植物遺傳轉(zhuǎn)化中體細(xì)胞再生的分子機制及應(yīng)用研究進(jìn)展

李玉珠，余江弟，丁菲菲，苗佳敏，白小明，師尚禮

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可將目的基因或基因編輯產(chǎn)物插入受體植物的基因組，獲得的再生植株為進(jìn)一步研究基因功能并開展新品種選育工作奠定基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的再生能力是決定遺傳轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵因子，也是限制轉(zhuǎn)基因及基因編輯技術(shù)在植物上廣泛應(yīng)用的主要瓶頸。植物再生的基礎(chǔ)是植物細(xì)胞的全能性，即單個分化的體細(xì)胞或分生組織細(xì)胞再生成完整植株的能力［1］。盡管植物細(xì)胞具有全能性，但自然界中的37 萬多種高等植物中，只有不到0.1%的植物可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作［2］。對于已建立遺傳轉(zhuǎn)化體系的植物，基于農(nóng)桿菌侵染和基因槍轟擊的轉(zhuǎn)化技術(shù)通常需要花費大量的時間和精力通過組織培養(yǎng)獲得再生植株。經(jīng)愈傷組織形成的再生芽發(fā)生（de novoshoot organogenesis）和體胚發(fā)生（somatic embryogenesis，SE）是許多植物產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因系的標(biāo)準(zhǔn)程序。隨著對愈傷組織形成和再生分子機制研究的不斷深入，與生長素和細(xì)胞分裂素（cytokinin，CK）生物合成、感應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的生長調(diào)節(jié)基因和發(fā)育調(diào)節(jié)基因在調(diào)控植物體外再生中的功能被鑒定，這些基因在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用能顯著提高再生效率和轉(zhuǎn)化效率，縮短轉(zhuǎn)化時間，實現(xiàn)在更廣泛的物種和基因型上開展轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)。本研究在總結(jié)遺傳轉(zhuǎn)化過程中植物體細(xì)胞再生完整植株的不同途徑和方式基礎(chǔ)上，以再生芽發(fā)生和體胚發(fā)生的間接再生途徑為主，闡釋了影響再生的因素和分子機制及再生促進(jìn)基因（生長調(diào)節(jié)基因和發(fā)育調(diào)節(jié)基因）在提高遺傳轉(zhuǎn)化效率方面的應(yīng)用，并提出了今后開展研究的方向及前景。

1 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生方式

植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中的外植體取材廣泛，根據(jù)體細(xì)胞來源不同可分為兩種類型，一種是存在于莖分生組織中的未分化細(xì)胞，即干細(xì)胞（stem cell，SC），另一種是已分化的體細(xì)胞。SC 是植物體所有地上器官的來源，但數(shù)量稀少且難以直接進(jìn)行遺傳操作，目前僅在大豆（Glycine max）［3-5］、黃羽扇豆（Lupinus luteus）［6］和小麥（Triticum aestivum）［7］上有成功被用于遺傳轉(zhuǎn)化并再生植株的報道。利用已分化的體細(xì)胞作為外植體時，這些體細(xì)胞需經(jīng)過重編程，重獲多能性或全能性后再生完整植株。根據(jù)再生方式和再生產(chǎn)物的不同，已分化體細(xì)胞的再生可分為器官發(fā)生途徑和體胚發(fā)生途徑，這兩個途徑都有直接發(fā)生方式和間接發(fā)生方式。間接發(fā)生方式中，外植體首先形成愈傷組織，通過愈傷組織的增殖和分化，以再生莖發(fā)生方式或體胚發(fā)生方式再生。直接發(fā)生方式中，外植體繞過愈傷組織誘導(dǎo)階段，直接發(fā)育成體胚或莖等營養(yǎng)器官。因此，植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中被轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的再生方式共有5 種，分別是依賴分生組織的器官發(fā)生、依賴愈傷組織形成的器官發(fā)生或體胚發(fā)生以及繞過愈傷組織形成的器官發(fā)生或體胚發(fā)生。器官發(fā)生的間接途徑（即外植體—愈傷組織—再生莖發(fā)生或體胚發(fā)生）是大多數(shù)植物在遺傳轉(zhuǎn)化中實現(xiàn)體外再生的方式。在此過程中，愈傷組織的誘導(dǎo)、具備多能性或全能性細(xì)胞的獲得以及芽再生或體胚再生是實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化與植株再生的重要環(huán)節(jié)和關(guān)鍵步驟。

