一種可視化檢測肼的苯并噁唑類熒光增強(qiáng)型探針

王漢林 鄭 漢 黃杰勛 黃衛(wèi)東 楊龍元 李 武

(1湖北理工學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，黃石 435003)

(2礦區(qū)環(huán)境污染控制與修復(fù)湖北省重點實驗室，黃石 435003)

(3湖北理工學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，黃石 435003)

肼(N2H4)是一種有毒的物質(zhì)，具有良好的水溶性、較強(qiáng)的堿性和還原性。作為一種重要的化工原料，它廣泛應(yīng)用于染料、制藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[1-2]。然而，N2H4在生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用和處理的過程中的泄露或者不合理排放會對環(huán)境安全和人體健康造成重大威脅[3]。研究表明，N2H4通過呼吸或皮膚接觸等途徑被人體吸收后，會對人的腎、肝、肺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等造成嚴(yán)重的損傷[4-6]。美國環(huán)境保護(hù)署(EPA)已將N2H4列為潛在的致癌物，規(guī)定它在飲用水中的最高容許濃度為0.31 μmol·L-1[7]。因此，迫切需要開發(fā)一種簡單方便、靈敏快捷的方法來檢測環(huán)境和生物樣品中N2H4的含量。

熒光探針技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于檢測各種重金屬離子、農(nóng)藥、有機(jī)或無機(jī)污染物等有毒有害物質(zhì)[8-9]。該檢測方法簡便快捷，具有成本低、靈敏度和選擇性高、能原位實時監(jiān)測等優(yōu)點，受到了廣大科研人員越來越多的重視[10-11]。自2011年首次報道了第一例用于檢測N2H4的熒光探針以來，到目前為止已經(jīng)開發(fā)了多種這類熒光探針[12-13]。它們絕大多數(shù)是熒光增強(qiáng)型的反應(yīng)型探針，N2H4作為親核試劑，可與探針的識別基團(tuán)發(fā)生環(huán)化、開環(huán)、基團(tuán)轉(zhuǎn)化和脫保護(hù)等特異性反應(yīng)[1,14]。然而，許多探針仍存在抗干擾能力差、響應(yīng)慢等缺陷，難以在復(fù)雜環(huán)境中實現(xiàn)N2H4的檢測[7,13,15]。開發(fā)靈敏快捷、選擇性好的高性能熒光探針仍然是當(dāng)前一項挑戰(zhàn)性的研究工作。

苯并噁唑類化合物具有優(yōu)異的光物理和光化學(xué)性能，可用于構(gòu)建檢測金屬離子或小分子的熒光探針[16-18]。基于Gabriel 合成法，我們以鄰苯二甲酸酐等為原料，設(shè)計并合成了一種苯并噁唑類熒光增強(qiáng)型探針2-(2-(苯并[d]噁唑-2-基)苯基)異吲哚啉-1，3-二酮(HL2)，其合成路線如Scheme 1 所示。HL2 以苯并噁唑結(jié)構(gòu)單元為熒光團(tuán)，鄰苯二甲酰亞胺結(jié)構(gòu)單元為識別位點，可實現(xiàn)對N2H4的選擇性識別。HL2 對N2H4表現(xiàn)出較高的靈敏度和選擇性，不僅能應(yīng)用于水體樣品中N2H4的檢測，還可對HeLa 活細(xì)胞中的N2H4進(jìn)行熒光成像。

Scheme 1 Synthesis of fluorescent probe HL2

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

實驗所用試劑均為市售分析純。所用儀器包括XT4A型顯微熔點儀、Perkin-Elmer 2400元素分析儀、pHS-3C pH 計、Analytik jena Specord 210 紫外光譜儀、Varian-Cary-Eclipse 熒光光譜儀、Applied Biosystems API 2000 LC/MS/MS 質(zhì)譜儀、Varian 640-IR 紅外光譜儀(KBr 壓片法)、Bruker 400 MHz 核磁共振波譜儀、Brucker APEX-ⅡCCD 單晶衍射儀、Leica DMI 3000B熒光倒置顯微鏡。

