藜麥多酚超聲微波協(xié)同提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

王露晨，郭星辰，2，馬金譜，2，張玉璇，2，張競文， 高丹丹，2

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730124；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅蘭州 730030）

藜麥（Chenopodium quinoa Willd）源于5 000 年前安第斯地區(qū)土著居民，以營養(yǎng)全面、比例均衡而有別于其他傳統(tǒng)谷物[1]，因含有較豐富的阿魏酸、辛酸、沒食子酸、山奈酚、異鼠李素和蘆丁等[2]生物活性組分被正式推薦為最適宜人類的完美“全營養(yǎng)食品”，因此被聯(lián)合國糧農(nóng)組織確認(rèn)為唯一一種滿足人體基本營養(yǎng)需求的單體植物[3]。研究發(fā)現(xiàn)，藜麥具有均衡補充營養(yǎng)、增強機體功能、調(diào)節(jié)免疫和內(nèi)分泌、提高機體應(yīng)激能力、降低糖尿病風(fēng)險、修復(fù)受損的組織和細(xì)胞等保健功能[4]，對人類的代謝、心血管疾病[5]和胃腸道健康有積極影響[6]，適于嬰幼兒、孕產(chǎn)婦、老年人等特殊體質(zhì)人群食用[7]。

植物多酚屬于植物次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物的根、莖、皮、葉及果實內(nèi)，是一種含有多個酚羥基的天然化合物。近年來，膳食植物性多酚化合物因其具有抗氧化、抑菌消炎、抗病毒、維持腸道健康等多種功效和生物活性[8-10]，在生化、制藥、食品及精細(xì)化工等領(lǐng)域具有廣闊前景而備受人們關(guān)注[11-14]。研究表明，藜麥中多酚含量較為豐富，藜麥葉片提取的酚類物質(zhì)，具有較強的抗氧化活性[15]，其中單體酚能夠抑制癌細(xì)胞的增殖[16-17]。

目前，藜麥多酚的提取工藝多以傳統(tǒng)的乙醇法、雙水相法等為主，研究選取乙醇作為多酚物質(zhì)的提取劑，采用超聲-微波輔助提取法提取藜麥多酚，在單因素試驗基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面分析結(jié)果，優(yōu)化超聲微波協(xié)同提取法提取藜麥多酚的最優(yōu)工藝參數(shù)，并以清除DPPH 自由基、OH 自由基、O2-自由基的能力作為抗氧化活性能力的評價指標(biāo)對藜麥多酚抗氧化能力進(jìn)行分析，以期為開發(fā)及綜合利用藜麥功能性產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原材料與試劑

藜麥，青海新綠康食品公司提供；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（分析純），美國Sigma 公司提供、DPPH 溶液、福林酚（分析純），上海中泰化學(xué)試劑有限公司提供；抗壞血酸、氯仿、正丁醇、無水乙醚，均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.2 儀器與設(shè)備

微型植物試樣粉碎機，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；TGL-16M 型高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；723P 型分光光度計，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；N-1001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋，北京長安科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；A-1000S 型抽濾機，上海愛朗儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 藜麥多酚提取工藝流程

藜麥→粉碎過篩（80 目篩）→脫脂（3 倍量石油醚）→振蕩混勻（2 h）→抽濾干燥→配制1 g/mL 多酚提取液→超聲-微波輔助提取→離心（轉(zhuǎn)速500 r/min，時間15 min）→取上清液→冷凍干燥→藜麥多酚樣品→福林酚法測定多酚含量。

1.2.2 單因素試驗設(shè)計

精確稱取2.0 g 藜麥，以藜麥多酚含量為指標(biāo)，固定超聲功率為120 W，微波功率為60 Hz，考查不同提取溫度（40，50，60，70，80 ℃）、提取時間（20，30，40，50，60 min）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%，50%，60%，70%，80%）對藜麥多酚提取率的影響。

1.2.3 Box-behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計

為考查乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）這3 個因素對藜麥多酚提取率的影響，試驗以多酚提取率（Y）作為響應(yīng)值，運用Design Expert V8.0.8.1 軟件中的Box-behnken 設(shè)計原理，對響應(yīng)面試驗進(jìn)行設(shè)計。

