低氮脅迫下不同皮燕麥品種早期的響應研究及耐低氮性綜合評價

羅穎，李聰，王沛，田莉華，汪輝，周青平，雷映霞

（西南民族大學四川若爾蓋高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學觀測研究站，四川 成都 610041）

氮素是植物生長、發(fā)育過程中各組織、器官中核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)等的主要組成元素，也是植物抵抗逆境時初級和次生代謝物合成的重要因子［1］。在自然界中，氮素存在的形式可分為有機氮和無機氮，而植物的氮素來源主要為無機氮，無機氮以硝態(tài)氮和銨態(tài)氮為主。有研究表明，硝態(tài)氮是土壤中氮素資源的主要形式，且可以被多數(shù)作物所吸收［2］。當作物吸收硝態(tài)氮之后會通過一系列氮代謝途徑將其轉化為自身可利用的氮素形式，并參與到作物體內(nèi)基本的生理代謝，如氮素同化、蛋白質(zhì)合成等重要過程，而這一系列氮代謝過程會對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)起決定性作用［3］。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，為使作物增產(chǎn)，我國大量施用化肥，使化肥的需求量出現(xiàn)大幅增長，1980 至2014 年間，就從1269.4 萬t 上升到了5995.9 萬t，增長了3.7 倍，年均增長高達4.67%，我國也成為世界上最大的化肥使用國［4-5］。然而，在自然條件下，氮肥的利用率非常低，據(jù)統(tǒng)計，我國氮肥利用率約為35%，低于世界40%～60%的水平［6］。由此，相當一部分未被利用的氮肥一方面會通過淋溶、揮發(fā)釋放到大氣中導致大氣污染，另一方面，在土壤及水域中殘存的氮素，則會引起土壤酸化和水體富營養(yǎng)化，對土壤環(huán)境造成破壞。同時，過量施用氮肥也大大增加了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的成本支出［7］。因此，提高作物的氮利用效率，降低氮肥的使用量，減少環(huán)境污染成了亟待解決的問題。對此，我國在2015 年提出了化肥“零增長”行動，并在“十三五”規(guī)劃中提出了“藥肥雙減”的政策。因此，為響應國家政策，選育耐低氮作物，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的氮肥投入就顯得尤為重要，迫在眉睫［8］。

燕麥（Avena sativa）是禾本科（Gramineae）燕麥屬（Avena）一年生草本植物，在世界禾本科作物生產(chǎn)中排名第四位，僅次于小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）［9］。根據(jù)外稃特征，燕麥可以分為皮燕麥和裸燕麥（Avena nuda）。皮燕麥其籽粒被一層堅硬的外稃所包被，即使成熟時也不易脫落，是世界主栽類型［10］。皮燕麥起源于地中海沿岸，主要分布在以俄羅斯、芬蘭等為中心的歐洲國家和北美國家這兩大板塊［11-12］。我國種植的皮燕麥大多是從其他國家引進，主要種植于我國西北、西南、東北以及青藏高原等地［13］。皮燕麥主要作為飼草作物種植，其鮮草的適口性好、營養(yǎng)價值高，可直接飼喂牛、羊。同時，皮燕麥加工調(diào)制的青干草和青貯飼料，含有較多的粗蛋白、粗脂肪，較低的纖維，是農(nóng)牧區(qū)主要的牧草品種。不僅如此，皮燕麥籽粒蛋白含量高，具有豐富的膳食纖維，能加速人體新陳代謝，可作為粗糧或保健食品［14］。除此之外，皮燕麥具有耐寒抗旱、耐貧瘠、耐適度鹽堿等特點。因此，在實際生產(chǎn)應用中，皮燕麥無論以飼草或者作為收獲籽粒為種植目標，都是農(nóng)牧區(qū)首選的優(yōu)良種質(zhì)資源［15］。

然而，目前對燕麥抗逆方面的研究，主要集中于鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫以及重金屬脅迫等，對于皮燕麥在低氮脅迫下的研究較少［16-19］。為此，本試驗采用水培方式對18 份皮燕麥品種進行研究，對皮燕麥在低氮環(huán)境中的形態(tài)及生理變化進行探討，為高原地區(qū)篩選出耐低氮燕麥品種，以期減少氮肥的使用量，降低環(huán)境污染，建立可持續(xù)發(fā)展農(nóng)牧業(yè)模式。同時，探討低氮環(huán)境下燕麥的生理響應機制，為后期燕麥耐低氮性的機制研究提供理論依據(jù)，也為選育耐低氮的牧草種質(zhì)提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用18 份不同皮燕麥品種為試驗材料，如表1 所示。