2 愈傷組織誘導(dǎo)和再生分子機制的研究進(jìn)展

外源植物激素誘導(dǎo)愈傷組織形成和再生的過程可分為4 個階段，依次是外植體身份特征的消除、根特性的重新建立、莖特性的重新建立以及器官發(fā)生或體胚發(fā)生方式再生完整植株［8］。許多遺傳和環(huán)境因子都會影響這個過程，其中，創(chuàng)傷、表觀遺傳修飾、生長素和細(xì)胞分裂素的作用最為重要。

2.1 早期創(chuàng)傷反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

創(chuàng)傷是誘導(dǎo)愈傷組織形成的外部因素，它引起外植體發(fā)生一系列物理和化學(xué)變化，這些變化始于對創(chuàng)傷引起的相關(guān)分子模式的感知，并觸發(fā)胞質(zhì)鈣信號和活性氧簇的爆發(fā)。局部創(chuàng)傷信號被翻譯成長距離信號后，進(jìn)一步誘導(dǎo)表觀遺傳修飾發(fā)生、生長素和CK 的合成與積累以及生長和發(fā)育調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)［9-10］。創(chuàng)傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄上調(diào)表達(dá)的基因包括染色質(zhì)重塑調(diào)節(jié)基因POLYCOMB REPRESSIVE COMPLEX2（PRC2），細(xì)胞周期基因CYCLINs（CYCs）和CYCLINDEPENDENT KINASES（CDKs），細(xì)胞分裂素合成基因ISOPENTENYL TRANSFERASE（IPT），生長素合成基因YUCCA5（YUC5），創(chuàng)傷反應(yīng)中心調(diào)節(jié)因子WOUND-INDUCED DEDIFFERENTIATION1-4（WIND1-4）和芽再生增強因子ENHANCER OF SHOOT REGENERATION1（ESR1）等［10-11］。其中，CYCs和CDKs的表達(dá)可重新激活細(xì)胞周期，從而使細(xì)胞重獲增殖能力，這是愈傷組織形成的中心機制［12］，而WINDs通過直接與ESR1啟動子結(jié)合并上調(diào)其表達(dá)促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)［13］。沒有創(chuàng)傷處理時，擬南芥（Arabidopsis thaliana）的根在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（callus induction media，CIM）和莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基（shoot induction media，SIM）上只能長出側(cè)根而不能再生莖，說明創(chuàng)傷是從根到莖的細(xì)胞命運轉(zhuǎn)變所必需的［14］。CIM 上的根因剪切造成傷口后可顯著提高體胚發(fā)生效率，也證實了創(chuàng)傷應(yīng)激和激素誘導(dǎo)的再生之間存在緊密關(guān)系［15］。

2.2 表觀遺傳修飾

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的表觀遺傳修飾會引起與愈傷組織誘導(dǎo)有關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生全基因組水平的變化［16-17］。組蛋白H3 第27 位賴氨酸的三甲基化修飾（H3K27me3）是一類重要的轉(zhuǎn)錄抑制性翻譯后修飾（post-translational modification，PTM），在植物生長發(fā)育的各個進(jìn)程中發(fā)揮作用，也是葉片外植體轉(zhuǎn)化為愈傷組織的關(guān)鍵因子。PRC2是H3K27me3 建立和維持的關(guān)鍵基因，該基因既可沉默葉片發(fā)育調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，也可去除生長素合成基因YUC4和生長素/吲哚-3-乙酸基因auxin/INDOLE-3-ACETIC ACID2（AUX/IAA2）以及根發(fā)育調(diào)控基因WOX5（WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX5）和SHORT-ROOT（SHR）上的抑制性甲基標(biāo)記，直接參與葉片身份的消除［18］。此外，PRC2 介導(dǎo)的抑制性組蛋白修飾也控制創(chuàng)傷響應(yīng)基因WIND的表達(dá)［19］，WIND通過上調(diào)B型反應(yīng)調(diào)節(jié)因子ARR-B（type-B ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR）的表達(dá)水平激活CK 生物合成途徑，促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)［20］。染色質(zhì)重塑蛋白PICKLE（PKL）可結(jié)合在H3K27me3 靶基因的啟動子區(qū)直接影響H3K27me3 水平［21］，并通過組蛋白去乙?；种艭K 響應(yīng)，其突變體中因H3K37me3 水平的降低而形成愈傷組織［22］。染色質(zhì)修飾基因ARABIDIPSIS TRITHORAX4（ATX4）的表達(dá)在愈傷組織誘導(dǎo)期間被抑制，當(dāng)莖身份基因KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX GENE 4（KNAT4）和YABBY 5（YAB5）上的H3K4me3 甲基基團(tuán)被去除后，該基因被重新激活并促進(jìn)器官發(fā)生途徑的再生［23］。此外，表觀遺傳重編程也引起愈傷組織誘導(dǎo)和再生過程中關(guān)鍵基因，即發(fā)育調(diào)節(jié)基因表觀遺傳狀態(tài)的局部變化。這些關(guān)鍵基因包括WIND3，BABY BOOM（BBM），LEAFY COTYLEDON1（LEC1），LEC2和WOX5/11等［16］。因此，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的整體和局部修飾參與了愈傷組織形成和再生的所有過程，不同的表觀遺傳修飾組合和發(fā)生的時序性塑造了愈傷組織中不同細(xì)胞后續(xù)發(fā)育命運的復(fù)雜性。

