EPS及消毒劑對(duì)細(xì)菌表面附著和初期生物膜形成的影響

鐘疏影,余 超,陳國(guó)煒,蔡寅諾,劉 麗

(合肥工業(yè)大學(xué)土木與水利工程學(xué)院,安徽合肥 230009)

目前的氯消毒機(jī)制能夠控制飲用水配水系統(tǒng)(drinking water distribution system,DWDS)中出現(xiàn)的絕大多數(shù)病原體,但是生物膜在DWDS中可以通過容納病原體、提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和保護(hù)病原體免受消毒劑脅迫的方式,促進(jìn)病原體在系統(tǒng)內(nèi)的生存和傳播[1]。同時(shí),主體水和生物膜中存在大量的有機(jī)物,降低了系統(tǒng)內(nèi)消毒劑的功效和游離氯的殘留[2]。而消毒劑及其副產(chǎn)品在DWDS的濫用也可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌發(fā)生突變,致使致病菌和抗性細(xì)菌在系統(tǒng)內(nèi)的廣泛傳播[3]。

胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)在微生物生存中起到了極大的作用。生物膜能夠通過捕獲和濃縮環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)形成EPS的方式,進(jìn)而增加生物膜對(duì)抗消毒劑和水動(dòng)力的能力[1,4]。而EPS中存在的酶(如過氧化氫酶和超氧化物歧化酶)與氧化劑類和醛類的消毒劑會(huì)發(fā)生酶促反應(yīng),導(dǎo)致消毒劑活性的降低[5]。一旦EPS的黏附強(qiáng)度被外部剪切力、氯化和機(jī)械應(yīng)力等環(huán)境壓力破壞,會(huì)使得細(xì)菌從生物膜釋放到水中,進(jìn)一步導(dǎo)致系統(tǒng)內(nèi)水質(zhì)的污染[6]。

EPS的生成(包括其組成和含量)往往會(huì)受水動(dòng)力、消毒劑種類與濃度等條件的影響。當(dāng)生物膜在系統(tǒng)內(nèi)接觸消毒劑后,水動(dòng)力會(huì)強(qiáng)化生物膜對(duì)消毒劑的傳質(zhì)效應(yīng),加速消毒劑與生物膜的反應(yīng)[7]。此外,DWDS中游離氯的殘留質(zhì)量濃度應(yīng)保持在0.5～1 mg/L,然而這種殘留濃度不足以阻止系統(tǒng)內(nèi)生物膜的生長(zhǎng)和發(fā)育[8]。研究[9]表明,次氯酸鈉對(duì)DWDS中生物膜實(shí)現(xiàn)了極高的生物膜殺滅率,然而極高的次氯酸鈉濃度反而會(huì)降低對(duì)生物膜的去除效率,從而使得生物膜重新接種。此外,一氯胺更善于穿透生物膜結(jié)構(gòu),因?yàn)樗皇芟緞U(kuò)散限制的影響[10]。但是,一氯胺也被證實(shí)能夠促進(jìn)硝化反應(yīng)的發(fā)生,體系內(nèi)存在的亞硝酸鹽可與氯胺發(fā)生反應(yīng),促進(jìn)生物膜的發(fā)展,影響管網(wǎng)的水質(zhì)。

盡管如此,目前有關(guān)EPS及消毒劑對(duì)細(xì)菌表面附著及其初期生物膜形成的影響機(jī)制尚不清晰。因此,本文以銅綠假單胞菌和藻酸鹽分泌過量的突變體為研究對(duì)象,通過靜態(tài)嘗試解析短期的消毒劑條件如何調(diào)節(jié)生物膜EPS的分泌和生物膜特征的變化,進(jìn)而干預(yù)細(xì)菌的表面附著行為,為進(jìn)一步研究DWDS中消毒劑影響下生物膜相關(guān)病原體的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備

