低氧微環(huán)境增強MACC1調(diào)控PI3K/AKT信號通路促進結(jié)直腸癌腫瘤干細胞樣特性

吳共發(fā), 曾宇婷, 劉鈺君, 姚雨江, 邱麗湞

廣州醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院 1.病理科,2.健康管理中心,廣東廣州511300

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全球死亡率居第二的惡性腫瘤[1],導致其治療失敗的主要原因是轉(zhuǎn)移復發(fā)[2-3]。腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSC)可導致惡性腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移、異質(zhì)性、多藥耐藥和放射耐藥等。低氧被認為是CSC形成和維持的關鍵成分[4]。已證明低氧通過上調(diào)某些因子的表達來促進CRC的轉(zhuǎn)移[5]。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關基因1(MACC1)是一個很強的預后生物標志物和轉(zhuǎn)移誘導物[6]。前期研究顯示CRC中MACC1高表達參與了其惡性進展[7-9],抑制MACC1能阻遏CRC惡性行為[10]。有研究顯示MACC1通過PI3K/AKT信號通路促進CRC的CSC樣特性[11]。然而,CRC中低氧微環(huán)境、MACC1和CSC樣特性之間的相互作用機制尚待闡明,本研究探討了低氧條件對MACC1功能及CRC細胞CSC樣特性的影響和機制,以期為尋找CRC新的治療策略提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞與主要試劑

人結(jié)腸癌細胞HCT116購自中國科學院上海細胞庫,液氮保存,使用時復蘇;MACC1基因過表達克隆慢病毒包裝服務委托廣州易錦生物技術(shù)有限公司完成;即用型抗體ki-67和抗體稀釋液購自福州邁新;通用型二抗-HRP聚合物購自Dako公司;Transwell小室購自美國Corning公司;AKT及Phospho-Akt(Thr308)抗體購自美國CST公司;CCK-8試劑盒、蛋白抽提試劑盒、蛋白水平檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和ECL反應檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)公司;MACC1、CD133和CD44抗體購自英國Abcam公司,內(nèi)參β-actin抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;山羊抗兔二抗購自中杉金橋公司,重組人表皮生長因子購自麥克林生化公司;人堿性成纖維細胞生長因子購自艾德萊生物公司;PI3K激動劑740 Y-P購自Bio-Techne公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和處理

HCT116細胞常規(guī)培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,放置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。取對數(shù)期生長的細胞用于實驗。待對數(shù)生長期細胞鋪板生長面積達到50%左右,按照慢病毒轉(zhuǎn)染說明書進行操作,以綠色熒光標記的MACC1基因過表達克隆慢病毒顆粒(LV-MACC1)和空載體對照慢病毒顆粒(LV-Ctrl)分別感染HCT116細胞,分別作為實驗組(LV-MACC1組)和過表達陰性對照組(LV-Ctrl組),2組常規(guī)培養(yǎng)。LV-MACC1組在低氧環(huán)境(1%O2、5%CO2和94%N2)培養(yǎng)設為LV-MACC1+hypoxia組,激活PI3K活性實驗用30 μmol/L 740 Y-P在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱下處理HCT116細胞24 h。

1.3 CCK-8和免疫細胞化學法檢測細胞增殖

將細胞(5×103個/孔)接種于96孔板中,每組設置5個復孔。待各組細胞處理48 h后,每孔加入10 μL CCK-8液。隨后避光在細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h,在450 nm處測定樣品的光密度(optical density,OD值),計算平均值。收集處理48 h的各組細胞制作細胞塊制成石蠟包埋細胞塊,方法按照前期研究[12],按照說明書進行免疫細胞化學檢測ki-67的表達情況,高倍鏡下隨機進行5個高倍視野拍照并計數(shù),取均值,ki-67陽性指數(shù)(%)=ki-67陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.4 劃痕實驗

將細胞接種到6孔板中,各組細胞處理后培養(yǎng)至100%融合。隨后用200 μL的無菌移液管尖端劃一個劃痕傷口,并使用PBS清除細胞碎片。細胞在添加了1%胎牛血清的RPMI-1640中孵育至處理時間達48 h。分別在孵育后0、48 h觀察劃痕傷口,每組設置5個復孔。顯微鏡下隨機選擇的視野中捕獲圖像。