響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計

1.2.4 藜麥多酚抗氧化活性測定

（1）DPPH 自由基清除能力。參考李東輝等人[17]的方法，分別吸取用無水乙醇配置成的不同質(zhì)量濃度（0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL）的總藜麥多酚溶液2 mL，加入DPPH 溶液2 mL 等體積混合，避光反應(yīng)30 min，以無水乙醇作為參比溶液，于波長517 nm 處測定其吸光度Ax；取2 mL 的不同質(zhì)量濃度樣品溶液與去離子水等體積混合液，吸光度記為A2；2 mL DPPH 溶液與去離子水等體積混合液的吸光度A1，每個質(zhì)量濃度的樣品做3 個平行，取平均值計算提取液對DPPH 自由基的清除率，以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸（維C）作為陽性對照，平行測定3 次，詳見公式（1）。

式中：A1——樣品的吸光度；

A2——對照組的吸光度；

Ax——空白組的吸光度。

（2）OH 自由基清除能力測定。參考向卓亞等人[18]的方法并作一定改進(jìn)，分別吸取用無水乙醇配置的不同質(zhì)量濃度（0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL）的總藜麥多酚溶液，依次加入濃度為9 mmol/L 的水楊酸溶液2 mL，8 mmol/L 硫酸亞鐵溶液2 mL，再加入9 mmol/L 過氧化氫溶液2 mL，同時于37 ℃水浴中加熱30 min，于波長510 nm 處測其吸光度為Ai；用等體積等離子水替換H2O2溶液，重復(fù)操作同時測定其吸光度為A0；用等體積的蒸餾水替換上述方法中的藜麥多酚溶液，測定其吸光值為Aj，取平均值計算OH 自由基的清除率，以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸（維C）為陽性對照，平行測定3 次，詳見公式（2）。

式中：Ao——空白組的吸光度；

Ai——樣品的吸光度；

Aj——空白組的吸光度。

（3）O2-自由基清除能力。參考關(guān)海寧等人[19]的方法并作改進(jìn)，將不同質(zhì)量濃度（0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL）的樣品溶液取1 mL，加入pH 值為8.2 的Tris-HCl 緩沖溶液（0.05 mol/L）3 mL，混合后25 ℃水浴20 min，加入3 mmol/L 的鄰苯三酚溶液0.4 mL，均勻混合，于25 ℃水浴中加熱5 min，加入濃度為10 mol/L 的HCl 溶液0.1 mL 后，于波長320 nm 處測得其吸光度為As；同時用去離子水代替鄰苯三酚，測定其吸光度為A0；用去離子水代替樣液，測其吸光度為Ac，每個質(zhì)量濃度的樣品做3 個平行，取平均值計算提取液對O2-自由基的清除率，以抗壞血酸（維C）為陽性對照，平行測定3 次，詳見公式（3）。

式中：Ac——空白組的吸光度；

As——樣品的吸光度；

A0——空白組的吸光度。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

試驗所得的數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，結(jié)果取其平均值，使用Origin 8.6 軟件作圖，利用Design Expert V8.0.6軟件對響應(yīng)面試驗進(jìn)行分析，利用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥多酚提取的單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對藜麥多酚提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對藜麥多酚提取率的影響見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對藜麥多酚提取率的影響

由圖1 可知，藜麥多酚提取率在乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時呈現(xiàn)下降趨勢，可能與多酚的親水性與疏水性有關(guān)：當(dāng)乙醇水混合液與多酚的極性越接近，多酚復(fù)合物提取率也隨之越大，反之結(jié)構(gòu)極性差異越懸殊，則越不利于多酚復(fù)合物的浸出，故選取乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為響應(yīng)面分析的中心點。游新勇等人[20]在響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥種子中多酚提取工藝的提取試驗中，得出在相同的乙醇體積分?jǐn)?shù)下，多酚提取率也達(dá)到了最大值。