1.2 探針HL2的合成

2-(2-氨基苯基)苯并噁唑(1)按照文獻(xiàn)[17]的方法制備。先將鄰苯二甲酸酐(1.48 g，10 mmol)和1(1.05 g，5 mmol)溶于乙酸(30 mL)中，然后將反應(yīng)混合物攪拌，并于120 ℃回流24 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入500 mL 冰水中，用1.0 mol·L-1NaOH 水溶液將pH值調(diào)至8。抽濾，用蒸餾水洗滌濾餅(30 mL×3)，所得固體于80 ℃干燥12 h 后，再用硅膠柱分離(V石油醚∶V乙酸乙酯=10∶1)，產(chǎn)率為67.8%。m.p.165～167 ℃。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：7.10～7.28(m，4H)，7.43(d，J=8.0 Hz，1H)，7.58～7.62(m，2H)，7.73～7.78(m，2H)，7.90(d，J=8.0 Hz,2H),8.36(m,1H)。13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)：109.0，119.0，122.4，123.1，124.1，128.4，128.9，129.9，130.7，131.3，132.8，140.4，148.1,158.5,166.7。ESI-MS(m/z)：341.15[M+H]+。IR(KBr，cm-1)：1 717(s)，1 612(w)，1 496(m)，1 227(w)，733(m),707(w)。C21H12N2O3元素分析計算值(%)：C 74.11；H 3.55；N 8.23；實驗值(%)：C 74.32；H 3.79；N 8.01。

1.3 晶體的測定

選取大小為0.30 mm×0.20 mm×0.20 mm 的淺黃色HL2 晶體，置于Brucker APEX-ⅡCCD 單晶衍射儀上收集X 射線衍射數(shù)據(jù)，輻射源是石墨單色化的MoKα射線(λ=0.071 073 nm)，溫度為296.15 K，以ω-2θ方式掃描，在2.44°＜θ＜32.03°范圍內(nèi)收集衍射點數(shù)據(jù)。全部衍射數(shù)據(jù)經(jīng)Lp 因子和經(jīng)驗吸收校正。晶體結(jié)構(gòu)通過SHELXS-2014 采用直接法進(jìn)行解析，部分非氫原子坐標(biāo)在以后的數(shù)輪差值傅里葉合成中陸續(xù)確定。對所有非氫原子坐標(biāo)及其溫度因子用全矩陣最小二乘法進(jìn)行精修[19]。所有氫原子均為理論加氫并按跨式模型(riding model)精修，其溫度因子為其母原子溫度因子平均值的1.2倍～1.5倍。

CCDC：2268187。

1.4 光譜實驗

首先將HL2 配制成1 mmol·L-1的乙醇溶液，各種分析物(F-、Cl-、Br-、I-、SCN-、HSO3-、SO32-、N3-、NO3-、NO2-、NH3、NH2OH、CO(NH2)2、CH3NH2和N2H4)用二次蒸餾水配制成1 mmol·L-1的儲備溶液。測試前，將HL2 和各種分析物混合，然后用EtOH/Tris-HCl緩沖溶液(體積比1∶9，pH=7.4)稀釋至所需濃度。將混合溶液渦旋混勻2 min 后，在室溫下進(jìn)行紫外光譜和熒光光譜測試(λex=352 nm，λem=445 nm，狹縫：10 nm/10 nm)。

1.5 水體樣品中N2H4的檢測

選取農(nóng)夫山泉瓶裝礦泉水(中國杭州市)、自來水(黃石市自來水有限公司)和湖水(中國湖北省黃石市磁湖)3 種水樣進(jìn)行N2H4檢測的回收實驗。3 種水樣在使用前都沒有過濾，直接以其代替熒光測試所用的蒸餾水。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定3種水樣中不同濃度的N2H4溶液(4.00、8.00 和12.00 μmol·L-1)。測試前，將探針HL2 和加入N2H4的水體樣品渦旋混勻2 min，然后進(jìn)行熒光光譜測試。

1.6 細(xì)胞毒性和熒光成像

在Tris-HCl 緩沖體系中，將事先培養(yǎng)好的HeLa細(xì)胞加入5 μmol·L-1的探針HL2 溶液(pH=7.4，VH2O∶VEtOH=9∶1)，于37 ℃分別恒溫培養(yǎng)12 和24 h，不加探針的細(xì)胞作為對照組，然后采用MTT 法測定細(xì)胞活力。

