磺胺甲惡唑與納米氧化鋅對污泥活性的影響

路云霞,李 超,錢唐健,卜現(xiàn)亭,王超越,*

(1.南京市生態(tài)環(huán)境保護科學(xué)研究院,江蘇南京 210013;2.河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院,江蘇南京 210019)

抗生素作為一種常用抗菌藥被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)與生活的各個方面,但作為一種新污染物,其潛在的危害與污染控制問題日益引起學(xué)者們的關(guān)注?？股貜V泛存在于水環(huán)境中,其主要來源包括生活污水、醫(yī)藥廢水以及水產(chǎn)或畜牧養(yǎng)殖廢水等?？股貙λh(huán)境體系會造成一定程度的污染,同時導(dǎo)致水中微生物耐藥基因的改變,我國作為抗生素生產(chǎn)與使用大國,抗生素及其抗性基因成為我國水環(huán)境中的優(yōu)先檢出新污染物。

人工納米材料是環(huán)境中一類特殊的新污染物,可通過多種方式進入水環(huán)境體系,并對水生動植物與生態(tài)系統(tǒng)造成危害。一方面,納米材料的化學(xué)特性、環(huán)境行為及毒理效應(yīng)由于其納米尺度而不同;另一方面,其他污染物可以將其作為載體,以此實現(xiàn)長距離遷移與生物富集,從而產(chǎn)生更大的環(huán)境風(fēng)險。因此,人工納米材料與環(huán)境中其他污染物復(fù)合影響的研究成為目前環(huán)境領(lǐng)域的熱點。

目前,污水處理廠普遍以生物法為主體對污水進行處理,其中活性污泥法應(yīng)用最為廣泛,利用硝化菌、反硝化菌以及聚磷菌等微生物去除有機污染物?？股嘏c納米材料作為近年來出現(xiàn)的兩種新污染物,正引起巨大的環(huán)境風(fēng)險和人類健康問題[1-3],且污水處理廠是抗生素與納米材料進入自然環(huán)境的重要途徑之一。研究表明,抗生素[4]與人工納米材料[5]均對污水處理過程中的重要功能微生物產(chǎn)生危害,從而影響污水處理系統(tǒng)整體效能,進而導(dǎo)致潛在的環(huán)境問題。因此,本文研究污水中抗生素與納米材料共存對活性污泥系統(tǒng)的影響,以期完善兩種新污染物在污水處理系統(tǒng)的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律,為降低新污染物的環(huán)境風(fēng)險與促進污水處理系統(tǒng)穩(wěn)定運行提供新的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

當(dāng)前國內(nèi)外的研究主要面向單一抗生素或是單一納米材料[6],而在實際水體中,兩種污染物通常同時存在,因此,本研究將探究兩者新污染物共存時對污泥系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

本研究采用4組序批式反應(yīng)器(SBR),按照缺氧/好氧(AO)方式運行。反應(yīng)器的有效容積為3 L,排水比為66.7%,運行周期為6 h,使用時控開關(guān)進行控制,其中進水10 min、攪拌75 min、曝氣225 min、沉降30 min、排水10 min、閑置10 min。進水采用人工配制模擬生活污水,選取典型抗生素磺胺甲惡唑(SMZ)與應(yīng)用廣泛的ZnO納米顆粒(NPs)作為研究對象。

4組SBR反應(yīng)器進水分別為生活污水、生活污水+SMZ、生活污水+ZnO NPs、生活污水+SMZ+ZnO NPs,反應(yīng)器依次記作R1、R2、R3、R4。即R1為空白組,進水不投加抗生素或納米材料,R2、R3、R4為試驗組,除進水不同外,其他條件保持相同。

4組反應(yīng)器的氧氣供應(yīng)采用日常養(yǎng)魚所用的圓柱形曝氣頭,利用空氣泵和轉(zhuǎn)子流量計分別提供和控制溶氧量,反應(yīng)器好氧階段溶解氧(DO)質(zhì)量濃度維持在2～3 mg/L,缺氧階段DO質(zhì)量濃度在0.2～0.5 mg/L。反應(yīng)器培養(yǎng)溫度為室溫,pH值控制為6.5～7.5,運行期間定期清洗反應(yīng)器、進出水管以及進出水箱,減少生物膜生長產(chǎn)生的影響。

1.2 接種污泥與試驗水質(zhì)

試驗采用南京某污水處理廠二沉池剩余污泥作為接種污泥,污泥經(jīng)充分曝氣后過1.0 mm篩,使用蒸餾水清洗后接種到反應(yīng)器中。4組SBR反應(yīng)器內(nèi)活性污泥的初始質(zhì)量濃度均維持在4 000 mg/L左右。