1.1.1 菌株準(zhǔn)備

本文采用兩種菌株:野生型銅綠假單胞菌(wild-type PAO1)和突變型銅綠假單胞菌(PAO1,ΔmucA),敲除mucA基因的突變型銅綠假單胞菌菌種由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所提供。兩種菌株使用菌液、甘油和生理鹽水(體積比為2∶1∶1)混合后于-4 ℃下冷凍保存。在試驗(yàn)前,需要將其進(jìn)行活化處理。首先,使用移液槍吸出融化成液態(tài)的菌種,并將其加入到經(jīng)過滅菌處理后的50 mL的LB培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)基置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162-1A,名宸,合肥)中,在搖床(轉(zhuǎn)速為150 r/min)上培養(yǎng)16～18 h,保證細(xì)菌的充分活化。然后取10 mL活化好的菌液(37 ℃,培養(yǎng)16～18 h)加入到滅菌處理過的50 mL離心管中,在離心機(jī)(5810R,Eppendorf,德國(guó))中進(jìn)行離心重懸浮處理后,將10 mL的生理鹽水加入裝有菌種的離心管內(nèi),制成試驗(yàn)使用的菌液。利用分光光度計(jì)(UV-2600,尤尼柯,上海)測(cè)定菌液的吸光度,利用生理鹽水調(diào)節(jié)菌液吸光值(OD600)為0.5±0.02,對(duì)應(yīng)細(xì)菌菌落形成單位(colony forming units,CFU)約為2×108CFU/mL[11]。

1.1.2 消毒劑制備

取1 mL高質(zhì)量濃度次氯酸鈉母液(100 g/L)溶于99 mL的去離子水中,制得1 g/L低質(zhì)量濃度次氯酸鈉溶液。其需要裝入棕色藥瓶密封保存,2～5 ℃下可保持一個(gè)月的有效期,每次使用前應(yīng)使用余氯儀測(cè)定濃度,保證準(zhǔn)確。

1.1.3 試驗(yàn)裝置準(zhǔn)備

試驗(yàn)反應(yīng)器使用12孔板作為生物膜培養(yǎng)裝置,在使用前對(duì)試驗(yàn)用品進(jìn)行消毒處理。將12孔板和聚氯乙烯(PVC)與不銹鋼(STS)載片(2 cm×2 cm)在紫外燈光下照射至少30 min;培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)使用高溫高壓滅菌(121 ℃、0.01 MPa)20 min、紫外消毒30 min后,置于超凈臺(tái)冷卻備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)置

為了探究消毒劑脅迫對(duì)微生物EPS影響和生物膜形成的機(jī)制,本試驗(yàn)選用了兩種細(xì)菌——野生株和突變株,設(shè)置了4種消毒劑條件(0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L),并控制其他環(huán)境變量保持不變,包括環(huán)境溫度為23 ℃、營(yíng)養(yǎng)條件為1∶50 LB培養(yǎng)基。具體試驗(yàn)過程如下:首先,準(zhǔn)備8個(gè)12孔板(編號(hào)1～8),在編號(hào)1～4的孔板中添加PVC載片,在編號(hào)5～8的孔板中添加STS載片。隨后,在孔板每個(gè)孔中加入2 mL的1∶50 LB培養(yǎng)基,同時(shí)將事先制備好的兩種細(xì)菌的菌種懸浮液向孔板每個(gè)孔中對(duì)應(yīng)各加入20 μL。最后將每個(gè)孔板放置在37 ℃的恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng),每天重復(fù)投加營(yíng)養(yǎng)保持濃度為1∶50,生物膜培養(yǎng)時(shí)間共7 d。

當(dāng)生物膜培養(yǎng)結(jié)束后,在12孔板中分別投加0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L的次氯酸鈉溶液,對(duì)附著在載片表面的生物膜進(jìn)行處理。2 h之后將12孔板中的PVC和STS載片取出。