將探針HL2(5 μmol·L-1)加入到用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗3 次后的HeLa 細(xì)胞中，于37 ℃恒溫孵育30 min 后，再用PBS 洗3 次以便除去HL2 溶液，然后進(jìn)行細(xì)胞的熒光成像。進(jìn)一步向上述含HL2 的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入N2H4溶液(15 μmol·L-1)，在37℃恒溫培養(yǎng)30 min 后，用PBS 清洗3 次，再次進(jìn)行細(xì)胞的熒光成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 HL2的晶體結(jié)構(gòu)

熒光探針HL2 是一種通過酸酐與有機(jī)胺(1)反應(yīng)得到的酰胺類化合物。將探針HL2 溶解在丙酮中，然后于室溫下靜置2 d 后可得淺黃色的晶體。單晶X 射線衍射分析表明，HL2 的結(jié)晶屬于單斜晶系，空間群為C2/c(表1)。在HL2 晶體結(jié)構(gòu)中，苯并噁唑環(huán)和相鄰的苯環(huán)幾乎共面，二者之間的二面角為5.99(2)°，鄰苯二甲酰亞胺環(huán)和它們之間的二面角分別為61.38(1)°和63.03(1)°(圖1)。C—N 鍵的鍵長范圍為0.129 2(2)～0.142 7(2)nm，且C2—N1(氨基)鍵長大于C15—N2(苯并噁唑)鍵長(表2)。鄰苯二甲酰亞胺環(huán)上的2 個羰基的C—O(C7—O1 和C8—O2)鍵長基本相等，但它們短于苯并噁唑環(huán)上的2 個C—O(C15—O3 和C17—O3)鍵長。C1—C2—N1 和C2—C1—C15 的鍵角分別為121.79(12)°和123.53(12)°，這導(dǎo)致探針HL2呈現(xiàn)V形結(jié)構(gòu)。

表1 HL2的晶體學(xué)數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Crystal data and structure refinements of HL2

表2 HL2的部分鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of HL2

圖1 HL2的橢球概率50%的晶體結(jié)構(gòu)Fig.1 Crystal structure of HL2 with 50% ellipsoid probability

2.2 HL2對N2H4的響應(yīng)

為了考察探針的選擇性，向10 μmol·L-1HL2 中加入30 μmol·L-1的各種分析物(F-、Cl-、Br-、I-、SCN-、HSO3-、SO32-、N3-、NO3-、NO2-、NH3、NH2OH、CO(NH2)2、CH3NH2和N2H4)，然后測試探針在發(fā)射波長(λem=445 nm)處的熒光強(qiáng)度(λex=352 nm)。如圖2所示，N2H4對HL2 表現(xiàn)出顯著的熒光增強(qiáng)效應(yīng)，而其它分析物幾乎不會明顯改變HL2 的熒光強(qiáng)度，這表明HL2 有優(yōu)異的選擇性識別N2H4的能力。紫外可見光譜顯示，向HL2(10 μmol·L-1)中加入N2H4(30 μmol·L-1)后，它的最大吸收波長基本沒有變化，但其吸收強(qiáng)度增強(qiáng)(圖3)。向HL2(10 μmol·L-1)與N2H4(30 μmol·L-1)的反應(yīng)體系中加入各種干擾物(300 μmol·L-1)后，可發(fā)現(xiàn)HL2 對N2H4的熒光響應(yīng)幾乎不受影響(圖4)。故HL2 對N2H4具有良好的選擇性和較強(qiáng)的抗干擾能力，可適合復(fù)雜環(huán)境中N2H4的檢測。

圖2 HL2對各種分析物的熒光響應(yīng)Fig.2 Fluorescent response of HL2 to various analytes

圖3 HL2在加入N2H4前后的紫外可見光譜Fig.3 UV-Vis spectra of HL2 before and after addition of N2H4