1.2 試驗方法

試驗采用水培法［20］，于2021 年12 月在西南民族大學青藏高原研究院實驗室進行。育苗階段選取籽粒飽滿、健康的種子，用0.1%的次氯酸鈉消毒5 min 后，用蒸餾水沖洗3 次，后采用紙上發(fā)芽法。當幼苗萌發(fā)長至三葉期時，選取長勢一致的幼苗定植于水培箱中（70 cm×70 cm×35 cm），并設全氮和低氮2 個氮濃度處理。每份燕麥品種分別在2 個氮濃度處理中各定植3 孔，每孔定植10 株，設3 組生物學重復，此為第1 組試驗材料，用于測定形態(tài)、生物量以及部分光合等指標。第1 組試驗材料種下的2 d 后，種植第2 組試驗材料，18 份燕麥品種同樣在2 個氮濃度處理中各定植3 孔，每孔定植10 株，用于后續(xù)光合指標的測定和展開生理指標的取樣工作。

使用霍格蘭營養(yǎng)液（海博生物技術有限公司）水培，其中含有的NO3-濃度分別是全氮（4 mmol·L-1，CK），低氮（0.4 mmol·L-1，LN）。本試驗用Ca（NO3）2·4H2O 作為氮補充來源，在低氮處理中，用CaCl2補充缺失的Ca2+，每7 d 更換一次營養(yǎng)液，增氧泵通氣。在22 ℃，相對濕度65%，光照16 h/黑暗8 h 的溫室中脅迫處理21 d 后進行各指標的測定。

每組試驗材料脅迫21 d 后，剪取燕麥新鮮葉片0.1 g，每0.1 g 為一次生物學重復，每個處理取3 次生物學重復。葉片用錫紙包裹放入液氮中進行冷凍，后轉移至-80 ℃超低溫冰箱中保存。保存的樣品用于硝態(tài)氮（NO3--N）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）、谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等指標的測定，硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）使用新鮮葉片測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀指標 將燕麥從水培箱中完整取出，取3 株單株，設3 個生物學重復。用卷尺測量其株高（plant height，PH）、根長（root length，RL），隨后從莖基部剪開，再進行地上部分鮮重（shoot fresh weight，SFW）和地下部分鮮重（root fresh weight，RFW）測定，而后將植株鮮樣放入105 ℃的烘箱中殺青0.5 h，再在65 ℃的環(huán)境中烘干至恒重。取出測定地上部分干重（shoot dry weight，SDW）和地下部分干重（root dry weight，RDW），并計算根冠比（root-shoot ratio，RSR）（根冠比=地下部分干重/地上部分干重）。

1.3.2 生理指標 在光合有效輻射為1200 μmol·m-2·s-1，大氣CO2濃度為400 μmol·m-1，葉片溫度為22 ℃的條件下，于上午9：00～12：00，下午14：00～17：00 用美國 LI-COR 公司生產(chǎn)的Li-6800 光合作用全自動測量系統(tǒng)測定葉片中部的光合指標，包括凈光合速率（photosynthesis rate，Pn）、蒸騰速率（transpiration rate，Tr）、胞間CO2濃度（internal CO2concentration，Ci）、氣孔導度（stomatal conductance，Gs）的測定。

氮代謝相關酶活性測定：硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（GDH）均參照微量法試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）測定，待各指標樣品處理后，NR、GOGAT、GDH 在340 nm 波長下進行吸光度讀值，GS 在540 nm 下進行吸光度讀值。

活性氧（ROS）含量測定：超氧陰離子（O2·-）含量和過氧化氫（H2O2）含量的測定均參照微量法試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司），超氧陰離子含量吸取處理液后上清液于530 nm 處測定吸光度值。H2O2含量在415 nm 處測定吸光度值并進行計算。

以下指標測定參考張志良等［21］的試驗方法。硝態(tài)氮（NO3--N）含量測定采用水楊酸比色法；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定；可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量采用考馬斯亮藍法測定；可溶性糖（soluble sugar，SS）含量采用蒽酮比色法測定。