2.3 生長素促進(jìn)愈傷組織形成和細(xì)胞多能性的獲得

細(xì)胞增殖能力的重新獲得是愈傷組織誘導(dǎo)的主要特征。CIM 上愈傷組織的形成類似側(cè)根原基發(fā)生過程，啟動木質(zhì)部中柱鞘細(xì)胞分裂的激素是生長素［24］。生長素通過ARF（AUXIN RESPONSE FACTOR）轉(zhuǎn)錄因子ARF7 和ARF19 介導(dǎo)的側(cè)根形成相關(guān)基因LBD（LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN）的激活誘導(dǎo)愈傷組織形成，實現(xiàn)將生長素信號通過側(cè)根形成基因轉(zhuǎn)化為細(xì)胞周期再激活的模式［25］。過表達(dá)調(diào)控側(cè)根形成的基因（LBD16、LBD17、LBD18和LBD29）可在無外源激素的情況下誘導(dǎo)愈傷組織的形成［26］。除了激活調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵基因，生長素還可下調(diào)編碼細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDKs 的抑制基因KIP-RELATED PROTEN（KRP）以及生長素調(diào)節(jié)組蛋白乙?；璧木幋a轉(zhuǎn)錄接頭蛋白基因PROPORZ1（PRZ1，也稱為At-ADA2b）［27］，將生長素信號轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞周期重激活模式。CIM 上培養(yǎng)的愈傷組織經(jīng)細(xì)胞增殖可獲得多能性。生長素通過兩個不同的途徑促進(jìn)細(xì)胞多能性的獲得。一個途徑由WOX11和LBD16介導(dǎo)，LBD16被WOX11激活后在CIM 上形成的愈傷組織中特異表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞多能性獲得。一旦WOX11-LBD16途徑被阻斷會導(dǎo)致愈傷組織喪失多能性，在SIM 上無法再生莖［28］。另一個途徑涉及根分生組織發(fā)育調(diào)節(jié)基因PLT1和PLT2。生長素通過PLT3、PLT5 和PLT7 激活PLT1和PLT2的表達(dá)，賦予細(xì)胞多能性［29-30］。PLT3、PLT5 和PLT7 也能調(diào)節(jié)芽再生促進(jìn)基因CUC2（CUP-SHAPED COTYLEDON2）的表達(dá)［31］，使SIM 上具備多能性的細(xì)胞再生完整莖［29］。因此，組織培養(yǎng)中芽再生過程包括兩個不同的步驟，分別是CIM 上多能細(xì)胞的形成以及SIM 上多能細(xì)胞再生莖。芽再生過程中生長素的作用尚不明確，但YUC1和YUC4可在SIM 上被誘導(dǎo)，芽再生需要YUC 介導(dǎo)的生長素合成［32］。