圖4 在各種干擾物的存在下,HL2識別N2H4(30 μmol·L-1)的熒光響應(yīng)Fig.4 Fluorescence response of HL2 to N2H4 in the presence of various interferents

進(jìn)一步利用熒光滴定實驗測試了HL2 對N2H4的靈敏度(圖5a)。HL2 自身的熒光強(qiáng)度較弱，它的量子產(chǎn)率(Φ)為0.08。當(dāng)向HL2(10 μmol·L-1)中逐漸加入3倍的N2H4后，它的熒光強(qiáng)度逐漸增大，直至達(dá)到穩(wěn)定，此時反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度增大了15 倍(Φ=0.69)。此外，在實驗中還發(fā)現(xiàn)HL2 的熒光強(qiáng)度與N2H4的濃度(0.1～25 μmol·L-1)之間存在良好的線性關(guān)系(y=103.61+115.96x，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.987 5，圖5b)。HL2對N2H4的檢出限(3σ/k，σ指空白標(biāo)準(zhǔn)偏差，k是線性方程的斜率)為0.072 μmol·L-1，它遠(yuǎn)低于EPA 規(guī)定的N2H4的閾限值(0.31 μmol·L-1)。因此，HL2 對N2H4有較高的靈敏度，可以用于定量檢測N2H4。

圖5 (a)滴加不同濃度的N2H4后HL2的熒光光譜;(b)HL2的熒光強(qiáng)度與N2H4濃度之間的線性關(guān)系Fig.5 (a)Fluorescence spectra of HL2 upon addition of N2H4 with various concentrations;(b)Linear relationship between the fluorescence intensity of HL2 and the concentration of N2H4

不同pH 值對HL2 的影響如圖6 所示。HL2 的熒光強(qiáng)度在pH=3～10 的范圍內(nèi)幾乎保持穩(wěn)定。當(dāng)加入N2H4后，HL2 的熒光強(qiáng)度隨pH 值增大而逐漸增強(qiáng)，而在pH=5～10 的較寬范圍內(nèi)，它的熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定?？紤]到環(huán)境和生物體系中的應(yīng)用，選擇在生理pH(7.4)下進(jìn)行所有光譜實驗的測試。HL2對N2H4的響應(yīng)快速(圖7)。向HL2(10 μmol·L-1)中加入N2H4(30 μmol·L-1)后，反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度隨著時間的延長逐漸增大，在2 min 后達(dá)到最大值，且熒光強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定，證實HL2 是一種快速檢測N2H4的熒光增強(qiáng)型探針。將此時的反應(yīng)液用波長為365 nm 的紫外燈照射，可用肉眼觀察到加入N2H4前后HL2 溶液的熒光顏色由無色變?yōu)樗{(lán)色(圖7 插圖)。這種明顯的顏色變化和熒光“關(guān)-開”響應(yīng)，表明HL2可以實現(xiàn)對N2H4的可視化檢測。

圖6 在N2H4加入或不加入的條件下，不同pH值對HL2熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of different pH values on the fluorescence intensity of HL2 with and without the addition of N2H4

圖7 HL2在加入N2H4后熒光強(qiáng)度隨時間的變化Fig.7 Time-dependent fluorescence intensity changes of HL2 with the addition of N2H4

2.3 HL2對N2H4的識別機(jī)理

為了探索HL2 對N2H4的可能識別機(jī)理，進(jìn)行了核磁氫譜測試。與HL2 的核磁譜圖對比，當(dāng)加入N2H4后，HL2 的鄰苯二甲酰亞胺基團(tuán)在δ7.90～8.36處的質(zhì)子信號消失，并且在δ6.18 處出現(xiàn)新的氨基峰(圖8)。此外，發(fā)現(xiàn)HL2與N2H4反應(yīng)產(chǎn)物的核磁氫譜與化合物1 高度相似，說明HL2 的鄰苯二甲酰亞胺基團(tuán)肼解后生成了1。這個結(jié)果也可通過紅外光譜進(jìn)一步證實。如圖9 所示，比較HL2、1 和HL2 與N2H4的反應(yīng)產(chǎn)物的紅外光譜，可發(fā)現(xiàn)HL2 在1 717 cm-1處顯示的是鄰苯二甲酰亞胺的羰基特征吸收峰，而在HL2 和N2H4的反應(yīng)產(chǎn)物中，該峰的信號消失，卻在3 428 和3 323 cm-1處出現(xiàn)了2 個新的氨基吸收峰，并且該產(chǎn)物的紅外譜圖與1 基本相同?；谏鲜鼋Y(jié)果，推測了一種HL2 對N2H4的識別機(jī)理(Scheme 2)。HL2的鄰苯二甲酰亞胺基團(tuán)被肼解后，釋放出含有氨基的化合物1，它會產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)效應(yīng)，從而導(dǎo)致了熒光的增強(qiáng)。這種機(jī)理也與以前報道的Gabriel 反應(yīng)型熒光探針檢測N2H4的機(jī)理一致[20-21]。