2.1.2 不同提取時間對藜麥多酚提取率的影響

提取時間對藜麥多酚提取率的影響見圖2。

圖2 提取時間對藜麥多酚提取率的影響

由圖2 可知，隨著提取時間的繼續(xù)延長，藜麥多酚的提取率呈先升后降的趨勢。原因可能是隨著提取時間的延長，乙醇和多酚復(fù)合物的接觸時間增加，有利于多酚復(fù)合物的釋放，但時間超過一定界限，多酚復(fù)合物的不穩(wěn)定性，加之在提取過程中氧氣的混入，導(dǎo)致多酚氧化分解，使多酚的提取率下降。因此，選取40 min 為最佳的提取時間。陸敏佳等人[21]在藜麥葉片多酚最佳提取工藝及其抗氧化性研究中得出同樣的結(jié)論。

2.1.3 不同提取溫度對藜麥多酚提取率的影響

不同提取溫度對藜麥多酚提取率的影響見圖3。

圖3 不同提取溫度對藜麥多酚提取率的影響

由圖3 可知，隨著提取溫度的升高藜麥多酚提取率先升高而后降低，可能是由于提取溫度過低時提取程度不夠，致使藜麥多酚提取率不高；提取溫度過高時，藜麥多酚復(fù)合物易分解，致使藜麥多酚的提取率降低。侯敏娜等人[22]在響應(yīng)面法優(yōu)化紅薯葉多酚超聲輔助提取工藝的試驗中，在60 ℃的提取溫度下，多酚提取率也達(dá)到最大值，故選取60 ℃作為藜麥多酚提取溫度的零水平對應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 回歸方程的建立及方差分析

分析藜麥多酚提取工藝的響應(yīng)面分析試驗并依據(jù)Box-behnken 中心法設(shè)計了17 組試驗，合計5 組中心點重復(fù)試驗。

響應(yīng)面試驗設(shè)計及多酚提取率見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及多酚提取率

利用Design Expert 6.0 軟件對表2 中的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合并得到回歸方程：

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析

以藜麥多酚提取率為響應(yīng)值，乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）3 個因素為自變量的回歸方程模型進(jìn)行了生物統(tǒng)計學(xué)分析和顯著性檢驗。響應(yīng)面模型在數(shù)學(xué)統(tǒng)計學(xué)上呈極顯著（p＜0.000 1），表明試驗方法是可靠的，說明響應(yīng)面確立的試驗?zāi)Ｐ途哂休^大的數(shù)學(xué)統(tǒng)計學(xué)意義，該方程對模擬真實的三因素三水平的分析可行。

變量中的一次項A，B，以及二次項A2，B2和C2均對藜麥多酚提取率影響極顯著，交互項中的AC，BC 對響應(yīng)值影響顯著，表明在藜麥多酚提取的過程中，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間對藜麥多酚的提取率有顯著影響，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度、提取時間和提取溫度的交互作用也會對藜麥多酚的提取率造成顯著影響，試驗中的3 個因素當(dāng)中，對藜麥多酚提取率的影響順序為B＞A＞C。失擬項p 值為0.147 3，顯著小于0.01，說明試驗設(shè)計和軟件分析的模型擬合度較好，響應(yīng)面模型選擇科學(xué)合理，殘差的形成可能與試驗過程不可避免的隨機誤差有關(guān)。R2Adj為0.988 1，R2為0.994 8，反映了試驗值與響應(yīng)面的預(yù)測值具有較高的吻合度。C.V.值為0.79%，說明該響應(yīng)面模型能夠科學(xué)真實地再現(xiàn)試驗結(jié)果，進(jìn)一步證明了試驗操作的合理性。

2.2.2 響應(yīng)面與等高線分析

通過響應(yīng)面二次多項模型方程的建立，得出響應(yīng)面的曲面圖。

各因素交互作用對藜麥多酚提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖見圖4。

圖4 各因素交互作用對藜麥多酚提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

等高線的偏離程度及響應(yīng)曲面的曲面坡度可直觀地反映不同因素間的交互作用[23-25]，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度的交互作用對總藜麥多酚提取率的影響程度最大，提取時間和提取溫度的影響次之，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間對藜麥多酚提取率的影響最小，不同因素的交互作用對藜麥多酚提取率影響的顯著性為AC＞BC＞AB，與表3 中的方差分析結(jié)果一致。由圖4 中的響應(yīng)面圖和等高線圖可得，試驗中選取的3 個因素對響應(yīng)值的影響較為一致，隨著各因素的增大，藜麥多酚的提取率也相應(yīng)增大，并在到達(dá)最大值后呈下降趨勢。等高線圖中的橢圓程度和疏密程度有著與響應(yīng)面圖相同，并與響應(yīng)面模型生物統(tǒng)計學(xué)分析一致，圖4 中的等高線呈橢圓形，說明了乙醇體積分?jǐn)?shù)和時間之間，乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度之間及時間和溫度的交互作用顯著。

