胰島素對(duì)昆蟲病原線蟲卡森斯氏線蟲0657L生長(zhǎng)發(fā)育及其共生細(xì)菌伯氏致病桿菌0657L的影響

李茜童, 陳 紅, 王興鐸, 錢秀娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730070)

近年來,全球氣候變暖、產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、耕作制度變革、外來生物入侵等因素導(dǎo)致我國農(nóng)業(yè)害蟲發(fā)生危害依然嚴(yán)重,害蟲綠色防控仍然是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)(蕭玉濤等, 2019; 陸宴輝等, 2023)。生物防治的應(yīng)用和推廣是踐行綠色環(huán)保理念,維持生態(tài)平衡,促進(jìn)可持續(xù)發(fā)展的重要手段,其中昆蟲病原線蟲(etomopathogenic nematodes, EPNs)是備受重視的一種生防因子,在農(nóng)林牧草隱蔽性害蟲的生防領(lǐng)域占據(jù)關(guān)鍵地位(楊麗元, 2020)。昆蟲病原線蟲是一種寄生性線蟲,能夠感染并殺死多種寄主昆蟲,據(jù)統(tǒng)計(jì)對(duì)350種以上的害蟲具有控制效能,以斯氏屬Steinernema和異小桿屬Heterorhabditis為主(王杰等, 2021;Zhangetal., 2021)。昆蟲病原線蟲能夠自主搜尋并進(jìn)入合適的宿主昆蟲體內(nèi),破壞寄主的免疫反應(yīng),并有效地繁殖子代,子代繼續(xù)感染新的寄主昆蟲(Heryantoetal., 2022)。且由于昆蟲病原線蟲生命周期短,易于低成本大量人工培養(yǎng)繁殖,已經(jīng)被廣泛用于害蟲生物防治,可與低毒農(nóng)藥結(jié)合使用控制破壞性的農(nóng)業(yè)害蟲,主要用于難以防治的鉆蛀性害蟲和地下害蟲幼蟲的防治(謝欽銘和張選輝, 2002; 曹翠玲等, 2009; 朱小芳等, 2021)。

昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌隸屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)革蘭氏陰性菌(錢秀娟, 2014),與昆蟲病原線蟲互惠互利,二者共同起到致死寄主昆蟲的效果,斯氏屬和異小桿屬線蟲分別與致病桿菌屬Xenorhabdus和發(fā)光桿菌屬Photorhabdus細(xì)菌共生(王杰等, 2021)。昆蟲病原線蟲致死寄主昆蟲時(shí),侵染期幼蟲(infective juveniles, IJs)經(jīng)口、肛門及體壁進(jìn)入寄主昆蟲體內(nèi),向寄主昆蟲血腔釋放腸道內(nèi)攜帶的共生細(xì)菌,共生細(xì)菌大量繁殖并與昆蟲病原線蟲形成一個(gè)復(fù)合體打破寄主的生理平衡,在24～48 h內(nèi)致死寄主(叢斌等, 2000; 方香玲等, 2008; 王立婷等, 2013; 詹發(fā)強(qiáng)等, 2015; 顏珣和韓日疇, 2016)。在整個(gè)侵染過程中,線蟲為共生細(xì)菌提供生長(zhǎng)繁殖的環(huán)境,共生細(xì)菌為昆蟲病原線蟲提供營(yíng)養(yǎng)成分并產(chǎn)生毒素抑菌物,且為昆蟲病原線蟲的繁殖提供良好的環(huán)境條件。但線蟲與細(xì)菌的共生關(guān)系也有選擇性,每種昆蟲病原線蟲只能以與它共生的細(xì)菌培養(yǎng),而特定的共生細(xì)菌也只能培養(yǎng)產(chǎn)生它的線蟲(顏珣和韓日疇, 2016; 張潘杰等, 2021)。近期研究表明,嗜菌異小桿線蟲Heterorhabditisbacteriophora對(duì)共生細(xì)菌的專一性較斯氏線蟲更嚴(yán)格,不同種斯氏線蟲可以被同種共生細(xì)菌培養(yǎng),而嗜菌異小桿線蟲則不可以(李茜童等, 2022)。

