對花青素提取量的影響見圖7。

圖7 料液比對花青素提取量的影響

由圖7 可知，隨著料液比的增大，花青素提取量先升高后降低，在料液比為1∶10 時，達到最大值26.434 mg/100 g。在料液比過小時，提取劑和紫米粉不能充分接觸，細胞內(nèi)外濃度差過低，從而影響溶液傳質(zhì)推動力，造成花青素提取量較低；隨著料液比增加，提取劑與紫米粉接觸面增加，有利于花青素溶出，使花青素提取量增加。因此，選擇料液比1∶10 為最佳提取條件。

2.3 PB 試驗及結(jié)果

在單因素試驗后，采用PB 試驗考查各個因素對紫米花青素影響顯著性，從而篩選出3 個影響最大因素進行進一步優(yōu)化。

PB 試驗設計與結(jié)果見表3，PB 試驗設計效應分析見表4。

表3 PB 試驗設計與結(jié)果

表4 PB 試驗設計效應分析

由表4 可知，該模型的p 值是0.016 2＜0.050 0，為顯著水平，說明該模型具有統(tǒng)計學意義。由試驗中各個因素的p 值可看出，以上6 個因素對紫米花青素提取量影響大小依次為乙醇體積分數(shù)、超聲時間、超聲功率、料液比、pH 值、超聲溫度。根據(jù)參數(shù)估計可知，乙醇體積分數(shù)、pH 值、料液比和超聲功率對紫米花青素提取量為正向影響；超聲溫度和超聲時間為負向影響。響應面試驗設計至少需要3 個因素[34]，又根據(jù)6 個因素影響大小結(jié)果分析，最后選擇乙醇體積分數(shù)、超聲功率和超聲時間為試驗條件進行最陡爬坡試驗。

2.4 最陡爬坡試驗結(jié)果

由PB 試驗可看出，乙醇體積分數(shù)和超聲功率對紫米花青素的提取量是正向影響，而超聲時間屬于負向影響。因此，增大乙醇體積分數(shù)和超聲功率，降低超聲時間，有助于提高花青素的提取量，爬坡方向和合理的步長根據(jù)以上3 個因素的正負效應來確定，從而迅速地得出最優(yōu)的提取區(qū)域。

最陡爬坡試驗與結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡試驗與結(jié)果

由表5 可知，第2 個試驗組的花青素提取量是最高的，因此將試驗組2 進行響應面的中心試驗。

2.5 響應面試驗結(jié)果

Box-behnken 試驗設計及結(jié)果見表6，響應面方差分析見表7。

表6 Box-behnken 試驗設計及結(jié)果

表7 響應面方差分析

通過數(shù)據(jù)分析獲得相關(guān)方程為：

由表7 可知，模型p 為0.000 2＜0.010 0，為顯著水平；失擬項p 為0.666 7＞0.050 0，失擬項為不顯著水平。其中，R2為0.966 3，表明該模型具有較好的擬合效果；R2adj=0.923 0，表明所建立的模型對紫米花青素含量的測定結(jié)果有較好的解釋能力。

2.6 響應面交互作用分析及優(yōu)化

利用Design Expert 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，繪制各因素交互作用影響紫米花青素提取量高低的響應面3D 譜圖和等高線圖，從而進一步對不同變量之間的相互作用進行探究，并確定花青素提取最佳工藝[34]。各個因素和2 個因素之間對花青素提取量的高低可通過響應面3D 譜圖和等高線圖反映出來[35]。響應面3D 譜圖顏色越深、坡度越高、傾斜角度越大，說明2 個因素間交互作用越明顯[36-37]。如果2 個因素有明顯的交互作用，其等高線圖呈橢圓形，如果這2 個因素之間沒有交互作用，其形狀呈圓形[38]。

乙醇體積分數(shù)與超聲時間相互作用對花青素提取量的影響見圖8，超聲時間與超聲功率相互作用對紫米花青素提取量的影響見圖9，超聲功率與乙醇體積分數(shù)相互作用對紫米花青素提取量的影響見圖10。

圖8 乙醇體積分數(shù)與超聲時間相互作用對花青素提取量的影響

圖10 超聲功率與乙醇體積分數(shù)相互作用對紫米花青素提取量的影響

由圖8 可知，乙醇體積分數(shù)和超聲時間2 個因素之間的等高線是圓形，說明這2 個因素明顯沒有交互作用；超聲時間和乙醇體積分數(shù)的三維響應圖坡度較陡，說明超聲時間和乙醇體積分數(shù)對紫米花青素含量影響較大。保持超聲時間不變，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，紫米花青素提取量也隨之增大，達到峰值后逐漸降低。保持乙醇體積分數(shù)不變，隨著超聲時間增大，花青素提取量快速增加到最大值后逐漸下降。

