甲狀腺全切+L-T4皮下注射建立孕期亞臨床甲減大鼠模型及穩(wěn)定性研究*

李曉鈺,付 強(qiáng),黃楊玲,謝良卓,陳 巍,2△

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110847;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院干診科,遼寧 沈陽(yáng) 110034)

亞臨床甲狀腺功能減退癥(SCH)簡(jiǎn)稱亞臨床甲減,其主要特點(diǎn)是血清促甲狀腺激素(TSH)升高,而血清游離甲狀腺素(FT4)水平正常[1-2]。SCH在我國(guó)的患病率為16.7%[3],其中妊娠期SCH的發(fā)病率占2.0%～5.0%[4],因其可影響后代腦發(fā)育及增加母體流產(chǎn)的發(fā)生率而被重視,但關(guān)于該病的發(fā)病機(jī)制尚未明確,是內(nèi)分泌領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。因此,更好地建立妊娠期SCH大鼠模型對(duì)該病的研究具有重要意義。本研究應(yīng)用甲狀腺全切術(shù)+L-T4皮下注射的方法進(jìn)行孕期SCH大鼠造模,并對(duì)其進(jìn)行模型評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為26只體重在180～200 g的雌性SD大鼠(購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為:SCXK(京)2019-0008。SD大鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室),給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)用藥 T4(美國(guó)Sigma公司,XW00514 891);乳酸鈣(批號(hào):C190420P)。

1.2.2分組與造模 將26只SD大鼠在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,并進(jìn)行分組,隨機(jī)分為2組(對(duì)照組10只,模型組16只)。術(shù)前禁飲24 h,用10%、0.35 mL/100 g劑量的水合氯醛注射液進(jìn)行腹腔注射麻醉,術(shù)中局部切口給予23單位注射用青霉素鈉鹽3～4滴以防感染,術(shù)后對(duì)照組給予高鈣水。具體操作:模型組將大鼠呈仰臥姿勢(shì)固定在實(shí)驗(yàn)室手術(shù)板上,頸部進(jìn)行備皮,然后用75%濃度的乙醇局部消毒,鋪巾,沿胸骨向前行1.5～2.0 cm的頸部正中切口,鈍性分離皮下組織,逐一鈍性分離結(jié)締組織、肌肉層,可見一呈蝴蝶型粉色附著于氣管上的甲狀腺組織,將氣管與兩側(cè)肌肉分離,取甲狀腺底部,剝離,并將小塊棉球塞于術(shù)側(cè)進(jìn)行止血,再用上述方式處理對(duì)側(cè)。注意要將氣管上的甲狀腺峽部剝離,術(shù)中避免損傷頸部動(dòng)脈與靜脈血管,避免長(zhǎng)時(shí)間夾持氣管。切口用生理鹽水進(jìn)行沖洗,再用無(wú)菌紗布擦干術(shù)野,在切口處滴注23單位的注射用青霉素鈉鹽3～4滴以防止感染,后將肌肉、皮膚切口分層縫合。術(shù)后予以普通飼料和0.1%乳酸鈣飲用水飼養(yǎng),以防術(shù)后缺鈣。對(duì)照組僅充分暴露甲狀腺后,立即縫合。術(shù)后1個(gè)月,2組大鼠進(jìn)行眶后靜脈叢取血,離心后取上清液,存放于EP管中待檢測(cè)。

當(dāng)模型組血清TSH值高于對(duì)照組最大值,且TT4值小于對(duì)照組最小值時(shí),則提示甲狀腺全部切除干凈,模型組予以L-T41.0 μg/(100 g·d)皮下注射,對(duì)照組給予等劑量生理鹽水皮下注射,每天檢測(cè)體重,根據(jù)體重調(diào)整L-T4給藥劑量,10 d后再次檢測(cè)血清TSH、TT4。當(dāng)模型組血清TSH值高于對(duì)照組最大值,且TT4值與對(duì)照組數(shù)值無(wú)明顯差異時(shí),則提示非孕期SCH模型建立成功。非孕期SCH模型建立成功后,以雌鼠:雄鼠=2:1的比例進(jìn)行合籠交配,每天進(jìn)行陰道涂片,當(dāng)雌鼠的陰道涂片在鏡下發(fā)現(xiàn)精子時(shí),記為妊娠0 d即E0,妊娠13 d記為E13,并在此期間皮下注射L-T4。

1.2.3指標(biāo)監(jiān)測(cè) 監(jiān)測(cè)2組大鼠術(shù)后1個(gè)月、甲狀腺全切+L-T410 d后、E13這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清TSH、TT4水平和體重,以及各組大鼠平均產(chǎn)子數(shù)量及生產(chǎn)率。采用ELISA方法檢測(cè)血清TSH水平(術(shù)后TSH檢測(cè)試劑盒:武漢優(yōu)爾生;CEA463Ra-48T/術(shù)后+L-T4TSH檢測(cè)試劑盒:德國(guó)LDN;ARE-8600-48T/E13TSH檢測(cè)試劑盒:CEA463Ra)。采用放免法檢測(cè)TT4水平(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)放射免疫科檢測(cè))。

2 結(jié) 果

2.12組大鼠不同時(shí)期血清TSH水平變化比較 模型組大鼠術(shù)后1個(gè)月血清TSH水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。甲狀腺全切+L-T410 d后,模型組大鼠血清TSH水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。妊娠13 d時(shí),模型組大鼠血清TSH水平明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 2組大鼠不同時(shí)期血清TSH水平變化比較