昆蟲病原線蟲作為生物防治因子,存貯和運(yùn)輸是其商品制劑開發(fā)中最大的障礙,在生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用時(shí)其防效主要局限于線蟲制劑的貨架期(Georgisetal., 2006)。因此,為使昆蟲病原線蟲適應(yīng)環(huán)境中復(fù)雜的生物和非生物因素影響并延長(zhǎng)其制劑貨架期,利用內(nèi)源或外源化合物的補(bǔ)充延長(zhǎng)壽命、提高存活率及增強(qiáng)致病力尤為重要(錢秀娟等, 2019)。胰島素是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖和精氨酸等的誘發(fā)而分泌的蛋白質(zhì)類激素(彭竹清和郝友進(jìn), 2019),研究表明,控制胰島素信號(hào)通路對(duì)昆蟲及昆蟲病原線蟲同科生物秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans的抵抗衰老,增強(qiáng)線蟲的抗應(yīng)激能力,延長(zhǎng)線蟲壽命,改善健康水平等方面具有重要的調(diào)控作用(李慧萍和韓日疇, 2007; 謝鵬飛等, 2018; 況琪斐等, 2021)。線蟲與共生細(xì)菌在致死寄主昆蟲的過程中均起到重要作用,胰島素對(duì)共生細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育及線蟲-共生細(xì)菌復(fù)合體的作用如何,目前報(bào)道尚少,因此研究胰島素對(duì)昆蟲病原線蟲及其共生細(xì)菌的影響具有理論意義,同時(shí)對(duì)延長(zhǎng)昆蟲病原線蟲制劑貨架期及昆蟲病原線蟲在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中充分發(fā)揮更廣泛的應(yīng)用潛力具有實(shí)踐意義(Luetal., 2016)。

本研究以從甘肅地區(qū)篩選的抗旱性品系卡森斯氏線蟲Steinernemakraussei0657L為材料,將不同濃度胰島素滴加到共生細(xì)菌伯氏致病桿菌Xenorhabdusbovenii0657L的單菌落,觀測(cè)菌落生長(zhǎng)情況,測(cè)定其培養(yǎng)線蟲壽命及運(yùn)動(dòng)和吞咽能力的方法,明確胰島素的補(bǔ)充對(duì)昆蟲病原線蟲及其共生細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育的影響,以闡明胰島素與昆蟲病原線蟲及其共生細(xì)菌的關(guān)系,為昆蟲病原線蟲的壽命延長(zhǎng)研究、制劑化生產(chǎn)及防效的提高提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與線蟲

大蠟螟Galleriamellonella由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室提供,實(shí)驗(yàn)用大蠟螟3齡幼蟲經(jīng)滯育處理,以防止吐絲、化蛹。采用對(duì)蠐螬、韭蛆及模式昆蟲大蠟螟致病力及生物學(xué)特性較好的昆蟲病原線蟲卡森斯氏線蟲0657L,均由大蠟螟老熟幼蟲培養(yǎng)、繁殖,懸浮液貯存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與器材

胰島素母液(1 mL pH 2鹽酸溶液加入1 mg胰島素干粉,胰島素干粉購于生工生物工程上海股份有限公司,純度>95%);蒸餾水;75%酒精;林格氏液(蒸餾水1 000 mL,氯化鈉8.6 g,氯化0.3 g,氯化鈣0.28 g)。NBTB培養(yǎng)基:無菌水1 000 mL,瓊脂15 g,LB瓊脂預(yù)混干粉40 g,溴百里酚藍(lán)0.01 g,搖勻,121 ℃,1 240 Pa滅菌20 min。LB培養(yǎng)基:營(yíng)養(yǎng)肉湯8 g,瓊脂15 g,酵母粉5 g,六水合氯化鎂(MgCl2·6H2O) 2 g,蒸餾水900 mL,搖勻,121 ℃,1 240 Pa滅菌20 min。玉米糖漿7 mL,玉米胚芽油4 mL,蒸餾水89 mL,混合均勻,加入無菌的培養(yǎng)液中。TSY液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨大豆肉湯40 g/L,酵母提取物5 g/L。

