IHC、FISH、qRT-PCR檢測(cè)NSCLC ALK融合基因的對(duì)比分析

朱宇凝, 屈順林, 曹曉卉, 楊志慧, 孫桂鳳, 殷正進(jìn), 劉仕琦, 張纓

1.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院秦淮醫(yī)療區(qū)病理科,江蘇南京210002;2.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院心血管疾病研究所,湖南衡陽(yáng)421001

肺癌是惡性腫瘤的主要死亡原因,且在早期不易被發(fā)現(xiàn)[1]。根據(jù)組織學(xué)、臨床和神經(jīng)內(nèi)分泌特征,肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)[2]。研究表明,肺癌中存在ALK融合基因變異現(xiàn)象[3-4]。ALK作為胰島素受體亞家族的受體酪氨酸激酶已被證實(shí)在各種癌癥中發(fā)揮重要作用,特別是間變性大細(xì)胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma,ALCL)、NSCLC和神經(jīng)母細(xì)胞瘤[1]。隨后,臨床實(shí)驗(yàn)表明,針對(duì)ALK基因靶點(diǎn)的藥物克唑替尼,對(duì)于晚期ALK陽(yáng)性的NSCLC患者治療療效顯著[5]。因此,尋找穩(wěn)定、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、快速的ALK基因融合狀態(tài)檢測(cè)手段迫在眉睫。本文對(duì)比分析免疫組化(immunohistochemistry,IHC)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative-PCR,qRT-PCR)檢測(cè)NSCLC ALK融合基因的情況。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

收集本院2018年12月—2022年12月通過HE染色法和IHC共同確診的453例NSCLC標(biāo)本。標(biāo)本來源包括細(xì)胞塊樣本(來自胸水)和組織樣本(經(jīng)皮肺穿刺、纖支鏡活檢獲取的小標(biāo)本以及肺葉切除、轉(zhuǎn)移病灶切除獲取的手術(shù)切除大標(biāo)本)。隨機(jī)選取IHC確診的ALK(-)、(+)、(2+)、(3+)標(biāo)本各10例進(jìn)行FISH、qRT-PCR驗(yàn)證。

1.2 IHC法

1.2.1 組織標(biāo)本制備 10%中性福爾馬林固定,自動(dòng)脫水儀常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)脫水,經(jīng)58～60 ℃熔點(diǎn)石蠟包埋后3 μm 厚切片備用。

1.2.2 細(xì)胞塊制備 新鮮胸水4 ℃冰箱靜置過夜后棄上清液,取底部沉淀于50 mL離心管2 500 r/min離心5 min;3%冰乙酸乙醇去紅細(xì)胞,30%乙醇去黏液;加入10%福爾馬林,振蕩均勻,2 500 r/min離心3 min,棄上清液;再加入95%乙醇10 mL,振蕩均勻,2 500 r/min離心3 min;棄上清液,收集底部沉淀轉(zhuǎn)移到擦鏡紙上,包好,和常規(guī)組織一起脫水,最后經(jīng)58～60 ℃熔點(diǎn)石蠟包埋。

1.2.3 IHC制片 從HE法中選取453例NSCLC標(biāo)本,4 μm厚石蠟切片65 ℃烘箱烤片1 h,然后使用Ventana BenchMark GX全自動(dòng)免疫組化染色儀進(jìn)行檢測(cè)。所用試劑為羅氏抗ALK一抗(D5F3)和OptiView DAB免疫組化試劑盒以及增強(qiáng)擴(kuò)增試劑盒。

1.2.4 IHC結(jié)果判定 ALK根據(jù)文獻(xiàn)[6]判定:>5%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)顆粒狀細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)著色為(3+);>5%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)中度細(xì)胞質(zhì)著色為(2+);>5%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)微弱或模糊的細(xì)胞質(zhì)著色或≤5%的腫瘤細(xì)胞有任何程度的著色為(+);腫瘤細(xì)胞無(wú)著色為(-)。