試驗采用人工配水方式模擬生活污水,以乙酸鈉為碳源,NH4Cl和KH2PO4分別提供微生物生長所需氮源和磷源,同時添加氯化鈣、硫酸鎂等微生物生長所需元素。

1.3 兩種新污染物濃度選擇與儲備液配制

結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)研究[7-9],本研究中SMZ質(zhì)量濃度選擇為50 μg/L,ZnO NPs質(zhì)量濃度選擇為5 mg/L。試驗所用SMZ生產(chǎn)于Sigma-Aldrich有限公司,為白色粉末,在水中幾乎不溶。準確稱量10 mg SMZ粉末溶于甲醇,再用超純水定容至1 000 mL即得10 mg/L的SMZ儲備液,轉(zhuǎn)移至棕色瓶備用。試驗所用ZnO NPs生產(chǎn)于Sigma-Aldrich有限公司,為亮白色粉末。準確稱量100 mg ZnO NPs粉末置于1 000 mL超純水,超聲分散1 h(25 ℃,250 W,40 kHz)后即得100 mg/L的ZnO NPs懸浮液[10],粒徑為(50±10)nm,儲存?zhèn)溆?每次使用前超聲分散,并根據(jù)所需濃度進行稀釋使用。

1.4 常規(guī)指標檢測方法

試驗中的常規(guī)檢測指標與方法如表1所示,分析方法選取參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》第四版。

表1 水質(zhì)指標分析方法

1.4.1 溶解性微生物產(chǎn)物(SMP)的提取與測定

反應(yīng)器沉降時間段,取上清液過0.45 μm醋酸纖維素膜,即得SMP溶液。SMP中所含多糖采用蒽酮比色法測定,以葡萄糖作為標準;蛋白質(zhì)和腐植酸采用改進Lowry法測定,分別以牛蛋白血清與腐植酸作為標準。SMP含量為多糖、蛋白質(zhì)和腐植酸三者含量總和。

1.4.2 乳酸脫氫酶(LDH)的測定

LDH的測定釆用LDH細胞毒性檢測試劑盒(南京建成),測定方法參照說明書,具體操作步驟如表2所示。

表2 LDH檢測步驟

1.4.3 三磷酸腺苷(ATP)的測定

采用ATP含量試劑盒測定(南京建成)活性污泥中的ATP含量。取1 mL活性污泥混合液離心5 min(12 000 r/min),去上清液后加入200 μL裂解液裂解細胞;裂解后離心5 min(12 000 r/min),取100 μL上清液于含有100 μL ATP檢測工作液的96孔細胞培養(yǎng)板中,使用多功能酶標儀測定。

1.4.4 活性氧(ROS)的測定

ROS的測定利用ROS檢測試劑盒(南京建成),取一定量的活性污泥離心5 min(12 000 r/min),以磷酸緩沖溶液沖洗3次,并將活性污泥重新懸浮于稀釋好的2,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)(10 μmol/L)中;37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)解育30 min后,用磷酸緩沖液洗滌細胞3次,以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA;利用多功能酶標儀,在激發(fā)波長(Ex)為500 nm、發(fā)射波長(Em)為525 nm下檢測所生成2,7-二氯熒光素(DCF)的熒光強度,以反映ROS的水平。

1.4.5 污泥比耗氧速率(SOUR)的測定

污泥的SOUR采用溶解氧儀測定。從反應(yīng)器中取100 mL污泥混合液放入250 mL錐形瓶內(nèi),并向錐形瓶內(nèi)插入溶解氧儀探頭,曝氣充氧至飽和后迅速封好錐形瓶口,使用磁力攪拌器攪拌,每隔10 s記錄一個DO值,直至錐形瓶內(nèi)DO質(zhì)量濃度降至1 mg/L以下時停止。根據(jù)DO值隨時間的變化率與污泥濃度計算得到污泥的SOUR。

2 結(jié)果與討論

2.1 SMZ與ZnO NPs對活性污泥性能影響

采用MLSS與MLVSS這兩個指標表征活性污泥中生物量的相對值,兩者比值(MLVSS/MLSS)表征污泥活性部分相對含量,污泥容積指數(shù)(SVI)來衡量活性污泥凝聚、沉降性能。反應(yīng)器初始污泥濃度約為4 000 mg/L,裝置運行60 d后取各反應(yīng)器污泥樣分別測定其污泥濃度,結(jié)果如圖1所示。