體視顯微鏡(Stemi 305,德國Zeiss公司),高壓滅菌鍋(GI54DWS,致微儀器有限公司),超凈工作臺(tái)(HCB-1300V,青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司),二氧化碳光照培養(yǎng)箱(SPX-250-GB-CO2,上海躍進(jìn)器械醫(yī)療有限公司),冰箱(BCD-656 WDPT,青島海爾股份有限公司),超純水儀(GWB-2,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司),電子天平(ER-180,AND),玻璃棒,酒精燈,9 cm培養(yǎng)皿,3.5 cm培養(yǎng)皿,移液槍,圓形濾紙,剪刀,接種環(huán),封口膜,脫脂棉等。

1.3 卡森斯氏線蟲0657L侵染大蠟螟后共生細(xì)菌的分離、純化和鑒定

將經(jīng)過75%酒精體表消毒的大蠟螟3齡幼蟲(生理活性基本一致)各5頭置于墊有兩層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中,吸取1.5 mL 3 000頭/mL的卡森斯氏線蟲0657L懸浮液侵染大蠟螟,25 ℃培養(yǎng)24 h后將大蠟螟第1對(duì)胸足末端剪破,從蟲體尾部向前按壓至被共生細(xì)菌侵染的大蠟螟的血液從傷口處滴落在NBTB培養(yǎng)基上。用接菌環(huán)蘸取大蠟螟體液劃Z字型后密封培養(yǎng)基,置于25 ℃培養(yǎng)箱中,待菌體長(zhǎng)出,吸收培養(yǎng)基中溴百里酚藍(lán)染料且菌體呈綠色的則確定為昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌(楊亞賢等, 2023)。將單菌落轉(zhuǎn)移至新的NBTB平板培養(yǎng)基上,繼續(xù)劃線進(jìn)行共生細(xì)菌的二次純化,以此重復(fù),直到培養(yǎng)純化出均勻的單菌落。挑取其中的初生型單菌落轉(zhuǎn)移至LB平板培養(yǎng)基,在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后將共生細(xì)菌單菌落挑取至TSY培養(yǎng)基中,在28 ℃ 180 r/min搖床中培養(yǎng)48 h,得到共生細(xì)菌發(fā)酵液,4 ℃保存?zhèn)溆?。?jīng)課題組鑒定,卡森斯氏線蟲0657L的共生細(xì)菌為伯氏致病桿菌Xenorhabdusbovenii0657L(張文德等, 2023)。在LB培養(yǎng)基上接種上述純化的共生細(xì)菌伯氏致病桿菌0657L作為卡森斯氏線蟲0657L的食物, 25 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.4 胰島素對(duì)卡森斯氏線蟲0657L壽命、運(yùn)動(dòng)能力和吞咽能力的影響的測(cè)定

在光學(xué)顯微鏡下將卡森斯氏線蟲0657L懷卵大母蟲挑至新的用劃線法培養(yǎng)有伯氏致病桿菌0657L的LB培養(yǎng)基中,子代產(chǎn)出后將大母蟲挑走,子代繼續(xù)置于25 ℃中培養(yǎng)。為了抑制卡森斯氏線蟲0657L產(chǎn)卵,子代幼蟲期的第0-5天LB中含5 μmol/L五氟尿嘧啶,待卡森斯氏線蟲0657L生長(zhǎng)至第6天時(shí)轉(zhuǎn)至普通的LB上,此時(shí)的線蟲生長(zhǎng)至同一生長(zhǎng)時(shí)期J3。挑取NBTB培養(yǎng)基上菌落大小一致(挑取的菌量也基本一致)的伯氏致病桿菌0657L單菌落至直徑3.5 cm的LB培養(yǎng)基上,隨機(jī)分為8組,隨后每個(gè)單菌落立即分別滴加10 μL胰島素母液與林格氏液體積比為1∶500和1∶5 000及林格氏液(現(xiàn)配現(xiàn)用),另設(shè)1組不加胰島素和林格氏液的空白對(duì)照,處理后每24 h在體視顯微鏡下用十字交叉法測(cè)量菌落直徑1次并記錄,計(jì)算1～6 d時(shí)伯氏致病桿菌0657L的生長(zhǎng)速率,生長(zhǎng)速率(%)=(Dt-Dt-1)/t×100(D為共生細(xì)菌單菌落直徑;t為時(shí)間,單位d)。將同期化J3卡森斯氏線蟲0657L轉(zhuǎn)移到上述胰島素處理48 h時(shí)的伯氏致病桿菌0657L的LB上培養(yǎng),此時(shí)記為實(shí)驗(yàn)第0天。為保證食物充足和藥物濃度,每3 d將卡森斯氏線蟲0657L轉(zhuǎn)移至新的接有胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L的LB上,每天監(jiān)測(cè)卡森斯氏線蟲0657L的存活情況,直至所有卡森斯氏線蟲0657L死亡(卡森斯氏線蟲0657L對(duì)鉑絲的輕微機(jī)械觸碰無反應(yīng)即視為死亡),記錄存活時(shí)間,計(jì)算壽命和存活率。每組至少3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)30條線蟲。

