天智顆粒對帕金森病小鼠模型黑質(zhì)和脊髓多巴胺能神經(jīng)元的影響*

陳丹丹,李 麗,于 寧,劉曉慶

(山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校:1.醫(yī)學(xué)系;2.科研處,山東 煙臺 264100)

帕金森病(PD)是由遺傳和環(huán)境等因素共同作用導(dǎo)致的一類神經(jīng)退行性疾病,患者出現(xiàn)運動癥狀和一系列非運動癥狀[1],導(dǎo)致生活質(zhì)量下降及嚴(yán)重的家庭經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。我國PD發(fā)病率呈上升趨勢,成為目前增長速度最快的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2]。PD病變部位主要為中腦黑質(zhì)、邊緣系統(tǒng)、大腦皮質(zhì)等,但有研究表明,PD病變部位除上述部位外,尚累及脊髓神經(jīng)元[3]。

天智顆粒由《中醫(yī)內(nèi)科雜病證治新義》中的驗方“天麻鉤藤飲”化裁而成,具有活血化瘀、平肝熄風(fēng)、補益肝腎等功效。已有臨床和實驗研究證實,天智顆粒對腦血管疾病具有一定的療效,可有效改善患者行為和日常生活能力[3-4]。但針對天智顆粒保護(hù)PD患者多巴胺(DA)能神經(jīng)元的效用和機制進(jìn)行的研究很少見,對中腦黑質(zhì)-紋狀體通路以外的中樞神經(jīng)部位DA能神經(jīng)元損傷進(jìn)行的研究則更少見。故本研究通過1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)腹腔注射的方法構(gòu)建PD小鼠模型,研究了天智顆粒對其中腦黑質(zhì)和脊髓部位DA能神經(jīng)元的影響,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 2022年9月選取C57BL/6J小鼠50只,無特定病原體級,體重18～22 g,8～12周齡,雌雄不拘。購自山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,合格證號[SCXK(魯)20190003]。本研究已通過山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校實驗動物倫理審查委員會審批。實驗于20～25 ℃清潔級實驗室進(jìn)行,單籠飼養(yǎng),自然光照,自由飲水進(jìn)食,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2主要試劑及儀器 天智顆粒(Lot:091201,河南宛西制藥公司)、MPTP(Lot:143208,百靈威科技有限公司)、兔抗小鼠酪氨酸羥化酶(TH,Lot:bs-0016R,北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物免疫組化染色試劑盒(Lot:SA1052,武漢博士德生物工程有限公司)、3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽顯色試劑盒(Lot:ZLI-9018,北京中杉金橋生物工程公司)、蘇木素染色劑(Lot:G1080,北京索萊寶科技有限公司)、奧林巴斯DP-72顯微鏡、自制小鼠泳箱等。

1.2方法

1.2.1PD小鼠模型構(gòu)建 采用隨機數(shù)字表法選取10只小鼠作為正常對照組,剩余40只小鼠腹腔注射MPTP 25 mg/(kg·d),連續(xù)5 d[5]。正常對照組注射等體積的生理鹽水。

1.2.2動物分組及給藥 采用隨機數(shù)字表法將造模成功后的40只小鼠分為模型組和天智顆粒5、2、1 g/kg(以生藥量計,成人用量2倍)組,每組10只,模型組和正常對照組給予等量生理鹽水灌胃,每天2 次,灌胃2周。每次灌胃后2 h進(jìn)行行為學(xué)觀察。

1.2.3懸掛實驗 參照KURIBARA 等[6]的方法取一根長約40 cm的電線,將小鼠的后爪懸掛于電線上,2只后爪均能抓住電線計3.0分,一只后爪抓住電線計2.0分,2只后爪均抓不住電線計1.0分,無法抓住直接跌落計0分。每只小鼠檢測3次,每次間隔5 min,取平均分值。

1.2.4游泳實驗 將小鼠置于20 cm×30 cm×20 cm的自制泳箱內(nèi),水溫22～25 ℃,2 min內(nèi)連續(xù)不斷游泳計3.0分,大部分時間游泳計2.5分,漂浮時間占總時長50%計2.0分,偶爾游泳計1.5分,偶爾后肢游動計1.0分。每只小鼠測3次,每次間隔5 min,取平均分值。

1.2.5取材和指標(biāo)檢測 灌胃2周后將小鼠麻醉,用多聚甲醛(40 g/L) 灌注固定,取中腦和脊髓標(biāo)本后置于多聚甲醛(40 g/L)浸泡過夜,石蠟包埋。切片常規(guī)脫蠟入水,用3%過氧化氫-甲醇溶液孵育30 min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,正常羊血清室溫封閉30 min,棄多余血清,滴加TH(1∶200),4 ℃過夜,滴加生物素化二抗37 ℃、30 min,3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽避光顯色,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照,各步驟之間以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗。

1.2.6圖像分析 每組每只小鼠取5張黑質(zhì)和脊髓部位組織切片,隨機選取3個高倍視野進(jìn)行黑質(zhì)部陽性細(xì)胞計數(shù),使用圖像分析軟件Image-Pro plus分析TH 免疫陽性神經(jīng)元的平均光密度值。