圖8 HL2、HL2+N2H4和化合物1在DMSO-d6中的1H NMR譜圖Fig.81H NMR spectra of HL2,HL2+N2H4 and compound 1 in DMSO-d6

圖9 探針HL2、化合物1和HL2與N2H4反應(yīng)產(chǎn)物的紅外光譜Fig.9 IR spectra of probe HL2,compound 1 and the product of HL2 and N2H4

Scheme 2 Possible reaction mechanism of probe HL2 and N2H4

2.4 水體樣品中N2H4的檢測

為了考察HL2 的實際應(yīng)用價值，選取礦泉水、自來水和湖水進(jìn)行N2H4的加標(biāo)回收實驗。

向3 種待測水樣中加入不同濃度的N2H4溶液(0、4.00、8.00 和12.00 μmol·L-1)，通過熒光光譜檢測水樣中N2H4的濃度。如表3 所示，HL2 檢測不出礦泉水、自來水和湖水中的N2H4，而向這3個水體樣品中加入外源的N2H4后，N2H4的回收率在95.75%～104.25%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.27%～4.79%之間，這表明HL2 可定量檢測不同水體樣品中的N2H4，具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 不同水樣中N2H4的檢測Table 3 Detection of N2H4 in various water samples

2.5 HL2檢測細(xì)胞中的N2H4

首先，采用MTT 法在HeLa 細(xì)胞中對HL2 的細(xì)胞毒性進(jìn)行了測試(圖10)。將HL2(5 μmol·L-1)在HeLa 細(xì)胞中分別孵育12 或24 h，發(fā)現(xiàn)HeLa 細(xì)胞的存活率仍保持在90%以上，這證實HL2(5 μmol·L-1)對HeLa細(xì)胞沒有明顯的毒性。其次，進(jìn)一步研究了HL2在HeLa細(xì)胞中對N2H4的熒光成像。將5 μmol·L-1HL2 在HeLa 細(xì)胞中于37 ℃孵育30 min 后，沒有觀察到熒光信號(圖11A)。再向上述含HL2 的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入15 μmol·L-1N2H4，繼續(xù)在37 ℃孵育30 min后，可發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色熒光(圖11C)。同時，與之對應(yīng)的亮場圖像沒有觀察到HeLa 細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象(圖11B 和11D)，這說明HL2具有良好的細(xì)胞膜通透性，在檢測生物樣品中的N2H4方面有潛在應(yīng)用。

圖10 與探針HL2共孵育12或24 h后HeLa細(xì)胞的存活率Fig.10 Cell viability of HeLa cells incubated with probeHL2 for 12 or 24 h

圖11 探針HL2孵育的HeLa細(xì)胞的熒光圖像Fig.11 Fluorescence images of HeLa cells incubated with probe HL2

3 結(jié) 論

合成了一種用于可視化檢測N2H4的苯并噁唑類熒光增強(qiáng)型探針HL2，它能在2 min內(nèi)快速地識別N2H4，并伴隨著熒光顏色由無色變?yōu)樗{(lán)色的明顯變化。HL2 對N2H4具有較高的選擇性和靈敏度，抗干擾能力強(qiáng)，它在各種水體樣品和HeLa 活細(xì)胞中對N2H4的檢測表明，HL2 在生物和環(huán)境方面具有潛在的應(yīng)用價值。