圖1 SMZ與ZnO NPs對活性污泥性能影響

由圖1(a)可知,連續(xù)運行60 d后,空白組R1中MLSS、MLVSS質(zhì)量濃度分別為4 273、3 468 mg/L,MLVSS/MLSS值約為0.812。R2與空白組R1相比,MLSS、MLVSS及MLVSS/MLSS變化較小;而R3與R4反應(yīng)器的MLSS、MLVSS及MLVSS/MLSS與前兩者相比均明顯降低。其中,R3反應(yīng)器MLSS質(zhì)量濃度與VSS/SS分別降至3 633 mg/L和0.713,R4反應(yīng)器MLSS質(zhì)量濃度與MLVSS/MLSS則分別降至3 518 mg/L和0.733,R4相比于R1,MLSS與MLVSS/MLSS分別降低了17.67%和9.73%。

SMZ或ZnO NPs的長期脅迫均會對活性污泥生長代謝產(chǎn)生抑制作用,且ZnO NPs比SMZ的抑制作用更強,這可能與Zn2+溶出、氧化脅迫等方式影響微生物生長代謝有關(guān),從而導(dǎo)致生物增長速率減慢、污泥生物量減少[8-9]。

圖1(b)為4組反應(yīng)器運行期間污泥SVI值變化情況,污泥出現(xiàn)顆?；厔?初始沉降性能較好,SVI值約為46 mL/g。運行期間R1反應(yīng)器中SVI值呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,而R2、R3、R4均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。SMZ或ZnO NPs的投加均對活性污泥產(chǎn)生一定毒性,污泥初期未適應(yīng)環(huán)境變化,造成其沉降性降低、SVI值升高,但未出現(xiàn)絲狀菌膨脹;隨著時間推移,污泥中微生物逐漸適應(yīng)所處環(huán)境,自身做出相應(yīng)調(diào)整,沉降性能則有所恢復(fù)。反應(yīng)器運行至第60 d時,R1～R4反應(yīng)器的SVI值分別為30.42、42.24、46.79、49.31 mL/g,可以看出SMZ或ZnO NPs的長期脅迫均造成污泥沉降性能降低,且以兩者共存時的降低程度最大[10-12]。

2.2 SMZ與ZnO NPs對污泥代謝產(chǎn)物的影響

SMP是影響系統(tǒng)處理水質(zhì)的重要因素[13],可根據(jù)其變化分析活性污泥系統(tǒng)的整體運行狀況。試驗中每7 d對反應(yīng)器出水SMP各組分含量進行檢測,結(jié)果如圖2所示。

注:A—R1;B—R2;C—R3;D—R4。

由圖2可知,試驗初始時各反應(yīng)器出水SMP含量基本相同,SMP質(zhì)量濃度約為8.5 mg CODCr/L,其中多糖、蛋白質(zhì)、腐植酸分別為2.3、4.3、1.9 mg CODCr/L。相比于空白組R1,R2～R4反應(yīng)器出水SMP含量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。運行至60 d時,空白組R1出水SMP質(zhì)量濃度為9.0 mg CODCr/L,R2～R4反應(yīng)器出水SMP質(zhì)量濃度依次為10.6、11.8、12.3 mg CODCr/L,相比于R1分別增加了17.8%、31.1%、36.7%。

SMP又稱溶解態(tài)胞外聚合物(EPS)[14],實際上SMP與EPS之間可以相互轉(zhuǎn)化,EPS可以通過水解產(chǎn)生與微生物內(nèi)源呼吸相關(guān)的產(chǎn)物BAP[15]。SMZ或ZnO NPs的投加會促使微生物分泌更多EPS以抵御毒性,而EPS的部分水解會造成SMP含量升高。此外,通過污泥處理性能與形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化,可以看出R2～R4反應(yīng)器中污泥代謝活性降低,微生物生長代謝相應(yīng)受到抑制,微生物活性的降低可能影響了其對SMP的生物降解,一定程度上造成了出水SMP含量的明顯升高。

運行至60 d時,R2～R4反應(yīng)器出水SMP的多糖含量較對照組R1反應(yīng)器分別增長10.6%、30.7%和39.0%,蛋白質(zhì)含量分別增長42.1%、52.9%和63.3%,腐植酸含量增加相對較小,表明SMP總量的增加以蛋白質(zhì)含量增加為主,從而造成了蛋白質(zhì)組分占比的提高。此外,R4反應(yīng)器出水SMP各組分含量增加均為最高,表明SMZ與ZnO NPs共存對污泥代謝產(chǎn)生的影響最大,使微生物生長代謝受到明顯抑制。