2.22組大鼠不同時(shí)期血清TT4水平變化比較 模型組大鼠術(shù)后1個(gè)月血清TT4水平小于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2組大鼠甲狀腺全切+L-T410 d后血清TT4水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。妊娠13 d時(shí),2組大鼠TT4水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組大鼠不同時(shí)期血清TT4水平變化比較

2.32組大鼠不同時(shí)期體重變化比較 2組大鼠術(shù)前體重比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后1個(gè)月、甲狀腺全切+L-T410 d,模型組大鼠體重明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。妊娠13 d時(shí),模型組大鼠體重明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 2組大鼠不同時(shí)期體重比較

2.42組大鼠平均產(chǎn)子數(shù)及生產(chǎn)情況比較 2組大鼠平均產(chǎn)子數(shù)均為12只,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組大鼠生產(chǎn)率[90.00%(9/10)]高于模型組[43.75%(7/16)],但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

妊娠期SCH是一種內(nèi)分泌疾病,其對(duì)妊娠結(jié)局有著顯著的不良影響,如流產(chǎn)、妊娠期高血壓、胎盤早剝、先兆子癇、妊娠糖尿病、宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、早產(chǎn)和低出生體重[5-8]。此外母體甲狀腺激素水平對(duì)維持正常的妊娠和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育起著關(guān)鍵作用,與后代的神經(jīng)智力發(fā)育障礙密切相關(guān)[9]。妊娠期母體甲狀腺激素需求持續(xù)增長(zhǎng),若孕婦無(wú)法適應(yīng)甲狀腺激素應(yīng)激反應(yīng),易導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂,增加妊娠期甲狀腺功能減退風(fēng)險(xiǎn)[10]。相關(guān)研究指出,妊娠期SCH同樣可增加不良妊娠結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)[11]。甲狀腺激素在胎兒腦發(fā)育過(guò)程中占據(jù)著重要地位,在妊娠12周以前,胎兒甲狀腺功能尚未完全建立,胎兒腦發(fā)育所需的甲狀腺激素幾乎全部依賴于母體供給[12];如果在妊娠期間,母體發(fā)生甲狀腺激素缺乏,將會(huì)對(duì)胎兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育造成明顯且不可逆轉(zhuǎn)的損傷[13],可引起記憶力減退及情感行為障礙,其發(fā)病機(jī)制與腦組織處于輕微甲狀腺激素缺乏有關(guān)[14]。由于SCH具有隱匿性、無(wú)明顯癥狀反應(yīng),僅有TSH水平呈輕度或中度升高,易被臨床篩查忽略或漏診,因此妊娠期SCH患病率并未得到控制[15]。

妊娠中的SCH具有越來(lái)越重要的臨床意義,因此建立可靠的模型是進(jìn)行各項(xiàng)研究的基礎(chǔ)與關(guān)鍵。目前,SCH的造模方式分為2種:第1種是應(yīng)用抗甲狀腺藥物,例如甲巰咪唑飲水喂養(yǎng)構(gòu)建SCH模型[3];第2種是應(yīng)用甲狀腺全切術(shù)再植入L-T4微滲泵,并根據(jù)體重的變化調(diào)整L-T4給藥劑量來(lái)構(gòu)建SCH模型[16]。由于抗甲狀腺藥物致使母鼠SCH的同時(shí)還會(huì)影響胚胎的發(fā)育,所以一般采用甲狀腺全切術(shù)再植入L-T4微滲泵作為比較理想的造模方式。在母鼠品種的選擇上,SD大鼠和Wistar大鼠是目前使用最多、應(yīng)用最廣泛的2個(gè)品系,主要應(yīng)用于生理學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)、腫瘤學(xué)及環(huán)境污染與人類健康等研究[17]。與Wistar大鼠相比,SD大鼠產(chǎn)仔多、生長(zhǎng)發(fā)育快、適應(yīng)性和抗病能力更強(qiáng)[18]。有研究表明,保持在室溫下的SD大鼠具有更高的生長(zhǎng)率和食物轉(zhuǎn)化率[19],且SD大鼠的胎兒畸形率和變異率較低[20]。如果進(jìn)行發(fā)育型研究,則選用SD大鼠造模更為合適。迄今為止,已經(jīng)明確人類和大鼠孕期與甲狀腺激素相關(guān)主要事件發(fā)生的對(duì)應(yīng)時(shí)間:母鼠E13(T3受體在胚胎大腦表達(dá))相當(dāng)于人類妊娠12周[21]。因此,本實(shí)驗(yàn)選用SD大鼠建立理想的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本?shí)驗(yàn)采用甲狀腺全切術(shù),再行L-T4皮下注射法建立非孕期SCH大鼠模型,并在人類與大鼠孕期甲狀腺激素水平相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行血清TSH、TT4的測(cè)定,以確定孕期SCH大鼠模型建立是否成功。與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清TSH明顯升高、TT4無(wú)明顯差異,則提示孕期SCH大鼠模型建立成功。本研究結(jié)果表明,采用甲狀腺全切術(shù)、1.0 μg/(100 g·d)L-T4皮下注射可以成功建立非孕期SCH大鼠模型,并在大鼠E13時(shí)測(cè)定血清TSH、TT4水平,與對(duì)照組比較,血清TSH水平明顯升高、TT4水平無(wú)明顯差異,則證明大鼠仍處于SCH狀態(tài),說(shuō)明大鼠妊娠E0～E13給藥劑量可不做改變。

綜上所述,采用SD大鼠行甲狀腺全切術(shù),再行L-T4皮下注射法可以成功建立穩(wěn)定的孕期SCH動(dòng)物模型,為今后尋求治療該疾病更有效的方法及更好地控制妊娠期SCH的發(fā)展提供基礎(chǔ)。