2.4 細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)愈傷組織形成和芽再生

CK 誘導(dǎo)愈傷組織形成的關(guān)鍵組分是B 型ARRs。B 型ARRs 促進(jìn)細(xì)胞周期重啟的靶蛋白是CYCD3（一種D型細(xì)胞周期蛋白），在缺乏外源CK 時，過表達(dá)CYCD3可誘導(dǎo)擬南芥愈傷組織的形成［33］。AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員ESR（ENHANCED SHOOT REGENERATION）參與CK 信號通路，可通過直接激活CYCD1；1的表達(dá)促進(jìn)愈傷組織形成。在不含外源激素的培養(yǎng)基上過表達(dá)ESR1和其功能冗余同源基因ESR2可誘導(dǎo)擬南芥愈傷組織的形成［34］。ESR 也能上調(diào)縮短G1期持續(xù)時間的OBP1基因（OBF BINDING PROTEIN1），后者可直接與CYCD3；3和S 期特異轉(zhuǎn)錄因子基因DOF2；3（DOF TF OBF2；3）的啟動子序列結(jié)合［35］。因此，CK 通過ESR 介導(dǎo)的細(xì)胞周期重新激活方式實現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)，該過程受多個轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控以共同協(xié)調(diào)不同細(xì)胞周期基因的表達(dá)。CK 通過WOX5 和 B 型 ARR12 抑制ARRs-A表達(dá)，隨著CIM 上誘導(dǎo)的愈傷組織對CK 響應(yīng)敏感性的增強可使細(xì)胞獲得多能性。CK 可誘導(dǎo)SIM 上獲得多能性的細(xì)胞再生芽，涉及CK 響應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因調(diào)控該過程。CK 受體組氨酸激酶（histidine kinases，HKs）在芽再生中起主要作用［36］，過表達(dá)CK 下游信號成分，如ARR1可在沒有外源CK 的情況下再生芽［37］。CK 誘導(dǎo)芽再生的關(guān)鍵基因是WUSCHEL（WUS）。WUS表達(dá)水平的增加足以激活不定芽形成［38］，WUS的功能缺失突變體則無法在SIM 上實現(xiàn)芽再生［39］。CK 是通過ARR（ARR1、ARR10 和ARR12）的介導(dǎo)激活了WUS的表達(dá)，促進(jìn)莖頂端分生組織（shoot apical meristem，SAM）的形成［40-42］。該過程中，Ⅲ類同源結(jié)構(gòu)域亮氨酸拉鏈（class Ⅲ homeodomain-leucine zipper，HD-Zip Ⅲ）轉(zhuǎn)錄因子PHABULOSA（PHB）、PHAVOLUTA（PHV）和REVOLOTA（REV）直接與B 型ARR 相互作用以激活WUS的表達(dá)，是CK 誘導(dǎo)WUS表達(dá)和隨后芽再生不能缺少的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［43］。

2.5 生長素誘導(dǎo)體胚發(fā)生

外源生長素2，4-D 用于誘導(dǎo)擬南芥體胚時，胚性愈傷組織表面或內(nèi)部首先形成原胚團(tuán)（proembryogenic masses，PEMs），增殖后的PEMs 被轉(zhuǎn)移到無生長素的培養(yǎng)基上，PEMs 中的單個細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)可進(jìn)一步完成胚胎發(fā)育再生完整植株［44］。研究表明，體胚發(fā)生是胚胎調(diào)節(jié)基因通過調(diào)控生長素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實現(xiàn)的，內(nèi)源性生長素的生物合成是細(xì)胞獲得全能性的重要條件［45］。胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到無生長素的培養(yǎng)基后，依賴PIN1 介導(dǎo)的極性生長素運輸導(dǎo)致其表層細(xì)胞形成生長素最大值區(qū)域。同時，依賴YUC 的生長素從頭合成使內(nèi)源生長素水平逐漸增加［46］。生長素激活WUS表達(dá)，進(jìn)而激活胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)基因LEC1和LEC2［47-48］，這兩個基因與合子胚胎發(fā)生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子BBM 和AGL15（AGAMOUS-LIKE 15）相互作用，形成包括多個正反饋通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［49-51］。這些胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)基因促進(jìn)YCUs，TAA1和IAA30的表達(dá)，調(diào)節(jié)生長素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生［52-53］。

3 再生促進(jìn)基因提高植物遺傳轉(zhuǎn)化效率的研究進(jìn)展

生長素和CK 共同決定著植物組織和器官的再生方式和再生命運。添加外源生長素和CK 通過激活特定發(fā)育程序增強了體外再生反應(yīng)。參與植物生長素和CK 生物合成、響應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因?qū)儆谏L調(diào)節(jié)基因；控制細(xì)胞發(fā)育命運（全能性和多能性）的轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)儆诎l(fā)育調(diào)節(jié)基因，也叫作形態(tài)發(fā)生基因［8］。它們在植物器官發(fā)生和體胚發(fā)生過程中存在緊密的調(diào)控關(guān)系，在分子水平上共同影響遺傳轉(zhuǎn)化和體外再生，統(tǒng)稱為再生促進(jìn)基因（表1）。

表1 植物再生促進(jìn)基因在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用Table 1 Application of regeneration-promoting genes in the improvement of plant transformation system