1.3 分析方法

1.3.1 生物膜提取

當(dāng)消毒劑處理結(jié)束后,在無菌操作臺(tái)對(duì)PVC與STS載片進(jìn)行處理,用無菌PBS溶液(pH值=8)沖洗,以去除表面上存在的未附著細(xì)菌。然后用無菌棉簽在PVC管內(nèi)壁上反復(fù)刮取生物膜,并反復(fù)擦拭10～30次,放入含有3 mL生理鹽水的離心管中。使用超聲機(jī)(KQ5200DE,舒美,昆山)對(duì)離心管進(jìn)行超聲處理10 min后取出,以確保拭子內(nèi)的生物膜被震落到溶液中,從而獲得生物膜懸浮液。

1.3.2 生物量的測(cè)定

使用分子探針LIVE/DEAD細(xì)菌活性試劑盒(賽默飛世爾科技,美國(guó))來區(qū)分生物膜樣品中的活細(xì)胞和死細(xì)胞[12]。染色液的配置過程如下。首先在3.0 mL生理鹽水中加入3 μL 碘化丙啶(PI,2 mmol)和3 μL 綠色熒光核酸染料(SYTO 9,0.33 mmol)制備染色液。然后將100 μL的染色液滴加到3 mL的生物膜懸浮液中,并進(jìn)行避光染色30 min。將染色后的生物膜懸浮液通過直徑為25 mm、孔徑為0.22 μm的黑色聚碳酸酯膜[13],將夾帶細(xì)菌的濾膜置于熒光顯微鏡(LX73,奧林巴斯,日本)下觀察,隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行200倍的細(xì)菌計(jì)數(shù)。根據(jù)至少20個(gè)視場(chǎng)的計(jì)數(shù),估計(jì)每張膜上有活力和無活力的細(xì)菌數(shù)量。

1.3.3 EPS的測(cè)定

EPS提取采用水浴加熱法,將樣品置于80 ℃下水浴加熱30 min,再通過0.22 μm濾膜過濾,濾液即為待測(cè)溶液。多糖采用蒽酮法,在625 nm波長(zhǎng)下用紫外分光光度計(jì)(UV-2600,尤尼柯,上海)測(cè)定各待測(cè)液分光光度值,用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線;蛋白采用 Folin-Lowry法,在750 nm波長(zhǎng)下用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各待測(cè)液分光光度值,用牛蛋白血清作標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。

1.3.4 原子力顯微鏡(AFM)

使用無菌PBS溶液(pH值=8)沖洗表面的懸浮細(xì)菌后,將2 mL 0.5%戊二醛溶液放在載體表面2 h,然后用PBS溶液沖洗去除表面未反應(yīng)的戊二醛[15]。試驗(yàn)過程使用了彈簧常數(shù)為0.02～0.14 N/m的清潔硅探針AFM懸臂梁(BL-AC40TS-C2,奧林巴斯,日本),而懸臂梁的彈性常數(shù)是通過熱噪聲法確定的,彈性常數(shù)為0.772 8 N/m。生物膜表面力的回歸曲線被用來評(píng)估生物膜的黏附力,通過使用接觸模式從載體表面的不同位置收集力與距離的曲線,并通過舍棄每組數(shù)據(jù)的異常值來分析生物膜黏附力,最終獲得20個(gè)點(diǎn)位的生物膜黏附力信息。

1.3.5 生物膜粗糙度的測(cè)定

從反應(yīng)器中取出樣品,使用無菌PBS溶液(pH值=8)沖洗表面的懸浮細(xì)菌。在使用AFM(Multimode 8,布魯克,德國(guó))數(shù)據(jù)分析載體表面的生物膜形貌之前,應(yīng)使用Flatten方法去除成像中產(chǎn)生的噪聲。使用Flatten方法處理的圖像顯示了更多的表面信息,也可以區(qū)分更多的表面形貌變化和孔隙結(jié)構(gòu)。生物膜的表面粗糙度通過平均粗糙度進(jìn)行評(píng)估[16]。