2 結(jié) 果

2.1PD小鼠的行為學(xué)觀察 腹腔注射MPTP后小鼠均出現(xiàn)不同程度行動遲緩,尾巴僵直,豎尾,豎毛等表現(xiàn),持續(xù)約30 min左右,連續(xù)給藥5 d后出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、體重減輕、毛色雜亂、后肢僵硬等表現(xiàn)。

2.2天智顆粒對PD小鼠懸掛評分和游泳時長的影響 與正常對照組比較,模型組、天智顆粒1 g/kg組小鼠懸掛、游泳評分均明顯降低,天智顆粒2、5 g/kg組小鼠懸掛、游泳評分均明顯高于模型組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠懸掛、游泳評分比較分)

2.3各組小鼠中腦黑質(zhì)部DA能陽性神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量比較 正常對照組小鼠中腦黑質(zhì)部位含有大量DA能神經(jīng)元,細(xì)胞核大而圓,呈條帶狀排列整齊,纖維走行清晰。與正常對照組比較,模型組小鼠中腦黑質(zhì)部DA能神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,個頭變小,突起變少甚至消失,纖維雜亂,神經(jīng)元內(nèi)TH平均光密度值明顯下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,天智顆粒5、2 g/kg組小鼠灌胃2周后中腦黑質(zhì)部DA能神經(jīng)元形態(tài)較好且有突起伸出,突起較多,視野內(nèi)纖維較粗,走行較規(guī)整且成明顯連續(xù)性,神經(jīng)元內(nèi)TH平均光密度值上升,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);天智顆粒5、2 g/kg組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表2。

注:A為觀察部位(標(biāo)尺=200 μm);B為正常對照組(標(biāo)尺=20 μm);C為模型組(標(biāo)尺=20 μm);D為天智顆粒1 g/kg組(標(biāo)尺=20 μm);E為天智顆粒2 g/kg組(標(biāo)尺=20 μm);F為天智顆粒5 g/kg 組(標(biāo)尺=20 μm)。圖1 各組小鼠中腦黑質(zhì)部DA能陽性神經(jīng)元形態(tài)比較

表2 各組小鼠中腦黑質(zhì)部DA能神經(jīng)元數(shù)量比較

2.4各組小鼠脊髓DA能神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量比較 正常對照組小鼠脊髓DA能神經(jīng)元胞體明顯、細(xì)胞核清楚,神經(jīng)元突起多且長。與正常對照組比較,模型組小鼠脊髓DA能神經(jīng)元細(xì)胞著色淺,細(xì)胞核未見明顯固縮,神經(jīng)元突起減少,部分神經(jīng)元只保留軸丘,多數(shù)突起消失,神經(jīng)元內(nèi)TH的平均光密度值明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,天智顆粒5、2 g/kg組小鼠灌胃2周后脊髓DA能神經(jīng)元呈多邊形,個頭較大,有多個突起伸出,突起較長,走行規(guī)整且成明顯連續(xù)性,灌胃前后神經(jīng)元數(shù)量變化無明顯差異,但灌胃后神經(jīng)元內(nèi)TH平均光密度值明顯上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);天智顆粒5、2 g/kg組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表3。

注:A為觀察部位(標(biāo)尺=100 μm);B為正常對照組(標(biāo)尺=20 μm);C為模型組(標(biāo)尺=20 μm);D為天智顆粒1 g/kg 組(標(biāo)尺=20 μm);E為天智顆粒2 g/kg組(標(biāo)尺=20 μm);F為天智顆粒5 g/kg 組(標(biāo)尺=20 μm)。圖2 各組小鼠脊髓腰骶部灰質(zhì)前角(板層Ⅸ)DA能神經(jīng)元形態(tài)比較

表3 各組小鼠脊髓腰骶部DA能神經(jīng)元數(shù)量比較

3 討 論

PD是一種常見于老年人的以黑質(zhì)部位DA能神經(jīng)元喪失為主的神經(jīng)退行性疾病,發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病[7]。2019年中國PD患者約284萬人,成為世界上PD患者最多的國家。PD也成為危害老年人身體健康的三大殺手之一[8]。