1.4 耐低氮性綜合評價

首先對低氮脅迫下皮燕麥的21 項指標的耐低氮系數(shù)進行相關性分析，比較各指標間的相關性。而后將18 份燕麥材料的21 個指標進行主成分降維分析并提取出耐低氮綜合因子，最后采用隸屬函數(shù)法和系統(tǒng)聚類法進行耐低氮性綜合評價。

1.4.1 各材料綜合指標耐低氮系數(shù) 耐低氮系數(shù)=低氮脅迫下指標的均值/對照指標的均值。

1.4.2 各材料綜合指標隸屬函數(shù)值

式中：Xj表示第j個綜合指標；Xmin表示第j個綜合指標最小值；Xmax表示第j個綜合指標最大值。

1.4.3 各材料綜合指標權重

式中：Wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度即權重；Pj為各基因型第j個綜合指標貢獻率。

1.4.4 各材料耐低氮性綜合評價

式中：D值為各基因型在低氮脅迫條件下由綜合指標評價所得的耐低氮性綜合評價值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 對數(shù)據(jù)進行整理，運用SPSS 完成試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，各指標數(shù)據(jù)進行T-test 檢驗，而后計算出耐低氮系數(shù)并進行Pearson 相關性分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）、隸屬函數(shù)分析，使用Origin 進行各指標相關性熱力圖、聚類熱力圖的繪制，其中聚類熱力圖是基于最長距離和歐式平方距離法進行的層次聚類。

2 結果與分析

2.1 低氮脅迫下皮燕麥農(nóng)藝性狀的變化

低氮脅迫下，各品種的株高均呈下降趨勢，其中甜燕2 號下降的最多（27.36%），其次是槍手（21.19%），并且甜燕2 號和槍手在低氮脅迫下的株高與全氮處理下的株高均呈顯著性差異（P<0.05），下降最少的是太陽神（0.42%），差異性不顯著（P>0.05）。18 個品種中，邊鋒、莫妮卡、甜燕70、青海444、青海甜燕麥的根長有不同程度的上升，其中青海444 上升最多（43.94%），青海甜燕麥上升了42.32%；其余13 份品種的根長均呈下降趨勢，甜燕2 號下降最多（55.93%），青燕2 號下降了54.78%。根冠比中，除青引1 號、槍手、燕王、青燕2 號、青燕1 號這5 個品種外，其余品種的根冠比均上升，青海444 的根冠比上升的最多，上升了1.5 倍，其次領袖上升了85.71%，槍手的降幅最大（36.36%），其次是青燕2 號（33.33%）。另外，植物的干物質(zhì)量可反映植物的氮利用效率，在低氮脅迫下，皮燕麥的地上部分鮮重、干重均下降，地下部鮮、干重變化趨勢不一致，邊鋒、青海444、魅力、領袖、青海甜燕麥、牧王的地下部生物量均上升，其余品種的地下部生物量均受到抑制（表2）。

表2 低氮脅迫下各皮燕麥品種的生長變化Table 2 Effects of low nitrogen stress on the growth of different oat cultivars

2.2 低氮脅迫下皮燕麥光合作用的變化

所有供試皮燕麥的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導度（Gs）在低氮脅迫下均呈下降趨勢（表3）。其中牧王的Pn下降幅度最大（64.52%），并且牧王在低氮脅迫下的Pn與全氮處理下的Pn呈顯著性差異（P<0.05），青燕1 號的Pn下降的最少（3.32%），其試驗前后的Pn差異性不顯著（P>0.05）；牧王的Tr降幅同樣最大（77.61%），美達的降幅最小（17.14%）；供試皮燕麥的Ci降幅不明顯，下降最多的是青燕1 號（18.27%）；莫妮卡的Gs降幅最大（76.47%），其次是牧王（75.00%），燕王下降的最少（7.69%）。