2 結(jié)果和討論

2.1 EPS和消毒劑對(duì)銅綠假單胞菌附著行為的影響

圖1顯示了兩種菌株在PVC與STS表面附著和受不同消毒劑濃度脅迫后的生物量變化結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果顯示,適度的消毒劑濃度促進(jìn)了突變株在載體表面的附著。具體而言,在1.0 mg/L和2.0 mg/L質(zhì)量濃度的消毒劑條件下,突變株在PVC表面附著的生物量分別為2.36×106cells/cm2和2.25×106cells/cm2,與初始階段相比生物量分別增大至1.26倍和1.20倍。繼續(xù)增大消毒劑質(zhì)量濃度(3.0 mg/L),PVC表面附著的生物量減小了0.72×106cells/cm2,相較于初始階段減小了1/5。而野生型在兩種基質(zhì)表面受到消毒劑影響下生物量均呈現(xiàn)出了減小的趨勢(shì)。具體而言,在3.0 mg/L的消毒劑影響下,野生型在STS表面附著的生物量由初始階段的4.1×105cells/cm2降低到了1.8×105cells/cm2。這說明高濃度的消毒劑對(duì)生物膜在基質(zhì)表面的形成極為不利。而不同管材也影響了兩種菌株生物膜在表面的附著。以突變株為例,在兩種基質(zhì)表面附著的初始生物量分別為1.88×106cells/cm2和1.0×106cells/cm2,突變株在PVC表面的生物量是在STS表面的1.88倍,這說明兩種銅綠假單胞菌在PVC上相較于在STS上存在更大的附著優(yōu)勢(shì)。究其原因,可能是PVC在水環(huán)境中產(chǎn)生的有機(jī)物能夠與消毒劑產(chǎn)生反應(yīng),從而對(duì)表面附著的生物膜產(chǎn)生了保護(hù)效應(yīng)[17]。

注:*表示初始附著生物量。

2.2 消毒劑對(duì)細(xì)菌EPS生成的影響

圖2顯示了在初始條件和不同消毒劑濃度條件下兩種銅綠假單胞菌在載片表面的EPS含量。結(jié)果顯示,隨著消毒劑濃度的增大,兩種菌株在各基質(zhì)表面的EPS含量均呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。以PVC表面附著的突變體為例,在低質(zhì)量濃度消毒劑(0.5、1.0 mg/L)影響下,基質(zhì)表面的EPS含量分別為29.31 μg/lg(cells)和35.12 μg/lg(cells)。繼續(xù)增大消毒劑質(zhì)量濃度(3.0 mg/L),基質(zhì)表面的EPS含量為27.26 μg/lg(cells),相較于初始階段減小了1/7。而突變體在1.0、2.0 mg/L的消毒劑質(zhì)量濃度影響下,PVC表面的EPS含量分別為35.12 μg/lg(cells)和33.49 μg/lg(cells),這一結(jié)果與圖1的生物量變化趨勢(shì)相一致。這說明消毒劑在一定程度上促進(jìn)了細(xì)菌分泌更多的EPS以抵抗環(huán)境的影響[18]。

注:*表示初始階段生物膜EPS含量。

同時(shí),基質(zhì)特性也影響了兩種菌株所形成生物膜EPS的生成,特別是胞外多糖的形成。以野生型為例,初始階段STS和PVC表面的胞外多糖分別為1.77 μg/lg(cells)和7.54 μg/lg(cells),胞外多糖增大了近3.26 倍。這一結(jié)果說明兩種菌株在PVC表面會(huì)分泌更多的胞外多糖,目前研究[19]表明,PVC等塑料管道能夠釋放大量的有機(jī)碳化合物,為細(xì)菌提供了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),進(jìn)而促進(jìn)細(xì)菌在PVC表面的附著。