WUS是SAM 中維持干細(xì)胞生態(tài)位最重要的發(fā)育調(diào)節(jié)基因，也是生長素和CK 調(diào)控植物細(xì)胞重獲多能性或全能性的關(guān)鍵基因。過表達(dá)WUS被用于促進(jìn)植物遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化細(xì)胞通過體胚發(fā)生［54-56］和器官發(fā)生方式再生［57-58］。由于生長素和CK 都能調(diào)節(jié)WUS表達(dá)，因此持續(xù)表達(dá)WUS的轉(zhuǎn)基因植株常具有異常表型。通過分別構(gòu)建ZmWUS2基因和選擇標(biāo)記基因的表達(dá)載體，再共同侵染玉米（Zea mays）未成熟胚的方法，可獲得僅表達(dá)選擇標(biāo)記基因而不含ZmWUS2的T0代正常轉(zhuǎn)基因玉米植株。該方法利用玉米磷脂轉(zhuǎn)移酶啟動子ZmPLTP 驅(qū)動ZmWUS2的表達(dá)，在WUS2T-DNA 不整合但選擇性標(biāo)記T-DNA 整合的細(xì)胞中，瞬時WUS2的表達(dá)刺激含有選擇性標(biāo)記的相鄰細(xì)胞以體胚發(fā)生方式再生。研究者將這種利用形態(tài)發(fā)生基因瞬時表達(dá)刺激含靶基因的細(xì)胞發(fā)生再生的方法叫作“利他轉(zhuǎn)化”［59］。

3.1 生長素相關(guān)的再生促進(jìn)基因

AP2/ERF（APETALA2/ETHYLENE RESPONSIVE ELEMENT BINDING FACTOR）轉(zhuǎn)錄因子家族基因BBM通過生長素信號途徑誘導(dǎo)植物胚胎發(fā)生和器官發(fā)生［60-61］。過表達(dá)BBM基因的歐洲油菜（Brassica napus）［60］、煙草（Nicotiana tabacum）［62］、可可（Theobroma cacao）［63-64］和辣椒（Capsicum annuum）［65］通過器官發(fā)生或體胚發(fā)生方式再生。但這些轉(zhuǎn)基因植株的營養(yǎng)器官和生殖器官會出現(xiàn)不同程度的多效型表型。LEC1 和LEC2 是位于BBM 調(diào)控體胚發(fā)生途徑下游的轉(zhuǎn)錄因子［49］，過表達(dá)歐洲云杉（Picea abies）的LEC1 型基因PaHAP3A促進(jìn)了其體胚分化［66］。LEC2 可直接激活A(yù)GL15的表達(dá)，過表達(dá)GmAGL15使大豆轉(zhuǎn)化效率提高了2倍但轉(zhuǎn)基因植物具有異常表型［67］。SAUR15（small auxin-upregulated RNA15）是胚性愈傷組織誘導(dǎo)中生長素誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子，敲除ZmSAUR15可通過提高玉米未成熟胚形成胚性愈傷組織的能力，將轉(zhuǎn)化效率提高5 倍［68］。