1.3 FISH法

從IHC樣本中隨機(jī)選取ALK(-)、(+)、(2+)、(3+)各10例。所有標(biāo)本用10%中性福爾馬林緩沖液固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋,4 μm厚切片。常規(guī)脫蠟,75 ℃熱處理12 min,37 ℃預(yù)熱蛋白酶K消化15 min,緩沖液清洗,暗室內(nèi)滴加探針10 μL(美國(guó)Abbott公司),封片后放入雜交儀,75 ℃ 5 min變性,37 ℃過夜雜交。去除封片膠,將切片置于預(yù)加熱72 ℃洗液內(nèi)2 min,滴加10 μL DAPI、封片。選取單個(gè)視野50個(gè)腫瘤細(xì)胞,要求腫瘤細(xì)胞核輪廓及信號(hào)清晰,每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)至少有一組紅、綠信號(hào),如果紅綠信號(hào)分離(距離≥兩個(gè)信號(hào)直徑)或額外出現(xiàn)單獨(dú)的紅色信號(hào)數(shù)≥25個(gè),或者不同視野的100個(gè)細(xì)胞內(nèi)合計(jì)≥15個(gè)存在分離信號(hào)或者綠色信號(hào)缺失視為陽(yáng)性標(biāo)本[6]。

1.4 qRT-PCR法

同1.3方法選取樣本共40例。組織樣本選用10%中性福爾馬林緩沖液固定,石蠟包埋樣本切片后立即檢測(cè)。手術(shù)標(biāo)本切片厚度5 μm,5片;穿刺標(biāo)本切片厚度5 μm,10片。樣品進(jìn)行RAN和DNA分離,提取RNA和DNA,RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成單鏈cDNA,然后使用ALK融合基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。檢測(cè)流程嚴(yán)格按照說明書操作,操作中避免污染;最后使用SLAN全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。根據(jù)試劑盒說明書判定結(jié)果:陽(yáng)性對(duì)照曲線升起Ct值<24;若樣本融合基因FAM信號(hào)曲線升起Ct值<30,則為陽(yáng)性;若樣本融合基因FAM信號(hào)無(wú)曲線升起或者Ct值≥30,則為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示,一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)或者Spearman相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ALK融合基因的IHC檢測(cè)結(jié)果

453例經(jīng)HE和IHC共同確診為NSCLC標(biāo)本。IHC樣本中379例ALK陰性、74例ALK陽(yáng)性,其中(1+)12例、(2+)30例及(3+)32例。IHC ALK陽(yáng)性率為16.3%(圖1)。NSCLC IHC ALK陽(yáng)性細(xì)胞染色定位為細(xì)胞質(zhì)。

圖1 IHC法檢測(cè)NSCLC中ALK蛋白的表達(dá)(200×)A為ALK(-);B為ALK(+);C為ALK(2+);D為ALK(3+)。

2.2 ALK融合基因的FISH檢測(cè)結(jié)果

選取IHC樣本ALK(-)、(+)、(2+)、(3+)各10例,進(jìn)行ALK熒光探針檢測(cè),12例陽(yáng)性,28例陰性(圖2)。

圖2 FISH法檢測(cè)NSCLC中ALK融合基因的表達(dá)(1 000×)A為ALK(-),紅綠信號(hào)融合;B為ALK(+),紅綠信號(hào)分離大于2個(gè)信號(hào)點(diǎn)。

2.3 ALK融合基因的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

選取IHC樣本ALK(-)、(+)、(2+)、(3+)各10例,進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè),13例陽(yáng)性,27例陰性(圖3)。

圖3 qRT-PCR法檢測(cè)NSCLC中ALK融合基因的表達(dá)A為ALK(-),綠色曲線為陽(yáng)性質(zhì)控,藍(lán)色樣本曲線無(wú)升起;B為ALK(+),綠色曲線為陽(yáng)性質(zhì)控,藍(lán)色曲線樣本有明顯擴(kuò)增。

2.4 IHC與FISH的一致性比較

Kappa檢驗(yàn)結(jié)果顯示,在IHC判定為ALK(-)/(3+)的20例標(biāo)本中,與FISH檢測(cè)結(jié)果一致率均為100%,具有高度一致性(P<0.05);在IHC判定為ALK(1+)/(2+)的20例標(biāo)本中,與FISH檢測(cè)結(jié)果一致率分別為0%和20%,兩種方法AILK(1+)/(2+)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果無(wú)一致性(χ2=0.474,P>0.05;表1)。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,IHC和FISH檢測(cè)ALK具有一致性(r=0.781,P<0.05)。

