外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TLR4、hCMV-IgM與動(dòng)脈粥樣硬化型急性腦梗死患者頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系

楊琪, 李芳芳

1.松滋市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北松滋434200;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北武漢430030

急性腦梗死是一種突發(fā)性的腦血管疾病,動(dòng)脈粥樣硬化型急性腦梗死(atherosclerotic acute cerebral infarction,As-ACI)是急性腦梗死的臨床類型之一,其發(fā)病原因主要是腦部動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成[1]。大部分As-ACI患者本身存在過度炎癥反應(yīng),使體內(nèi)致病性、免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡失調(diào),CD4+CD25+Treg細(xì)胞屬于免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,參與各種疾病發(fā)生的免疫調(diào)節(jié)過程[2]。Toll樣受體4(Toll-1ike receptor 4,TLR4)可介導(dǎo)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng),與脂質(zhì)炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)[3]。當(dāng)機(jī)體免疫力降低時(shí),人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,hCMV)激活,對(duì)血管內(nèi)皮損傷產(chǎn)生影響[4]。頸動(dòng)脈是血液運(yùn)輸至大腦的主要大血管,頸動(dòng)脈粥樣斑塊的形成和頸動(dòng)脈狹窄程度是引起腦梗死發(fā)病的主要原因之一[5]。因此,本研究探討外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TLR4、hCMV-IgM與As-ACI患者頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系,為臨床確定As-ACI針對(duì)性治療方案提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取本院2021年10月—2022年9月As-ACI患者89例為腦梗死組。納入標(biāo)準(zhǔn):均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)影像學(xué)檢查確診為As-ACI;年齡>40歲;發(fā)病至入院時(shí)間<24 h;首次發(fā)病。排除標(biāo)準(zhǔn):合并惡性腫瘤、血液疾病、感染性疾病;1個(gè)月內(nèi)服用免疫功能調(diào)節(jié)藥物、手術(shù)史。另選同期體檢健康成人43例為對(duì)照組。兩組一般資料(高血壓除外)比較差異無顯著性(P>0.05;表1)。納入對(duì)象及其家屬對(duì)本研究均知情,自愿簽署知情同意書。本研究方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20201121)。

表1 腦梗死組與對(duì)照組一般資料的比較

1.2 頸動(dòng)脈超聲檢查

受檢者取仰臥位,頭后仰,使用彩色多普勒超聲診斷儀(xMATRIXiE33,飛利浦),探頭頻率2～3 MHz,檢測(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)膜中膜厚度(intima-media thickness,IMT),IMT<1.0 mm為頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)膜正常,1.0～1.5 mm為頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)膜增厚,≥1.5 mm且伴有內(nèi)膜向管腔凸出為有粥樣硬化斑塊形成[7],當(dāng)動(dòng)脈管腔狹窄≥50%為動(dòng)脈狹窄[8]。根據(jù)頸內(nèi)動(dòng)脈超聲結(jié)果將As-ACI患者分為內(nèi)膜正常組、內(nèi)膜增厚組、斑塊組、狹窄組。

1.3 外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TLR4的檢測(cè)

取入院次日清晨空腹靜脈血5 mL置于抗凝管中,取兩支流式試管分別標(biāo)為對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管,分別加入100 μL抗凝血,實(shí)驗(yàn)管中加入10 μL CD4-PE、10 μL CD25-FITC,對(duì)照管中加入10 μL CD4-PE、10 μL IgGl-FITC,加入500 μL PBS重懸后用于流式細(xì)胞儀(BD FACSCanto II,埃克森北京科技有限公司)上樣,采用Cellques軟件對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞構(gòu)成百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。TLR4表達(dá)水平檢測(cè)同上,實(shí)驗(yàn)管中加入5 μL TLR4-PE、10 μL CD14-FITC,對(duì)照管中加入5 μL IgGl-PE、10 μL CD14-FITC,Cellques軟件統(tǒng)計(jì)CD14+TLR4+細(xì)胞構(gòu)成百分比。

1.4 hCMV感染診斷

取2 mL清晨空腹靜脈血,室溫放置10 min,3 500 r/min離心20 min,收集上清液,采用ELISA法檢測(cè)血清hCMV-IgM抗體陽性率,試劑盒購于武漢純度生物科技有限公司,使用酶標(biāo)儀(美國Muhiskun公司)在450 nm波長檢測(cè)光密度值。臨界值=校正對(duì)照光密度值×相關(guān)系數(shù),Index值=樣本光密度值/臨界值,Index值≥1為陽性[9]。分析各組hCMV感染陽性率變化。

1.5 生物化學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)

患者入院后次日,取3 mL空腹靜脈血,日立7170A/AU2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDLC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDLC)水平。取1.4中上清液,使用美谷SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)水平,試劑盒購于武漢益普生物科技有限公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TLR4等指標(biāo)的比較

腦梗死組CD4+CD25+Treg細(xì)胞、HDLC水平低于對(duì)照組,TLR4表達(dá)、hCMV-IgM抗體陽性率、TC、TG、LDLC、hs-CRP水平和IMT高于對(duì)照組(P<0.05;表2)。狹窄組hs-CRP水平高于內(nèi)膜正常組、內(nèi)膜增厚組(P<0.05;表2)。內(nèi)膜正常組、內(nèi)膜增厚組、斑塊組、狹窄組CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平依次降低,TLR4表達(dá)、hCMV-IgM抗體陽性率和IMT依次增高(P<0.05;表2)。