共表達(dá)BBM與WUS實現(xiàn)了許多組培執(zhí)拗型單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。Lowe 等［69］利用農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶啟動子（Nos：ZmWUS2）低水平表達(dá)WUS2，結(jié)合玉米泛素啟動子（ZmUbi：ZmBBM）高水平表達(dá)BBM成功獲得了玉米，高粱（Sorghum bicolor），甘蔗（Saccharum officinarum）和水稻（Oryza sativa）經(jīng)體胚發(fā)生途徑再生的轉(zhuǎn)基因植株。該方法使4 個執(zhí)拗型玉米自交系的轉(zhuǎn)化效率從0.0%～2.0%改變?yōu)?5.3%～51.7%，且效果顯著，并在33 個重要的商用‘先鋒’玉米自交系中成功實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。但BBM和WUS的持續(xù)表達(dá)會引起根的異常表型，且轉(zhuǎn)基因植株矮小而不育。Mookkan 等［70-71］設(shè)計了一種干旱誘導(dǎo)的CRE/lox 剪切策略，環(huán)化重組酶CRE（cyclization recombinase）識別loxP（locus of X-over P1）位點并表達(dá)，將轉(zhuǎn)化胚性愈傷組織中的Nos：ZmWUS2和ZmUbi：ZmBBM切除，獲得了可育的T0代轉(zhuǎn)基因植物。該方法在執(zhí)拗型玉米品種‘B73’和高粱‘P898012’上實現(xiàn)了有效轉(zhuǎn)化，但干燥誘導(dǎo)的剪切方法需要3 個月時間的愈傷組織誘導(dǎo)。為了縮短轉(zhuǎn)化時間，Lowe 等［72］嘗試使用不同的啟動子驅(qū)動BBM和ZmWUS2的表達(dá)，Nos：ZmWUS2和ZmPLTP：ZmBBM的組合使未成熟玉米胚在一周內(nèi)直接發(fā)生體胚，繞過愈傷組織形成階段發(fā)育，長成健康的可育植株；ZmAxig1：ZmWUS2和ZmPLTP：ZmBBM的組合在7 個受試玉米基因型中同樣可誘導(dǎo)以體胚直接發(fā)生方式再生轉(zhuǎn)基因植株。Aregawi 等［73］利用兩個農(nóng)桿菌菌株同時轉(zhuǎn)化高粱，一個菌株含有ZmPLTP：ZmWUS2和ZmPLTP：ZmBBM，另一個菌株含有選擇標(biāo)記基因，成功獲得了僅表達(dá)選擇標(biāo)記基因而不含ZmWUS2和ZmBBM的T0代正常轉(zhuǎn)基因植株，通過“利他轉(zhuǎn)化”方法將高粱的轉(zhuǎn)化時間縮短了近1/2，并使得之前幾個不能轉(zhuǎn)化的基因型成功得以轉(zhuǎn)化。最近，Wang 等［74］利用Nos：ZmWUS2和3xEnhZmUbi：ZmBBM的組合在禾本科4 個不同亞科的8 個物種中成功獲得了以葉片為外植體的胚性愈傷組織及再生植株，不僅顯著提高了玉米和高粱的轉(zhuǎn)化效率，而且獲得了它們的基因編輯植株。

3.2 細(xì)胞分裂素相關(guān)的再生促進(jìn)基因

KNOX（Knotted1-like homebox）同源域轉(zhuǎn)錄因子STM（SHOOTMERISTEMLESS）可激活CK 生物合成的重要限速酶異戊烯基轉(zhuǎn)移酶7（isopentenyl-transferase 7，IPT7）進(jìn)而促進(jìn)CK 水平增加［85-86］。過表達(dá)玉米STM的同源基因Knotted1（ZmKn1）使甜橙轉(zhuǎn)化效率顯著增加3～15 倍［75］。過表達(dá)ZmKn1不僅使煙草轉(zhuǎn)化效率增加3倍，而且轉(zhuǎn)基因植株在沒有抗生素和激素的培養(yǎng)基上通過器官發(fā)生途徑再生，但轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)多葉叢生的異常表型［76］。過表達(dá)CUC1和CUC2可通過激活STM 表達(dá)而促進(jìn)SAM 的形成，并使擬南芥轉(zhuǎn)化效率提高10 倍，但產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物表型異常［31］。雌二醇誘導(dǎo)ESR2過表達(dá)可通過直接調(diào)節(jié)CUC1轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化［34］。轉(zhuǎn)錄因子MP（MONOPTEROS）是生長素響應(yīng)基因和CK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及生物合成的調(diào)節(jié)基因［87］。當(dāng)MP的調(diào)控結(jié)構(gòu)域被移除時，可產(chǎn)生活躍表達(dá)且功能正常的MPΔ。過表達(dá)AtMPΔ通過上調(diào)AtWUS、AtSTM、AtESR1、AtCUC1和AtCUC2［77，87］并抑制A 型ARR5和ARR7的表達(dá)［88］提高具備異常表型的擬南芥轉(zhuǎn)化效率。與上述過表達(dá)STM、CUC1/2、ESR2和MP等導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物具備異常表型相比，植物生長調(diào)節(jié)因子基因GRF（GROWTH-REGULATING FACTOR）和它的輔助因子GRF-INTERACTING FACTOR（GIF）的持續(xù)共表達(dá)不會引起轉(zhuǎn)基因植物的表型異常［78-79］。受miR396 調(diào)控的GRF-FIF 二聚體通過招募SWITCH/SUCROSE NONFERMENTING（SWI/SNF）染色質(zhì)重塑復(fù)合物調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)，促進(jìn)植物以器官發(fā)生途徑再生［89-91］?！芤? 號’楊（Populus pseudo-simonii × Populus nigra‘Zheyin 3#’）的PpnGRF5-1 與PpnGIFs 形成的復(fù)合物，可通過抑制編碼細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶1（cytokinin oxidase/dehydrogenase 1）基因PpnCKX1促進(jìn)CK 積累和分生組織誘導(dǎo)［92］。Kong 等［78］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)擬南芥AtGRF5或其同源基因不僅可以提高執(zhí)拗型甜菜、歐洲油菜、大豆和向日葵的器官再生效率，也促進(jìn)了玉米通過體胚再生的效率，獲得的轉(zhuǎn)基因植物均具有正常表型。Debernardi等［79］證明過表達(dá)GRF4-GIF1嵌合基因顯著提高了小麥、水稻和檸檬等植物的轉(zhuǎn)化效率，實現(xiàn)了頑拗型商用小麥品種的轉(zhuǎn)化，并在不需要外源CK 的培養(yǎng)基上產(chǎn)生具有正常表型的可育小麥轉(zhuǎn)基因植株。該研究中，過表達(dá)GRF4-GIF1嵌合體使小麥轉(zhuǎn)化效率平均增加了7.8 倍，轉(zhuǎn)基因小麥可在無抗生素選擇標(biāo)記基因的培養(yǎng)基（含生長素）上進(jìn)行選擇，轉(zhuǎn)化周期從91 d 縮短到56 d。郭蘇平等［93］將森林草莓（Fragaria vesca）基因組中鑒定出的FveGRF5和FveGRF10基因分別與FveGIF1構(gòu)成GRF-GIF嵌合基因的過表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)2 對GRF-GIF嵌合基因均可提高森林草莓愈傷組織的芽再生率，其中，GRF5-GIF1的促進(jìn)效果更明顯，其芽再生率和遺傳轉(zhuǎn)化效率為對照的2.25 倍。