表1 IHC和FISH檢測(cè)ALK結(jié)果的一致性(n=40) 例

2.5 IHC與qRT-PCR的一致性比較

Kappa檢驗(yàn)結(jié)果顯示,在IHC判定為ALK(-)/(3+)的20例標(biāo)本中,IHC與qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致率均為100%,具有高度一致性(P<0.05);在IHC判定為ALK(1+)/(2+)的20例標(biāo)本中,與qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致率分別為10%和20%,兩種方法檢測(cè)結(jié)果無(wú)一致性(χ2=1,P>0.05;表2)。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,IHC和qRT-PCR檢測(cè)ALK具有一致性(r=0.740,P<0.05)。

表2 IHC和qRT-PCR檢測(cè)ALK結(jié)果的一致性(n=40) 例

2.6 qRT-PCR與FISH的一致性比較

在40例已做IHC檢測(cè)樣本中,qRT-PCR與FISH檢測(cè)結(jié)果一致率為97.5%,兩種檢測(cè)方法結(jié)果具有高度一致性(r=0.943,P<0.05;表3)。

表3 qRT-PCR和FISH檢測(cè)ALK結(jié)果的一致性(n=40) 例

3 討 論

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的不斷發(fā)展,個(gè)體化靶向藥物治療備受關(guān)注。研究表明,ALK融合基因的突變?cè)诜伟┑陌l(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用;其基因靶向藥物克唑替尼對(duì)ALK陽(yáng)性的肺癌患者治療效果顯著[7]。

ALK是肺癌較為常見的驅(qū)動(dòng)基因[8]。目前,ALK融合基因的檢測(cè)方法主要有qRT-PCR、FISH、IHC法。qRT-PCR、FISH是經(jīng)典檢測(cè)方法,但費(fèi)用較高;IHC法檢測(cè)ALK敏感性和染色強(qiáng)度較高,且費(fèi)用相對(duì)較低。研究證明,檢測(cè)ALK所用的IHC、FISH、qRT-PCR法各有利弊[9]。

本文通過3種檢測(cè)方法比較,IHC作為初篩方法相對(duì)經(jīng)濟(jì)且便捷。因IHC人為因素影響較大,所以為確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性,對(duì)實(shí)驗(yàn)的每例標(biāo)本均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,闌尾中的神經(jīng)節(jié)組織為已知陽(yáng)性;另外,IHC可以檢測(cè)ALK的蛋白表達(dá),但無(wú)法觀察到其基因變異和融合伴侶情況。FISH法檢測(cè)時(shí)間短,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化,可以檢測(cè)到ALK的缺失、斷裂[10],但不能識(shí)別融合伴侶,可能會(huì)錯(cuò)過罕見復(fù)雜的重排[11];并且判定者之間結(jié)果解釋會(huì)有較大區(qū)別[12]。qRT-PCR法檢測(cè)靈敏,特異性強(qiáng),但在使用福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣本時(shí),需要多個(gè)引物集來檢測(cè)所有的ALK變異[13];qRT-PCR診斷的準(zhǔn)確性在很大程度上取決于樣本RNA質(zhì)量,對(duì)樣本要求比較高[14],特別是交叉污染會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

綜上所述,IHC與FISH法判定相對(duì)主觀,結(jié)果可能存在較大差異,qRT-PCR法較客觀且更加靈敏。根據(jù)研究對(duì)比,qRT-PCR、FISH法在ALK融合基因的檢測(cè)結(jié)果與IHC法的一致性存在差別,IHC對(duì)于ALK融合基因表達(dá)的靈敏度更高。IHC檢測(cè)法經(jīng)濟(jì)且便捷,對(duì)病理科來說實(shí)驗(yàn)過程可控,結(jié)果穩(wěn)定,重復(fù)性較好。因此,IHC可以作為ALK融合基因的初篩檢測(cè)方法,存疑樣本使用FISH、qRT-PCR檢測(cè)方法驗(yàn)證,能夠檢測(cè)更全面的基因突變信息,為臨床病理診斷提供有效檢測(cè)輔助手段。