聚羥基脂肪酸酯(PHA)與糖原作為活性污泥中微生物細胞的碳源和能源貯存物質(zhì),與系統(tǒng)的生物除磷效果有著密切關(guān)系。在生物除磷過程中,厭氧階段糖原通過ED(Entner-Doudoroff)或EMP(Embden-Meyerhof)途徑分解并為PHA合成提供還原型輔酶Ⅰ(NADH),而好氧階段PHA分解產(chǎn)生NADH,與O2反應(yīng)產(chǎn)生ATP為糖原合成提供能量。反應(yīng)器運行至60 d,在一個完整周期不同時間點取樣,測定污泥中PHA與糖原含量,結(jié)果如圖3所示。

圖3 典型周期內(nèi)活性污泥PHA與糖原含量變化

由圖3可知,PHA含量呈現(xiàn)缺氧升高、好氧降低的變化趨勢,而糖原含量則呈現(xiàn)缺氧降低、好氧升高的變化趨勢。在空白組R1中,缺氧階段PHA含量由23.9%上升至36.1%,糖原含量由18.5%逐漸降至10.7%,且在前25 min變化最快;好氧階段PHA與糖原含量逐漸恢復(fù)至起始水平,其中PHA在前25 min(總反應(yīng)75～100 min)降低最快、糖原在總反應(yīng)100～150 min升高最快,最后分別穩(wěn)定在23.5%與18.4%。

投加SMZ的R2反應(yīng)器中PHA與糖原含量變化與R1較為接近,與R2反應(yīng)器中可溶性正磷酸鹽濃度變化規(guī)律相符,表明SMZ對活性污泥聚磷菌釋磷與吸磷過程影響相對較小。投加ZnO NPs的R3反應(yīng)器中PHA與糖原含量變化幅度較R1明顯增大,缺氧階段PHA含量由24.6%升至38.8%,糖原含量由19.1%降至9.4%,好氧階段PHA與糖原含量逐漸恢復(fù)至起始水平。好氧階段R1反應(yīng)器的PHA與糖原含量變化幅度分別為12.6%與7.7%,相比于空白組R1,R2與R3反應(yīng)器PHA變化幅度分別增加0.2%、1.6%,糖原變化幅度分別增加0.6%、1.2%,而R4反應(yīng)器PHA與糖原含量變化幅度最大,其變化幅度增加量超過R2與R3之和。

2.3 SMZ與ZnO NPs對污泥中微生物活性的影響

SOUR是評價活性污泥代謝活性的重要指標,能夠較為準確反映污泥處理性能的變化,圖4(a)為運行60 d后各反應(yīng)器中活性污泥SOUR測定結(jié)果。從圖中可以看出,R1～R4反應(yīng)器的SOUR值分別為38.5、30.5、25.8 mg O2/(g MLVSS·h)及18.1 mg O2/(g MLVSS·h),SMZ或ZnO NPs長期脅迫對活性污泥代謝活性均產(chǎn)生明顯抑制作用,造成SOUR顯著下降。

圖4 (a)SBR反應(yīng)器活性污泥SOUR及抑制率變化;(b)SBR反應(yīng)器活性污泥胞內(nèi)ROS含量變化;(c)SBR反應(yīng)器活性污泥ATP含量變化;(d)SBR反應(yīng)器活性污泥胞外LDH釋放量

污泥SOUR與微生物的細胞呼吸相關(guān),呼吸作用能夠提供微生物生長代謝所需能量,R2～R4反應(yīng)器中微生物呼吸抑制率分別達20.8%、33.0%、53.1%。SMZ通過干擾二氫葉酸合成影響微生物遺傳物質(zhì)代謝,從而對微生物生長代謝產(chǎn)生抑制作用,進而影響污泥代謝活性。鋅作為微生物必需元素,也是DNA、RNA聚合酶的組成組分,然而ZnO NPs的長期脅迫使Zn元素含量超過其閾值,從而影響微生物的正常代謝。此外,SMZ與ZnO NPs共存使R4反應(yīng)器的呼吸抑制率接近R2與R3反應(yīng)器之和,表明兩者共存使污泥代謝活性受到的抑制作用進一步增強,最終造成活性污泥處理性能顯著降低[16]。

目前,ROS的產(chǎn)生及氧化應(yīng)激作用被認為是評價納米材料毒性的最佳指標。因此,運行60 d后對各反應(yīng)器中污泥胞內(nèi)ROS含量進行測定,結(jié)果如圖4(b)所示。