表2 各組CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TLR4等指標(biāo)的比較

2.2 CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TLR4與IMT的相關(guān)性

CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平與IMT呈負(fù)相關(guān)(r=-0.243,P=0.022),TLR4表達(dá)與IMT呈正相關(guān)(r=0.239,P=0.024;圖1)。

圖1 CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TLR4表達(dá)水平與IMT的相關(guān)性

2.3 As-ACI患者頸動(dòng)脈狹窄的危險(xiǎn)因素分析

以頸動(dòng)脈狹窄為因變量,以上述有差異的因素為自變量,Logistic回歸分析顯示,高血壓、CD4+CD25+Treg、TLR4、hCMV-IgM抗體陽性是As-ACI患者頸動(dòng)脈狹窄的危險(xiǎn)因素(P<0.05;表3)。

表3 As-ACI患者頸動(dòng)脈狹窄危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析

2.4 CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TLR4對(duì)頸動(dòng)脈狹窄的預(yù)測(cè)價(jià)值

CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TLR4聯(lián)合檢測(cè)的預(yù)測(cè)價(jià)值高于其單獨(dú)檢測(cè)(P<0.001;表4和圖2)。

圖2 CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TLR4預(yù)測(cè)頸動(dòng)脈狹窄的ROC曲線

表4 CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TLR4表達(dá)對(duì)頸動(dòng)脈狹窄的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討 論

近年來急性腦梗死發(fā)病呈年輕化趨勢(shì),動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程存在炎癥免疫性反應(yīng),過度炎癥反應(yīng)所致腦組織損傷程度比腦組織本身缺血引起的腦損傷更嚴(yán)重,抑制腦組織過度炎癥反應(yīng)有助于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和致病性T細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡恢復(fù)[10]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞是經(jīng)Th1細(xì)胞分化形成的免疫細(xì)胞,能夠通過分泌炎性相關(guān)因子調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥/抗炎平衡、自身免疫耐受和免疫抑制作用[11]。本研究結(jié)果顯示,As-ACI患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平低于健康體檢成人,隨著頸動(dòng)脈粥樣硬化病變程度加重呈減低趨勢(shì),可能是因?yàn)榧毙阅X梗死早期炎癥反應(yīng)主要表現(xiàn)為局部組織促炎反應(yīng),單核巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞以及輔助性T細(xì)胞等致病性細(xì)胞含量增加,導(dǎo)致趨化性細(xì)胞分子等促炎因子表達(dá)水平升高,由損傷血腦屏障進(jìn)入損傷炎癥區(qū)域加重局部炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平降低。

TLR4在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中呈高表達(dá)水平,通過氧化型低密度脂蛋白刺激單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞分化,而通過阻斷TLR4疾病表達(dá)可以降低巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積、泡沫細(xì)胞分化和斑塊炎癥因子高表達(dá)[12]。有學(xué)者認(rèn)為,TLR4水平升高不利于急性腦梗死患者靜脈溶栓后側(cè)支循環(huán)開放,影響患者溶栓治療效果[13]。本研究結(jié)果顯示,As-ACI患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平顯著高于健康體檢成人,并且隨著頸動(dòng)脈粥樣硬化病變程度加重呈增長趨勢(shì),說明TLR4可能參與As-ACI發(fā)病過程。本研究結(jié)果顯示,As-ACI患者外周血hCMV-IgM陽性率明顯升高,可能是因?yàn)閔CMV感染可抑制一氧化氮合成分泌,誘導(dǎo)血液促凝狀態(tài)形成,增加血栓形成率;hCMV感染還可引起機(jī)體炎癥反應(yīng)增強(qiáng),增加脂質(zhì)沉積現(xiàn)象,促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖,導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化并發(fā)動(dòng)脈狹窄。

本研究結(jié)果顯示,CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平與IMT呈負(fù)相關(guān),而單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平與IMT呈正相關(guān),同時(shí)發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平對(duì)腦梗死頸動(dòng)脈狹窄具有良好的預(yù)測(cè)效能,兩者聯(lián)合檢測(cè)高于其單獨(dú)預(yù)測(cè)效能,高血壓、CD4+CD25+Treg、TLR4、hCMV-IgM抗體陽性是其危險(xiǎn)因素。毛可適等[14]研究結(jié)果表明,頸動(dòng)脈狹窄老年As-ACI患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分比與IMT呈負(fù)相關(guān),還能作為腦缺血和血管內(nèi)皮功能的非侵入性指標(biāo)。還有學(xué)者認(rèn)為,CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平可以作為老年As-ACI的獨(dú)立影響因素,對(duì)疾病嚴(yán)重程度具有預(yù)測(cè)效能[15]。本研究結(jié)果也具有相似趨勢(shì),說明外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平降低、單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平增加和hCMV感染可能會(huì)加重腦梗死頸動(dòng)脈粥樣硬化病變嚴(yán)重程度。

綜上所述,CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平在動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血呈降低趨勢(shì),而外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平和hCMV感染陽性率呈升高趨勢(shì),隨頸動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度增加而趨勢(shì)更明顯,CD4+CD25+Treg細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平聯(lián)合檢測(cè)可提高腦梗死頸動(dòng)脈狹窄預(yù)測(cè)效能。但本研究納入病例不足,有待大樣本研究驗(yàn)證。