隨機(jī)選取胰島素處理3 d(3齡幼蟲), 7 d(4齡幼蟲)和11 d(成蟲)時(shí)的卡森斯氏線蟲0657L挑取至未培養(yǎng)伯氏致病桿菌0657L的空白LB培養(yǎng)基上,使其在自由運(yùn)動(dòng)過程中除掉蟲身黏附的共生細(xì)菌后,記錄30 s內(nèi)卡森斯氏線蟲0657L頭部來回?cái)[動(dòng)的次數(shù)(即為衡量卡森斯氏線蟲0657L運(yùn)動(dòng)能力的標(biāo)準(zhǔn)),從一側(cè)擺動(dòng)到另一側(cè)再擺回來視為1次。每組至少5條線蟲,每條線蟲統(tǒng)計(jì)至少統(tǒng)計(jì)3次,取其平均值作為最終結(jié)果。隨機(jī)選取胰島素處理3 d(3齡幼蟲), 7 d(4齡幼蟲)和11 d(成蟲)時(shí)的卡森斯氏線蟲0657L,直接在卡森斯氏線蟲0657L生長(zhǎng)培養(yǎng)基上對(duì)其30 s內(nèi)吞咽次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),用鉑絲輕輕觸碰卡森斯氏線蟲0657L,觀察并記錄卡森斯氏線蟲0657L咽部中食道球前后抽動(dòng)次數(shù)。每組至少5條卡森斯氏線蟲0657L。每條卡森斯氏線蟲0657L至少統(tǒng)計(jì)3次,取其平均值作為最終結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)分析

卡森斯氏線蟲0657L壽命數(shù)據(jù)采用long rank test統(tǒng)計(jì)方法,伯氏致病桿菌0657L菌落直徑和生長(zhǎng)速率以及卡森斯氏線蟲0657L運(yùn)動(dòng)和吞咽數(shù)據(jù)采用LSD多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析,所用分析及作圖軟件包括Excle 2016, SPSS 19.0和Origin 2021等。

2 結(jié)果

2.1 胰島素對(duì)病原線蟲卡森斯氏線蟲0657L共生細(xì)菌伯氏致病桿菌0657L菌落直徑的影響

1∶500和1∶5 000濃度胰島素處理0～1 d時(shí)伯氏致病桿菌0657L生長(zhǎng)較慢,所有單菌落均未長(zhǎng)出; 2～6 d時(shí),與空白對(duì)照組(CK)相比,1∶500和1∶5 000濃度胰島素處理組伯氏致病桿菌0657L菌落直徑顯著增大(P<0.05),且低濃度(1∶5 000)胰島素處理組菌落直徑與高濃度(1∶500)濃度胰島素處理組相比促進(jìn)作用更明顯,但二者之間沒有顯著差異(P>0.05)。在整個(gè)觀察時(shí)間段內(nèi),除1 d時(shí)各處理組未生長(zhǎng)外, 2～6 d時(shí), 1∶5 000濃度胰島素下, 菌落直徑分別為2.89, 3.68, 4.06, 4.52和4.85 mm, 較空白對(duì)照組分別增大77.2%, 27.6%, 19.8%, 19.5%和17.6%; 與空白對(duì)照組相比, 1∶500濃度胰島素處理組菌落直徑分別增大54.0%, 20.1%, 14.2%, 15.1%和14.9%(圖1, 2)。

圖1 1∶500和1∶5 000濃度胰島素下伯氏致病桿菌0657L培養(yǎng)3 d時(shí)的單菌落形態(tài)