從圖4(b)可以看出,R2反應(yīng)器中投加的SMZ屬于有機污染物,其胞內(nèi)ROS含量與空白組R1基本接近;而R3與R4反應(yīng)器中污泥胞內(nèi)ROS含量顯著增高,分別達到165.5%與173.4%。ZnO NPs能夠穿透細胞膜進入微生物細胞體內(nèi),并在細胞內(nèi)積蓄,誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS含量升高,進而導(dǎo)致溶酶體和線粒體的損傷、酶活性的降低[17],最終造成細胞分解凋亡。

ATP能夠作為衡量活性污泥中微生物活性的重要指標,表征生物降解過程中微生物新陳代謝速度的快慢。裝置運行60 d后,對各反應(yīng)器內(nèi)活性污泥中ATP含量進行測定,結(jié)果如圖4(c)所示。

從圖4(c)可以看出,以R1反應(yīng)器活性污泥中ATP含量為100%,R2～R4反應(yīng)器中ATP含量分別降至65.88%、33.74%和19.52%。與R3、R4反應(yīng)器相比,R2反應(yīng)器ATP含量降幅相對較小。SMZ能夠與污泥EPS結(jié)合形成EPS-SMZ穩(wěn)定化合物以減小其毒性,而SMZ的長期脅迫也使部分微生物菌群產(chǎn)生抗藥性,因此微生物活性有所恢復(fù),污泥中ATP含量受影響程度相對較小。ZnO NPs的投加造成Zn2+的溶出并產(chǎn)生氧化脅迫,從而導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)破壞、微生物活性降低[18]。同時投加SMZ與ZnO NPs的R4反應(yīng)器活性污泥中ATP含量降幅最大,達到80.48%,兩者共存使其生物毒性顯著增加,微生物能量代謝受到影響,導(dǎo)致微生物活性受到嚴重抑制。

LDH釋放已被廣泛用于評估有毒物質(zhì)對細胞生長代謝的影響,各反應(yīng)器運行60 d后活性污泥胞外LDH釋放量如圖4(d)所示。

從圖中可以看出,R2反應(yīng)器中LDH釋放量增加量較小,胞外LDH釋放相對空白組R1(100%)增長至108.8%,表明SMZ對微生物細胞膜完整性的破壞程度較小。在SMZ長期脅迫下,微生物體內(nèi)儲存的葉酸被消耗殆盡后,SMZ與對氨基苯甲酸競爭阻礙四氫葉酸的合成,進而抑制微生物的生長繁殖。

R3與R4反應(yīng)器胞外LDH釋放量顯著增加,分別增至169.5%與182.7%,表明ZnO NPs相比SMZ對微生物細胞完整性影響更大,這與污染物之間性質(zhì)差異有關(guān)。ZnO NPs作為一種納米金屬氧化物,在細胞內(nèi)產(chǎn)生過量ROS引起氧化應(yīng)激作用,從而導(dǎo)致細胞膜、蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)的破壞。此外,ZnO NPs溶出的Zn2+對微生物產(chǎn)生的毒性也會造成細胞凋亡。SMZ與ZnO NPs共存增加了Zn2+的溶出,對微生物活性產(chǎn)生更大抑制,造成更多細胞凋亡、LDH釋放。

3 結(jié)論

(1)R1反應(yīng)器具有良好的脫氮除磷能力;投加的SMZ或ZnO NPs吸附在微生物表面,阻礙外部營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞,影響微生物生長代謝,進而導(dǎo)致污泥活性與處理性能降低。

(2)R2～R4反應(yīng)器SMP含量隨運行時間逐漸增加,且以蛋白質(zhì)組分增加為主,其中R4反應(yīng)器增幅最大;PHA含量呈現(xiàn)缺氧升高、好氧降低的變化趨勢,糖原含量變化則相反;R2反應(yīng)器中PHA與糖原周期內(nèi)變化幅度與R1反應(yīng)器較為接近,而R3與R4反應(yīng)器中變化幅度則明顯增大,ZnO NPs的投加影響聚磷菌與聚糖菌的競爭關(guān)系,而SMZ與ZnO NPs共存使聚磷菌受影響程度增加、生物除磷能力降低。

(3)R1反應(yīng)器運行至60 d時SOUR值分別為38.5 mg O2/(g MLVSS·h),R2～R4反應(yīng)器SOUR明顯降低,R2反應(yīng)器污泥胞內(nèi)ROS含量與空白組R1基本相同,而R3與R4反應(yīng)器中ROS含量分別達到165.5%與173.4%。R2～R4反應(yīng)器中ATP含量相比空白組R1(100%)分別降至65.88%、33.74%和19.52%,LDH釋放量則分別達到108.8%、169.5%、182.7%。