由圖9 可知，超聲時間和超聲功率2 個因素的等高線是橢圓形，表明這2 個因素存在明顯交互作用。超聲功率的三維響應圖坡度較平緩，說明超聲功率對紫米花青素含量影響較小，超聲時間的三維響應圖坡度較陡，說明超聲時間對紫米花青素含量影響較大。保持超聲時間不變，隨著超聲功率的增大，花青素提取量也緩慢升高達到最高點后逐漸下降；保持超聲功率不變，隨著超聲時間延長，花青素含量先快速增加后逐漸下降。

由圖10 可知，超聲功率與乙醇體積分數(shù)2 個因素的等高線為近橢圓形，說明這2 個因素交互作用不明顯；超聲功率的三維響應圖坡度較平緩，說明超聲功率對紫米花青素含量影響較小，乙醇體積分數(shù)的三維相應圖坡度較陡，說明乙醇體積分數(shù)對紫米花青素含量影響較大。超聲功率保持不變，隨著乙醇體積增大，紫米花青素含量先升高后降低；同理，乙醇體積保持不變，隨著超聲功率的增加，花青素含量先升高后降低。

通過Design Expert 軟件設計模型分析可知，紫米花青素提取含量最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)69.486%，超聲時間19.451 min，超聲功率332.748 W，花青素含量為29.076 mg/100 g。為了更加準確地驗證模型的可靠性，從試驗的實際性出發(fā)，調(diào)整了提取工藝參數(shù)，使其提取劑為體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，超聲時間19 min，超聲功率330 W。在此條件下，進行驗證并與傳統(tǒng)水提法進行對比，試驗重復3 次，得出紫米花青素的提取量為29.045 mg/100 g，該值與響應面得出的預測值29.076 mg/100 g 相近。由此表明，該模型對于紫米花青素工藝提取優(yōu)化來說具有一定的參考價值。

2.7 紫米花青素抗氧化活性

紫米花青素抗氧化活性及IC50評價結(jié)果見圖11。

圖11 紫米花青素抗氧化活性及IC50 評價結(jié)果

紫米提取物中對DPPH、ABTS+及羥基自由基清除率都隨著質(zhì)量濃度的增加而升高，與維C 變化趨勢相同。其中，當紫米花青素質(zhì)量濃度為0.45 mg/mL時，清除率都達到90%以上。通過計算可知，在相同條件下，DPPH 自由基的IC50為0.247 mg/mL，維C 的IC50為0.260 mg/mL；ABTS+自由基的IC50為0.245 mg/mL，維C的IC50為0.198 mg/mL；羥基自由基的IC50為0.188 mg/mL，維C 的IC50為0.224 mg/mL；通過IC50可看出，DPPH 自由基和羥基自由基的清除能力均大于維C 標準物，紫米提取花青素作為粗提物，已經(jīng)展現(xiàn)出較強的抗氧化能力。

3 結(jié)論

紫米花青素是一種安全、無毒、保健和藥理學價值極高的水溶性天然植物色素，在食品、醫(yī)藥、化妝品等市場應用前景廣闊。以紫米為試驗材料，進行單因素試驗、PB 試驗和最陡爬坡試驗，最后采用響應面試驗優(yōu)化超聲波輔助法來確定紫米花青素提取的最佳工藝和探究其抗氧化能力。結(jié)果表明，各因素影響大小依次為乙醇體積分數(shù)＞超聲時間＞超聲功率＞pH 值＞料液比＞超聲溫度；最佳提取工藝為1∶10 的料液比，加入pH 值為2，體積分數(shù)為70%的乙醇，用超聲功率330 W 的超聲波在40 ℃下超聲提取19 min。紫米花青素的實際提取量為29.045 mg/100 g。該值與響應面軟件模型得出的理論值29.076 mg/100 g 相近，為之后紫米花青素的提取提供理論基礎。抗氧化試驗結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為0.45 mg/mL 時，清除率都達到了90%以上，表明紫米花青素具有較強的抗氧化能力，可替代化學抗氧化劑作為一種天然紫色色素在食品添加劑行業(yè)開發(fā)利用。