1.5 細胞侵襲實驗

將各組細胞2×104個/孔和200 μL無血清基質(zhì)膠加入上腔,底部腔室添加500 μL RPMI-1640和10%胎牛血清。處理培養(yǎng)48 h后,用70%乙醇固定,0.1%結(jié)晶紫染色,用光學顯微鏡隨機拍照5個高倍視野和計數(shù)平均值。

1.6 腫瘤球形成試驗

將各組細胞1×104個/孔在6孔的超低附著表面培養(yǎng)皿中培養(yǎng),分組按1.2,每組設置3個復孔。細胞在無血清的DMEM/F12中培養(yǎng),添加20 μg/L重組人表皮生長因子、10 μg/L人堿性成纖維細胞生長因子和B27添加劑。細胞培養(yǎng)14天后,在倒置顯微鏡下計數(shù)>50 μm3的腫瘤球數(shù)。

1.7 Western blotting實驗

按照蛋白抽提試劑盒說明書操作獲得細胞裂解液,按照蛋白水平檢測試劑盒說明書操作測定蛋白水平。隨后,用10%SDS-PAGE凝膠分離20 μg蛋白/通道,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在5%脫脂牛奶中密封2 h后,加一抗MACC1、CD133、CD44、和β-actin(1∶1 000)在4 ℃下過夜,然后與山羊抗兔二抗(1∶5 000)在室溫下孵育2 h,用ECL反應檢測試劑盒觀察。內(nèi)參為β-actin,使用Image J軟件對條帶進行灰度值量化分析,蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.8 統(tǒng)計學方法

GraphPad Prism 5.0軟件分析實驗數(shù)據(jù),計量資料采用獨立樣本t檢驗,多組比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸癌細胞中穩(wěn)定過表達MACC1的效果

綠色熒光標記的MACC1基因過表達克隆慢病毒顆粒感染HCT116細胞48 h,倒置熒光顯微鏡下觀察顯示接近100%的細胞有綠色熒光。蛋白印跡法條帶顯示LV-MACC1組的MACC1蛋白表達較LV-Ctrl組明顯增強(圖1)。

圖1 MACC1在慢病毒感染48 h后的表達水平A為感染MACC1慢病毒細胞在明場和熒光場下的圖像(200×);B為MACC1蛋白表達。

2.2 低氧及過表達MACC1對HCT116細胞增殖能力的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示,LV-MACC1組和LV-MACC1+hypoxia組OD值均高于LV-Ctrl組,LV-MACC1+hypoxia組細胞增殖OD值高于LV-MACC1組(P<0.05;圖2A)。細胞塊免疫細胞化學顯示,ki-67陽性指數(shù)與CCK-8結(jié)果有同樣趨勢(圖2B)。

圖2 低氧及MACC1對HCT116細胞增殖的影響A為CCK-8法測細胞增殖能力情況;B為免疫細胞化學ki-67檢測細胞增殖情況(400×)。a為P<0.05,與LV-ctrl組比較;b為P<0.05,與LV-MACC1組比較。

2.3 低氧及過表達MACC1對HCT16細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示,過表達MACC1能促進HCT116細胞遷移能力,低氧微環(huán)境能進一步增強MACC1促進HCT116細胞的遷移能力(圖3)。

圖3 低氧及MACC1對結(jié)腸癌細胞遷移能力的影響

2.4 低氧及過表達MACC1對HCT16細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示,LV-MACC1組和LV-MACC1+hypoxia組的細胞穿孔數(shù)均高于LV-Ctrl組,LV-MACC1+hypoxia組細胞穿孔數(shù)高于LV-MACC1組(P<0.05;圖4),提示過表達MACC1能促進HCT116細胞侵襲能力,低氧微環(huán)境能進一步增強MACC1促進HCT116細胞的侵襲能力。

圖4 低氧及過表達MACC1對結(jié)腸癌細胞侵襲能力的影響A為光學顯微鏡下圖(結(jié)晶紫染色,500×);B為各組細胞穿孔數(shù)柱狀圖。a為P<0.05,與LV-Ctrl組比較;b為P<0.05,與LV-MACC1組比較。

2.5 低氧及過表達MACC1對腫瘤球形成的影響

各組細胞培養(yǎng)14天后計數(shù)>50 μm3的腫瘤球數(shù)量,LV-Ctrl組、LV-MACC1組和LV-MACC1+hypoxia組的腫瘤球數(shù)量分別是(43.8±2.1)個、(63.8±2.5)個和(82.2±2.7)個。腫瘤球數(shù)LV-MACC1+hypoxia組>LV-MACC1組>LV-Ctrl組(P<0.05;圖5)。