來自農(nóng)桿菌Ti-質(zhì)粒上的IPT催化CK 生物合成途徑中的第一個中間產(chǎn)物異戊烯腺苷單磷酸鹽（isopentenyladenosine-5’-monophosphate，isopentenyl-AMP）的形成［94-95］。過表達(dá)農(nóng)桿菌IPT可使CK 水平增加23～300 倍，但獲得的轉(zhuǎn)基因植物具有明顯的異常表型［80-81］。Ebinuma 等［82］開發(fā)了一種無須選擇標(biāo)記的煙草和雜交山楊轉(zhuǎn)化體系，獲得的半合子轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞可將含有35S：IPT表達(dá)盒的Ac 元件自動切除，最終產(chǎn)生0.5%～1.0%表型正常的轉(zhuǎn)基因植株。通過使用地塞米松誘導(dǎo)IPT的表達(dá)也獲得了不需要抗生素標(biāo)記的表型正常轉(zhuǎn)基因煙草和萵苣，并使轉(zhuǎn)化效率分別提高24.3 和6.6 倍［83］。ZmWUS2（Nos：ZmWUS2）的低表達(dá)結(jié)合農(nóng)桿菌IPT（ZmUbi：IPT）或ZmUbi：AtSTM的高表達(dá)促進(jìn)了擬南芥、本氏煙草（Nicotiana benthamiana）、番茄、馬鈴薯和葡萄等轉(zhuǎn)基因植株的器官發(fā)生。當(dāng)與Cas9/gRNA 質(zhì)粒一起使用時，這個方法產(chǎn)生了直接再生莖而無須組織培養(yǎng)的基因編輯幼苗，該方法為縮短植物育種周期提供了巨大潛力［84］。