圖2 1∶500和1∶5 000濃度胰島素下伯氏致病桿菌 0657L菌落直徑

2.2 胰島素對(duì)伯氏致病桿菌0657L生長(zhǎng)速率的影響

根據(jù)伯氏致病桿菌0657L的生長(zhǎng)速率繪制曲線圖(圖3),伯氏致病桿菌0657L的生長(zhǎng)速率在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)呈現(xiàn)由快至慢的趨勢(shì),符合邏輯斯蒂生長(zhǎng)曲線。1～2 d時(shí),由于菌落生長(zhǎng)緩慢,顯微鏡下觀察不到明顯菌落,即為延緩期;2～3 d時(shí),菌落快速生長(zhǎng),即為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,共生細(xì)菌生長(zhǎng)速度最快;1∶500和1∶5 000胰島素處理組共生細(xì)菌生長(zhǎng)速率較空白對(duì)照組(CK)和林格氏液組顯著(P<0.05)加快,分別由空白對(duì)照組的68.0 μm/d提高至104.7和120.4 μm/d。1∶500胰島素處理組較空白對(duì)照組和林格氏液組分別加快36.7和30.6 μm/d,1∶5 000濃度下,較空白對(duì)照組和林格氏液組分別加快52.5和46.4 μm/d,但高濃度(1∶500)處理組與低濃度(1∶5 000)處理組之間無顯著差異(P>0.05)。3～7 d時(shí),菌落的生長(zhǎng)速率明顯變慢, 后逐漸趨于平穩(wěn), 即為穩(wěn)定期。

圖3 1∶500和1∶5 000濃度胰島素下伯氏致病桿菌 0657L生長(zhǎng)速率

2.3 胰島素對(duì)卡森斯氏線蟲 0657L壽命的影響

結(jié)果表明(圖4),取食不同濃度胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L可以延長(zhǎng)自然狀態(tài)下卡森斯氏線蟲0657L壽命。與空白對(duì)照組(CK)相比,取食1∶5 000 胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L后卡森斯氏線蟲 0657L的平均壽命由11.0 d延長(zhǎng)至14.0 d, 延長(zhǎng)了27.3%, 1∶500濃度胰島素處理組較1∶5 000處理組的效果更好,卡森斯氏線蟲0657L平均壽命為16.0 d,延長(zhǎng)了45.5%。綜上所述,不同濃度胰島素均可以延長(zhǎng)卡森斯氏線蟲0657L壽命,但兩處理濃度胰島素處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖4 取食1∶500和1∶5 000濃度胰島素處理 48 h時(shí)的伯氏致病桿菌0657L后卡森斯氏線蟲0657L的壽命

2.4 胰島素對(duì)卡森斯氏線蟲0657L運(yùn)動(dòng)能力的影響

結(jié)果如圖5所示,與空白對(duì)照組(CK)相比,卡森斯氏線蟲0657L在3齡幼蟲期(胰島素處理3 d時(shí)),胰島素的補(bǔ)充可顯著加快卡森斯氏線蟲0657L的每30 s頭部擺動(dòng)次數(shù),取食1∶5 000和1∶500胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L后卡森斯氏線蟲0657L頭部擺動(dòng)頻率由28.4次/30 s分別加快到44.4次/30 s和49.6次/30 s,分別顯著提高了56.3%和74.7%(P<0.05)?？ㄉ故暇€蟲0657L在4齡幼蟲期(胰島素處理7 d時(shí)),與空白對(duì)照組相比,取食高濃度(1∶500)胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L后卡森斯氏線蟲0657L頭部擺動(dòng)頻率為57.2次/30 s,顯著提高了47.4%(P<0.05);而取食低濃度(1∶5 000)胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L后卡森斯氏線蟲0657L頭部擺動(dòng)頻率無顯著差異(P>0.05)。而在卡森斯氏線蟲0657L生命的后期成蟲期(胰島素處理11 d時(shí)),運(yùn)動(dòng)能力較3齡幼蟲略強(qiáng),較4齡幼蟲期略弱,但與空白對(duì)照組相比,不同濃度的胰島素加入對(duì)線蟲的運(yùn)動(dòng)能力均有所提高,但并無顯著差異(P>0.05)。綜上所述,胰島素的補(bǔ)充有助于卡森斯氏線蟲0657L抵御運(yùn)動(dòng)能力的衰退,且不同濃度處理組的效果也不同,高濃度對(duì)線蟲運(yùn)動(dòng)能力衰退的延緩作用更強(qiáng)。