2.2.3 藜麥多酚最優(yōu)提取條件的確定及驗證

提取藜麥多酚的最佳工藝可經(jīng)響應(yīng)面軟件優(yōu)化得到，提取時間為40 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取溫度為50 ℃，該條件下得到的藜麥多酚提取率為0.923%。為了驗證響應(yīng)面法的可行性，用最佳工藝條件進(jìn)行藜麥多酚提取的驗證性試驗，通過3 組平行試驗得到藜麥多酚提取率為0.919%，0.922%，0.925%，平均提取率為0.922%，誤差小于±1%，且得到的藜麥多酚具有較強的抗氧化能力，可見該模型能較好地預(yù)測實際藜麥多酚提取率。

2.3 藜麥多酚抗氧化活性分析

2.3.1 藜麥多酚對DPPH 自由基清除能力測定

藜麥多酚和維C 對DPPH 自由基的清除率見圖5。

圖5 藜麥多酚和維C 對DPPH 自由基的清除率

由圖5 可知，在一定試驗質(zhì)量濃度區(qū)間內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的不斷提高，藜麥多酚清除能力逐漸增大。DPPH 自由基清除達(dá)到半抑制率（IC50）的藜麥多酚質(zhì)量濃度為0.076 mg/mL，維C 為0.070 mg/mL，說明藜麥多酚具有一定清除DPPH 自由基的能力。

2.3.2 藜麥多酚對·OH 清除能力測定

藜麥多酚和維C 對·OH 的清除率見圖6。

圖6 藜麥多酚和維C 對·OH 的清除率

由圖6 可知，在所選試驗質(zhì)量濃度區(qū)間內(nèi)，藜麥多酚清除能力隨著質(zhì)量濃度的提高逐漸增大，但維C 的清除率始終大于藜麥多酚。對·OH 清除達(dá)到半抑制率（IC50）的藜麥多酚質(zhì)量濃度為0.024 mg/mL，維C 為0.064 mg/mL，說明藜麥多酚具有一定清除羥自由基的能力。

2.3.3 藜麥多酚對O2-·清除能力測定

藜麥多酚和維C 對O2-·的清除率見圖7。

圖7 藜麥多酚和維C 對O2-·的清除率

由圖7 可知，在所選試驗質(zhì)量濃度區(qū)間內(nèi)，藜麥多酚清除能力隨著多酚質(zhì)量濃度的提高逐漸增大，當(dāng)濃度大于0.3 mg/mL 時，O2-·清除率上升較為緩慢，之后隨著質(zhì)量濃度提高，清除率最終幾乎不變。對O2-·清除達(dá)到半抑制率（IC50）的藜麥多酚質(zhì)量濃度為0.021 mg/mL，抗壞血酸（維C）為0.091 mg/mL，盡管藜麥多酚對所測的O2-·的清除率不及參照物抗壞血酸（維C），但藜麥多酚仍具有相當(dāng)?shù)那宄齇2-·的能力。

3 結(jié)論

用超聲-輔助提取法提取藜麥多酚，利用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面軟件分析優(yōu)化藜麥多酚超聲-輔助提取工藝，結(jié)果表明藜麥多酚的最優(yōu)提取工藝為超聲功率120 W，微波功率60 Hz，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取時間40 min，提取溫度50 ℃，該工藝條件下藜麥多酚提取率為0.923%，各因素對樣液中多酚含量的影響順序為時間（B）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）＞提取溫度（C）。在藜麥多酚提取的過程中，提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率有顯著的影響（p＜0.01），乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度、提取時間和提取溫度的交互作用也會對多酚提取率造成顯著影響（p＜0.05）。同時，體外抗氧化試驗表明藜麥多酚對所測的3 種自由基的清除率不及參照物抗壞血酸（維C），但是仍能體現(xiàn)其具有一定的抗氧化能力，為今后藜麥中功能成分的提取和綜合開發(fā)應(yīng)用提供理論技術(shù)依據(jù)。