2.3 消毒劑濃度對(duì)生物膜表面粗糙度和力學(xué)特征的影響

圖3為兩種銅綠假單胞菌在初始階段和不同消毒劑濃度影響下的生物膜黏附強(qiáng)度。試驗(yàn)結(jié)果顯示,適度增大的消毒劑濃度強(qiáng)化了生物膜的黏附強(qiáng)度。具體而言,初始階段在PVC表面的突變株生物膜黏附力為21.52 nN。當(dāng)處在消毒劑質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的環(huán)境后,生物膜的黏附力增大至1.51 倍。繼續(xù)增大消毒劑質(zhì)量濃度(3.0 mg/L),生物膜黏附力降低到了24.52 nN,但相較于初始階段仍存在一定程度的提升。同時(shí),由圖3結(jié)果顯示,1.0 mg/L的消毒劑質(zhì)量濃度對(duì)STS表面生物膜的黏附強(qiáng)度提升最為顯著。以STS表面的生物膜黏附力為例,野生型與突變株的初始階段黏附力分別為2.01 nN和10.11 nN。當(dāng)投加1.0 mg/L質(zhì)量濃度消毒劑后,STS表面兩種菌株的黏附力分別增大為4.34 nN和17.12 nN。究其原因,可能是由于生物膜的EPS與外界高濃度的消毒劑發(fā)生反應(yīng),進(jìn)而降低了生物膜的黏附強(qiáng)度[20]。

注:*表示初始附著生物膜粗糙度和黏附力。

生物膜粗糙度能夠通過強(qiáng)化生物膜對(duì)水環(huán)境內(nèi)微生物的攔截效應(yīng)來促進(jìn)細(xì)菌的表面聚集和生物膜的形成。因此,為了解析消毒劑對(duì)生物膜表面特征的影響,試驗(yàn)基于AFM分析了不同消毒劑濃度處理下的生物膜粗糙度變化。圖4顯示了在初始條件和3種消毒劑濃度條件下兩種銅綠假單胞菌在載片上的生物膜表面特征。同時(shí),圖3為基于AFM圖對(duì)生物膜粗糙度進(jìn)行評(píng)估所得的平均粗糙度。由初始結(jié)果顯示,突變體形成的生物膜相較于野生型更為光滑。由圖3的粗糙度評(píng)估結(jié)果顯示,初始階段野生型與突變株銅綠假單胞菌的生物膜表面粗糙度分別為1 087 nm和842 nm。不斷增大消毒劑濃度也降低了兩種菌株表面的粗糙度,以1.0 mg/L的消毒劑質(zhì)量濃度影響下的試驗(yàn)結(jié)果為例,PVC上兩種菌株生物膜粗糙度分別為614 nm和634 nm。繼續(xù)增大消毒劑質(zhì)量濃度(3.0 mg/L)后,PVC上野生型與突變株的生物膜粗糙度分別減小到了427 nm和527 nm,相較于初始階段分別下降了約3/5和2/5。這說明藻酸鹽過量分泌的突變體相較于野生株具備更強(qiáng)的抵抗能力,而在消毒劑脅迫下EPS的分泌也起到了維持生物膜表面特征和形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用[21]。

圖4 不同消毒劑濃度下野生型銅綠假單胞菌和突變株在PVC表面附著生物膜的AFM圖(2 h)

3 結(jié)論

(1)結(jié)果表明,相較于野生型,突變型的生物膜形成優(yōu)勢(shì)顯著。特別是當(dāng)氯質(zhì)量濃度大于1 mg/L時(shí),強(qiáng)化了其形成優(yōu)勢(shì);EPS也顯著提高了生物膜的黏附強(qiáng)度以及降低了其表面粗糙程度。

(2)低濃度氯促進(jìn)細(xì)菌EPS的生成以及初期生物膜的形成,表面的EPS含量分別為29.31 μg/lg(cells)(0.5 mg/L)和35.12 μg/lg(cells)(1.0 mg/L)。高質(zhì)量濃度氯(3.0 mg/L)則抑制了生物膜的形成,同時(shí),也降低了兩種菌株生物膜的黏附力與表面粗糙度。

(3)對(duì)于兩種菌株而言,PVC管材上生物膜的形成優(yōu)勢(shì)顯著高于STS管材,PVC表面的生物量是STS表面的1.88倍。