圖5 取食1∶500和1∶5 000濃度胰島素處理48 h時(shí)的伯氏致病桿菌0657L后卡森斯氏線蟲 0657L的每30 s頭部擺動(dòng)次數(shù)

2.5 胰島素對(duì)卡森斯氏線蟲0657L吞咽能力的影響

結(jié)果顯示(圖6),胰島素的補(bǔ)充在卡森斯氏線蟲0657L 3齡幼蟲期(胰島素處理3 d時(shí))、4齡幼蟲期(胰島素處理7 d時(shí))和成蟲期(胰島素處理11 d時(shí))均可顯著提高卡森斯氏線蟲0657L的吞咽能力。與空白對(duì)照組(CK)相比,3齡幼蟲期時(shí),取食1∶5 000和1∶500胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L后,卡森斯氏線蟲0657L吞咽頻率由11.0次/30 s分別提高到16.6次/30 s和18.2次/30 s,分別顯著提高了50.9%和65.5%(P<0.05);4齡幼蟲期時(shí)吞咽頻率由14.2 次/30 s分別提高到18.0 次/30 s和19.2次/30 s,分別顯著提高了26.8%和35.2%(P<0.05);11 d時(shí)吞咽頻率由11.8次/30 s分別提高到14.6次/30 s和15.0次/30 s,分別顯著提高了23.7%和21.1%(P<0.05)。而且同運(yùn)動(dòng)能力一樣,成蟲期較3齡幼蟲期略強(qiáng),較4齡幼蟲期略弱。綜上所述, 胰島素能夠提高卡森斯氏線蟲0657L吞咽頻率, 且不同濃度處理組促進(jìn)作用略有差異, 高濃度較低濃度對(duì)吞咽能力的促進(jìn)作用更明顯。

圖6 取食1∶500和1∶5 000濃度胰島素處理48 h時(shí)的伯氏致病桿菌0657L后卡森斯氏線蟲 0657L的每30 s吞咽次數(shù)

3 討論與結(jié)論

昆蟲病原線蟲進(jìn)入昆蟲體內(nèi)后,將其攜帶的共生細(xì)菌釋放于寄主昆蟲的血淋巴中,共生細(xì)菌迅速繁殖產(chǎn)生殺蟲毒素,昆蟲病原線蟲自身分泌的毒素結(jié)合共生細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)分解寄主昆蟲組織,使寄主昆蟲在短時(shí)間內(nèi)患敗血癥死亡(王大業(yè), 2020)。目前已經(jīng)有對(duì)昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌的殺蟲蛋白和共生菌代謝產(chǎn)物開發(fā)的研究,結(jié)果表明,共生細(xì)菌具有殺蟲活性主要是其代謝產(chǎn)物中的血腔活性物質(zhì)起作用(彭劉亮, 2017),包括抑菌活性物質(zhì)(黃武仁等, 2005; Fangetal., 2011; Binda-Rossettietal., 2016)、殺蟲毒素(Bowenetal., 1998; Sheetsetal., 2011; Yangetal., 2012)、抗癌活性物質(zhì)(Paiketal., 2001)等,在目前的相關(guān)研究中,昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌常被用作生物制劑應(yīng)用于害蟲生物防治及生態(tài)環(huán)保領(lǐng)域。本研究結(jié)果表明,共生細(xì)菌作為昆蟲病原線蟲在寄主昆蟲體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖的重要介體,其生長(zhǎng)發(fā)育可以受胰島素的調(diào)控,共生細(xì)菌可以直接吸收利用胰島素。本研究結(jié)果將在利用昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物提高對(duì)害蟲的致病力方面提供新思路(吳文丹等, 2014; 王杰等, 2021),而對(duì)于共生細(xì)菌的具體殺蟲機(jī)制以及能否利用胰島素提高共生細(xì)菌代謝產(chǎn)物活性,尤其是血腔活性物質(zhì)的活性,進(jìn)而改善昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌的殺蟲效果等問題還尚不明確,這也將成為未來新的研究方向。