PD的病變特征包括震顫、僵硬、姿勢不穩(wěn)定、運動遲緩,以及細(xì)胞水平上DA神經(jīng)元的特異性死亡和路易體包涵體的出現(xiàn)。目前的醫(yī)療手段主要以改善臨床癥狀為主,尚不能有效根治疾病[9]。PD患者除表現(xiàn)出一系列運動系統(tǒng)癥狀外,在發(fā)病早期還出現(xiàn)一系列非運動癥狀,如記憶異常、疼痛、便秘、排尿困難等。意味著PD患者的邊緣系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)和脊髓等部位同時受到影響[10]。過去認(rèn)為,在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中DA能神經(jīng)元只存在于腦中的一些局部區(qū)域,如間腦的A11核團,脊髓中的DA也主要來自該核團,并在整個脊髓形成廣泛投射的纖維投射[11]。但多份尸檢報告指出,散發(fā)性PD患者存在黑質(zhì)-紋狀體通路以外的神經(jīng)病變,包括脊髓[12],且多個獨立實驗小組的研究結(jié)果支持PD患者和MPTP小鼠脊髓中出現(xiàn)DA能神經(jīng)元的死亡[13-15]。WAKABAYASHI等[16]指出,PD不僅是一種由黑質(zhì)-紋狀體神經(jīng)元特異性丟失引起的運動障礙,更是一種涉及整個神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜疾病。喬原[17]在大鼠脊髓的腰骶部發(fā)現(xiàn)TH陽性細(xì)胞的存在,并進(jìn)一步證實這些TH陽性細(xì)胞就是DA能神經(jīng)元,同時,觀察到了脊髓損傷后DA能神經(jīng)元的可塑性變化,并證實大鼠脊髓中的DA能神經(jīng)元主要分布于副交感節(jié)前神經(jīng)元富集的脊髓灰質(zhì)側(cè)角及脊髓后角淺層區(qū)域,意味著其與自主神經(jīng)功能及感覺傳入之間的聯(lián)系。因此,脊髓病變可能是導(dǎo)致PD患者運動前和運動階段出現(xiàn)疼痛、便秘、平衡不良和性功能障礙等臨床癥狀的原因所在[18]。

天智顆粒來源于《中醫(yī)內(nèi)科雜病證治新義》的經(jīng)典驗方天麻鉤藤飲[19],主要由天麻、鉤藤、石決明、杜仲、桑寄生等多種藥物組成,具有活血化瘀、補益肝腎、益智安神等功效。臨床常用于治療血管性癡呆、中風(fēng)肢體功能障礙、PD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3-4]。現(xiàn)代藥理研究表明,天智顆?？赏ㄟ^提高膽堿能神經(jīng)功能和抗氧化酶活性,抑制腦內(nèi)興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性,改善血管性癡呆的癥狀[20]。君藥中天麻中的主要成分天麻素可抑制DA代謝率,使DA含量升高,并對DA能神經(jīng)元的形態(tài)及功能具有保護(hù)作用,還可通過提高DA能神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)TH的活性,促進(jìn)DA的合成[21-22]。

MPTP嚙齒動物模型可較好地模擬PD的病理特點[23]。因此,使用MPTP誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠已成為經(jīng)典的PD動物模型之一[24]。本研究采用MPTP 25 mg/(kg·d)、連續(xù)5 d腹腔注射的方法構(gòu)建亞急性PD小鼠模型。藥物注射后小鼠出現(xiàn)了肌肉震顫、豎尾、尾巴僵直、豎毛、動作遲緩等經(jīng)典的PD行為學(xué)表現(xiàn),符合實驗需要的PD小鼠模型特征,結(jié)果顯示,MPTP引起模型組小鼠中腦黑質(zhì)和脊髓灰質(zhì)前角DA能神經(jīng)元的損傷,主要表現(xiàn)為神經(jīng)元胞體的縮小和胞內(nèi)TH的減少,DA能神經(jīng)元的突起減少甚至消失。給予天智顆粒2、5 g/kg干預(yù)2周后PD小鼠黑質(zhì)和脊髓灰質(zhì)前角DA能神經(jīng)元突起增多、變長,神經(jīng)元內(nèi)TH含量增加,且PD小鼠后肢懸掛時間延長,游泳能力增強。意味著在同樣的情況下天智顆粒2 g/kg是促進(jìn)脊髓灰質(zhì)前角DA能神經(jīng)元的存活、進(jìn)而改善PD小鼠的行為學(xué)的最優(yōu)選擇。天智顆粒的保護(hù)作用與運動[25]促進(jìn)脊髓TH的含量結(jié)果相似。由此推測,天智顆粒治療PD的有效機制可能與藥物促進(jìn)黑質(zhì)和脊髓DA能神經(jīng)元及其突起的存活,提高黑質(zhì)和脊髓灰質(zhì)前角DA能神經(jīng)元中TH的含量有關(guān);天智顆?？赏ㄟ^提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性DA分泌,有效改善PD小鼠肌肉的運動協(xié)調(diào)能力受損的情況。但本研究結(jié)果顯示,在脊髓灰質(zhì)前角DA能神經(jīng)元數(shù)量變化方面,治療前后并無明顯變化。

綜上所述,MPTP誘導(dǎo)的亞急性PD小鼠模型中,中腦黑質(zhì)和脊髓灰質(zhì)前角部位DA能神經(jīng)元及其突起均受到損傷,天智顆粒2 g/kg即可改善PD小鼠的異常行為表現(xiàn),其機制可能與促進(jìn)PD小鼠中腦黑質(zhì)和脊髓中DA能神經(jīng)元的存活、提高DA能神經(jīng)元TH含量有關(guān),為臨床應(yīng)用天智顆粒治療PD提供了部分用藥指導(dǎo)。本研究尚未涉及天智顆粒起效的分子學(xué)機制,以及相關(guān)蛋白、基因等的表達(dá)變化,故尚需進(jìn)一步的探索和深入研究。