圖5 低氧及過表達MACC1對結(jié)腸癌細胞腫瘤球形成的影響(200×)

2.6 低氧及過表達MACC1對CD44、CD133及AKT蛋白表達的影響

蛋白印跡法結(jié)果顯示,CD44、CD133和p-AKT蛋白相對表達量LV-MACC1+hypoxia組>LV-MACC1組>LV-Ctrl組(P<0.05;圖6)。

圖6 低氧及過表達MACC1對CD44、CD133和AKT蛋白表達的影響1為LV-Ctrl組;2為LV-MACC1組;3為LV-MACC1+hypoxia組。a為P<0.05,與LV-Ctrl組比較;b為P<0.05,與LV-MACC1組比較。

2.7 激活PI3K/AKT通路活性對干細胞標記物的影響

740 Y-P激活細胞PI3K/AKT信號通路活性后,激活后的細胞CD44、CD133蛋白表達較對照組增加(P<0.05;圖7)。

圖7 激活PI3K/AKT信號通路對CD44、CD133蛋白表達的影響a為P<0.05,與對照組比較。

3 討 論

盡管外科技術(shù)、化療藥物和分子靶向藥物取得了新進展,但CRC患者數(shù)量卻正在逐步增加[1]。至少有三分之一的CRC患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移而導致死亡[3]。有研究證實,MACC1可通過多種機制促進CRC細胞進展、耐藥,維持CSC特性[13-14]。本研究表明,在結(jié)腸癌HCT116細胞中過表達MACC1可誘導促進CSC樣特性的發(fā)展。本研究結(jié)果表明,MACC1表達上調(diào)后,除了能促進CRC惡性行為能力,還增強了CSC樣標記物CD44、CD133的表達水平和增加了腫瘤球形成,同時PI3K/AKT通路參與了MACC1的上述對HCT116細胞的作用。然而,公認為CRC發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟多因素的復合作用下的不良事件,繼續(xù)尋找MACC1的協(xié)同因素對CRC進展機制的闡明有重要意義。

低氧微環(huán)境是CSC形成和維持的關鍵成分,低氧微環(huán)境能誘導CD133等作為CSC的特異性生物標志物的表達[4]。CSC具有3個獨特的特性:自我更新、顯示親代腫瘤癌細胞的所有特征、表達一組獨特的表面生物標志物[15]。目前的抗腫瘤治療缺乏對CSC的靶向性,不能導致腫瘤的消退。本研究表明,低氧環(huán)境有進一步協(xié)調(diào)加強MACC1誘導促進CSC樣特性的作用和進一步促進腫瘤增殖、遷移和侵襲能力,且PI3K/AKT通路參與其中。CSC是存在于特定的生態(tài)環(huán)境中的,目前針對CSC的研究,分離出來的CSC大多數(shù)脫離了微環(huán)境情況下的研究。這提示筆者結(jié)合微環(huán)境進行CSC的研究可能是更加科學合理的一種方法。

目前CRC中關于低氧微環(huán)境與MACC1兩者如何相互作用促進CSC樣特性的機制尚不明確。低氧微環(huán)境已被證實可通過激活PI3K/AKT通路調(diào)控誘導多種癌細胞出現(xiàn)CSC樣特性[15-17]。這提示低氧微環(huán)境和MACC1可能通過某些相同通路共同促進CRC的CSC樣特性。本研究結(jié)果表明,在MACC1過表達的CRC細胞中,p-AKT表達水平增高,表明PI3K/AKT的激活增強。隨后,740 Y-P處理的細胞的CSC標記物表達明顯升高。這些結(jié)果表明,PI3K/AKT信號通路可能在低氧微環(huán)境和MACC1促進結(jié)腸癌CSC樣特性中發(fā)揮關鍵作用;然而,這一過程具體機制有待進一步研究。

綜上所述,MACC1過表達促進CRC腫瘤干細胞樣特性出現(xiàn),并且低氧環(huán)境能促進加強這種作用,其中機制通過激活PI3K/AKT信號通路促進CRC細胞出現(xiàn)CSC樣特性。針對低氧微環(huán)境和MACC1的策略可能是CRC中消除CSC的潛在靶點。但需要進一步的研究來確定低氧微環(huán)境和MACC1在腫瘤干細胞樣特性中的作用,并了解其潛在的機制。