本研究結(jié)果表明,一定濃度胰島素處理會(huì)促進(jìn)共生細(xì)菌伯氏致病桿菌0657L菌落的生長(zhǎng)(圖1, 2),不同濃度的胰島素對(duì)伯氏致病桿菌0657L生長(zhǎng)速率的提高程度不同,低濃度胰島素(1∶5 000)較高濃度胰島素處理(1∶500)生長(zhǎng)快(圖3)。而有趣的是,高濃度胰島素(1∶500)處理的伯氏致病桿菌0657L飼喂的卡森斯氏線蟲0657L運(yùn)動(dòng)和吞咽能力均強(qiáng)于低濃度胰島素(1∶5 000)處理的伯氏致病桿菌0657L飼喂的卡森斯氏線蟲0657L(圖5, 6)。在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)上表現(xiàn)為促進(jìn)共生細(xì)菌生長(zhǎng)速率加快的最佳濃度為1∶5 000,而促進(jìn)線蟲行為學(xué)能力增強(qiáng)的最佳濃度是1∶500。這表明,胰島素對(duì)卡森斯氏線蟲0657L生長(zhǎng)發(fā)育及其體內(nèi)分離出的共生細(xì)菌伯氏致病桿菌0657L的生長(zhǎng)都有影響,但可能因?yàn)榧?xì)菌和線蟲的生長(zhǎng)繁殖方式不同,對(duì)胰島素的吸收和利用的方式也不同,因此共生細(xì)菌在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出低濃度胰島素處理下直徑更大,而被取食后,仍然為高濃度更有利于線蟲抵抗運(yùn)動(dòng)和吞咽能力衰退,這就與營(yíng)養(yǎng)成分利用有關(guān),具體機(jī)理還有待進(jìn)一步考究。

胰島素作為一種內(nèi)分泌激素,與細(xì)胞生長(zhǎng)、壽命、營(yíng)養(yǎng)、生殖有關(guān),還可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及脂肪儲(chǔ)存,防止脂肪分解等。胰島素在機(jī)體中的功能表現(xiàn)在多個(gè)方面,涉及受體結(jié)合,信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)和缺陷的糾正等,進(jìn)食和禁食期間能量的儲(chǔ)存和釋放,基本由胰島素調(diào)控,是生物體生存的重要方面(Mayeretal., 2007; 顧世紅和陳建國, 2009; Thevisetal., 2010)。胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin growth factor, IGF)和胰島素樣肽(insulin-like peptide, ILP)通常與維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)有關(guān),當(dāng)機(jī)體內(nèi)胰島素分泌不足時(shí),來自食物的糖分就只流動(dòng)在血液中,無法進(jìn)入細(xì)胞為機(jī)體所用,此時(shí)胰島素的補(bǔ)充能夠幫助食物中的糖分順利進(jìn)入機(jī)體內(nèi)各組織細(xì)胞以提供能量(顧世紅和陳建國, 2009),這種功能在昆蟲(果蠅)和秀麗隱桿線蟲中是保守的(Thevisetal., 2010; Graham and Pick, 2017),此外,胰島素在代謝、生長(zhǎng)、繁殖、成蟲健康和衰老方面也發(fā)揮著重要作用(Hafen, 2004)。胰島素信號(hào)通路是高度保守的衰老調(diào)控通路,包括Ins R/IRS-1通路和RAS/MAPK通路(Beale, 2013)。其中IRS-1可通過PI3K/Akt通路起到促進(jìn)胰島素影響葡萄糖代謝與脂質(zhì)代謝的作用,該通路中胰島素受體同源蛋白daf-16受基因daf-2負(fù)調(diào)控(張思雨等, 2022)。本研究發(fā)現(xiàn),胰島素處理在明顯促進(jìn)卡森斯氏線蟲0657L共生細(xì)菌的生長(zhǎng)的同時(shí),有延長(zhǎng)昆蟲病原線蟲壽命、抵御運(yùn)動(dòng)和吞咽能力衰退作用。這可以說明昆蟲病原線蟲作為共生細(xì)菌的攜帶者,能夠通過胰島素處理的特異性共生細(xì)菌間接地影響昆蟲病原線蟲體內(nèi)新陳代謝信號(hào)的傳導(dǎo)(共生細(xì)菌吸收胰島素后長(zhǎng)勢(shì)更佳,為昆蟲病原線蟲提供穩(wěn)定的生活環(huán)境和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),其中蛋白質(zhì)、脂類及少量糖類參與其體內(nèi)細(xì)胞膜的組成,細(xì)胞膜完整保證了細(xì)胞的正常能量和物質(zhì)交流),從而起到抗衰老的作用,初步揭示了胰島素在昆蟲病原線蟲及其共生細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。