4 總結(jié)與展望

基因組學(xué)、轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)的發(fā)展為植物基礎(chǔ)研究和作物品種改良提供了強大的平臺。相對于基因組學(xué)和基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)中再生體系的建立成為目前功能基因組學(xué)研究的瓶頸。近年來，隨著對植物體外再生機制研究的不斷深入，生長素和CK 誘導(dǎo)愈傷組織形成、增殖和再生的分子調(diào)控機理逐漸被探明。利用生長素和CK 生物合成、響應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的再生促進(jìn)基因，尤其是具有形態(tài)發(fā)生功能的發(fā)育調(diào)節(jié)基因，例如WUS和BBM，在促進(jìn)單子葉植物頑拗基因型的遺傳轉(zhuǎn)化效率和再生能力方面取得了突破性進(jìn)展。利用發(fā)育調(diào)節(jié)基因克服轉(zhuǎn)基因障礙的方法也叫形態(tài)發(fā)生基因輔助轉(zhuǎn)化方法（morphogene-assisted transformation，MAT）［73］。MAT 大大縮短了轉(zhuǎn)化時間，擴(kuò)大了可用于轉(zhuǎn)基因操作的基因型和外植體類型，產(chǎn)生了非常高的轉(zhuǎn)化率。但是，這些再生促進(jìn)基因的應(yīng)用往往會引起轉(zhuǎn)基因植物表型異常。為克服這個負(fù)面影響，研究人員通過改變啟動子類型調(diào)節(jié)再生促進(jìn)基因的表達(dá)水平，或者利用時空誘導(dǎo)性基因表達(dá)策略獲得不表達(dá)再生促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)基因后代，還開發(fā)出將形態(tài)發(fā)生基因和靶基因置于不同農(nóng)桿菌菌株再共同侵染的“利他轉(zhuǎn)化”方法。這些方法的應(yīng)用不僅獲得了正常的轉(zhuǎn)基因植株，而且產(chǎn)生了不需要激素、選擇標(biāo)記甚至組織培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化。最近的研究發(fā)現(xiàn)，GRF-GIF的持續(xù)表達(dá)能獲得再生效率高且表型正常的單子葉和雙子葉轉(zhuǎn)基因植株。需要注意的是，由于GRF-GIF 家族中有多個成員，并不是所有的GRFs 或GRF-GIF 配對在植物轉(zhuǎn)化中都同樣有效，因此，需要在目標(biāo)植物上開展鑒定具有高轉(zhuǎn)化效率的GRFs 或GRF-GIF 配對的研究。除本研究中介紹的再生促進(jìn)基因外，其他能促 進(jìn)SAM 形成，芽再生或體胚發(fā)生的基因，如PLTs（PLETHORAs），WINDs（WOUND-INDUCED DEDIFFERENTIATIONs），ARRs（ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORs）等在植物遺傳轉(zhuǎn)化和再生中的作用有待進(jìn)一步研究。

組織培養(yǎng)既是轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)的重要工具也是限制這些技術(shù)在植物上高效且廣泛應(yīng)用的主要原因。為了避免組培造成的不利影響，研究人員開發(fā)了一種在體細(xì)胞中傳遞和測試基因編輯試劑的方法，稱為Fast TrACC 方法（fast-treatedAgrobacteriumco-culture，快速處理農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)）。Fast TrACC 方法的原理是組合利用發(fā)育調(diào)節(jié)基因?qū)⒁逊只捏w細(xì)胞快速重新編程為多能干細(xì)胞，直接產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因或基因編輯的芽，獲得的基因編輯產(chǎn)物可穩(wěn)定傳遞給下一代［84］。在本氏煙草、番茄、馬鈴薯、辣椒、茄子（Solanum melogena）和歐洲油菜等多個茄科植物上已被用于快速測試啟動子活性和基因編輯試劑的有效性［96］。我國朱健康院士團(tuán)隊開發(fā)的CBD 遞送轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（cut-dip-budding，切-浸-萌芽）可實現(xiàn)多個植物無須組織培養(yǎng)的快速有效的遺傳轉(zhuǎn)化，其原理是利用發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogene）侵染植物根莖交界處的切口，上部分莖產(chǎn)生轉(zhuǎn)化根，再由轉(zhuǎn)化根產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植株，該技術(shù)可應(yīng)用于多個具有根蘗能力的植物，包括之前很難或不可能進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的草本植物橡膠草（Taraxacum koksaghyz）和繡球小冠花（Coronilla varia）、塊莖植物番薯（Ipomoea batatas）、木本植物臭椿（Ailanthus altissima）、楤木（Aralia elata）和重瓣臭茉莉（Clerodendrum chinense）等［2］。與Fast TrACC 方法相比，CBD 遞送系統(tǒng)同樣無須組織培養(yǎng)，也不需要無菌條件，僅通過對外植體的簡單浸泡就能進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化或基因編輯。Fast TrACC 方法中再生效率最高的發(fā)育基因組合是ZmWUS2與AtSTM或IPT，這些組合在茄科以外的植物尤其是單子葉植物上仍需開展試驗以驗證該方法的有效性。CBD 遞送轉(zhuǎn)化系統(tǒng)技術(shù)背后有關(guān)植物根蘗發(fā)生能力的分子機理有待進(jìn)一步研究，比如對根蘗發(fā)生調(diào)節(jié)基因的功能鑒定，以便使該系統(tǒng)在更多的植物品種和基因型上實現(xiàn)快速穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化。