研究表明,壽命的延長(zhǎng)通常是與飲食限制(dietary restriction, DR)和熱量限制(caloric restriction, CR)有關(guān)的,且飲食限制誘導(dǎo)的壽命延長(zhǎng)的其中一個(gè)關(guān)鍵通路是IIS(胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子1)信號(hào)傳導(dǎo)(N?ssel and Vanden, 2016)。在本研究中,吞咽試驗(yàn)為直接在線蟲生長(zhǎng)培養(yǎng)基上統(tǒng)計(jì)中食道球抽動(dòng)次數(shù),即線蟲正常取食,說明并未造成飲食限制(即饑餓),而已有報(bào)道線蟲(秀麗隱桿線蟲)可在多種不同飲食限制方案下主要通過激活LET-363/mTOR和IIS兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)物傳感途徑延長(zhǎng)壽命(Greer and Brunet, 2009),結(jié)合上述證據(jù),可推斷胰島素能夠延長(zhǎng)昆蟲病原線蟲的壽命,且排除胰島素對(duì)卡森斯氏線蟲0657L壽命的延長(zhǎng)作用是由飲食限制引起的可能性,這與人類醫(yī)學(xué)模式生物秀麗隱桿線蟲C.elegans的壽命研究結(jié)果并不完全吻合。鑒于本研究中線蟲攝食正常但最終得到壽命延長(zhǎng)的結(jié)論,初步猜想是某些酶通過IIS通路中的靶標(biāo)基因(如UTX-1)調(diào)控壽命(Greer and Brunet, 2009),共生細(xì)菌吸收胰島素后為卡森斯氏線蟲0657L提供豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,線蟲充分利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)至體內(nèi)蛋白(酶)合成達(dá)到平衡時(shí),相應(yīng)靶標(biāo)基因所在的信號(hào)通路關(guān)閉,基因表達(dá)量降低,衰老相關(guān)細(xì)胞功能維持穩(wěn)態(tài),壽命得以延長(zhǎng)。這也恰好說明,壽命不僅在遺傳水平上被調(diào)控,而且與新陳代謝調(diào)節(jié)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也密切相關(guān)。

研究使用胰島素處理的共生細(xì)菌培養(yǎng)卡森斯氏線蟲0657L,發(fā)現(xiàn)線蟲生長(zhǎng)早期,頭部擺動(dòng)次數(shù)和吞咽次數(shù)均較慢,生命中期,其頭部擺動(dòng)頻率和咽泵吞咽頻率均提高,直到生命后期又有一定程度的下降,說明線蟲的衰老隨著生命過程而發(fā)生,主要體現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)和吞咽能力上。運(yùn)動(dòng)和吞咽與肌肉功能息息相關(guān)(Dall and F?rgeman, 2019; 劉嘉榆, 2022),3個(gè)不同生長(zhǎng)階段中的胰島素處理組運(yùn)動(dòng)和吞咽能力均較對(duì)照組強(qiáng),表明胰島素可以提高線蟲的肌肉功能,起到有效抵抗衰老的作用。

綜上所述,胰島素的補(bǔ)充可以促進(jìn)昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌的生長(zhǎng),能夠延長(zhǎng)昆蟲病原線蟲的平均壽命并提高運(yùn)動(dòng)和吞咽能力。本研究?jī)H證實(shí)了胰島素在線蟲生物學(xué)特征方面的作用,為昆蟲病原線蟲的制劑化提供了新的思路,也為昆蟲病原線蟲在生物防治領(lǐng)域的進(jìn)一步高效開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。為明確其作為調(diào)控機(jī)體代謝的重要物質(zhì)在表觀遺傳學(xué)上是否也具有類似的作用,具體的作用機(jī)制如何,還需通過分子生物學(xué)技術(shù)手段的進(jìn)一步探究。