2.3 低氮脅迫下皮燕麥硝態(tài)氮的變化

低氮脅迫下，不同皮燕麥品種的硝態(tài)氮含量均處于下降狀態(tài)，下降幅度不盡相同，對照組和處理組變化呈極顯著差異（P<0.01）（圖1）。其中下降較多的3 個品種為青引1 號（76.12%）、駿馬（74.24%）、青海444（71.41%）。魅力下降的最少（19.12%），蒙燕1 號下降了32.84%，其他品種的變化趨于一致。且對照組中青燕1號的硝態(tài)氮含量最多，青燕2 號的硝態(tài)氮含量最少，低氮處理后除蒙燕1 號、槍手、魅力的硝態(tài)氮含量稍高，其余品種的硝態(tài)氮含量基本在同一水平。

圖1 不同皮燕麥品種的硝態(tài)氮含量在低氮脅迫下的變化Fig.1 Changes of nitrate nitrogen content in different oat cultivars under low-nitrogen stress

2.4 低氮脅迫下皮燕麥氮代謝相關酶的變化

在低氮脅迫下，供試皮燕麥品種的硝酸還原酶（NR）活性呈不同程度的下降趨勢，且差異顯著（P<0.05）（圖2）。其中太陽神的NR 活性下降的最多（63.46%），蒙燕1 號下降了59.73%。青燕2 號下降的最少（16.48%），其次是青引1 號下降了16.65%。對照組的18 份皮燕麥中，牧王、駿馬自身的NR 活性高于其他皮燕麥品種；且在低氮處理后，牧王和駿馬的NR 活性在所試皮燕麥品種中依然能維持較高水平。

圖2 不同皮燕麥品種的硝酸還原酶活性在低氮脅迫下的變化Fig.2 Changes of nitrate reductase activity of different oat cultivars under low-nitrogen stress

低氮處理下，除燕王的谷氨酰胺合成酶（GS）活性有所上升外，其余皮燕麥的GS 活性均有不同程度的下降；駿馬下降的最多（92.72%），青海444 下降的最少（3.47%），美達也僅下降了8.48%（圖3）。說明青海444 和美達在低氮脅迫下同化氨的能力下降的最少。

圖3 不同皮燕麥品種的谷氨酰胺合成酶活性在低氮脅迫下的變化Fig.3 Changes of glutamine synthetase activity of different oat cultivars under low-nitrogen stress

低氮脅迫處理組谷氨酸合成酶（GOGAT）活性與對照組相比均有不同程度的升高，呈顯著性差異（P<0.05）。低氮處理后青燕1 號的GOGAT 活性上升得最多，上升了3.6 倍，其次是青引1 號，上升了約2 倍，青燕2號、駿馬、甜燕70、領袖、牧王均上升了自身的一倍多。太陽神上升得最少（24.20%），甜燕2 號上升了25.23%，其余品種的變化趨于一致（圖4）。

圖4 不同皮燕麥品種的谷氨酸合成酶活性在低氮脅迫下的變化Fig.4 Changes of glutamate synthase activity of different oat cultivars under low-nitrogen stress

谷氨酸脫氫酶（GDH）在低氮脅迫下呈下降趨勢，下降幅度較大的3 個品種為駿馬>青海甜燕麥>莫妮卡（76.80%>72.04%>54.58%），下降幅度最小的是燕王（5.29%），其次是美達（5.58%）（圖5）。通過對照組與試驗組的對比可以發(fā)現(xiàn)，燕王在未受到脅迫時，其自身的GDH 活性就相對較高，低氮脅迫后，燕王的GDH 活性為低氮組中最高的。

圖5 不同皮燕麥品種的谷氨酸脫氫酶活性在低氮脅迫下的變化Fig.5 Changes of glutamate dehydrogenase activity of different oat cultivars under low-nitrogen stress

2.5 低氮脅迫下皮燕麥活性氧、丙二醛的變化

在低氮脅迫下，所有試驗品種的超氧陰離子（O2·-）含量均呈上升趨勢，其中甜燕70 的上升幅度最大（120.98%），其次是青海甜燕麥（89.87%），青引1 號（88.30%），青燕1 號變化最小（2.34%）。試驗品種的過氧化氫（H2O2）含量變化整體呈上升趨勢，且差異顯著（P<0.05），上升幅度最為明顯的是青海甜燕麥（140.12%），美達上升了100%，蒙燕1 號和青引1 號變化不明顯，分別上升了4.79%、4.94%（圖6）。

圖6 不同皮燕麥品種的活性氧含量在低氮脅迫下的變化Fig.6 Changes of active oxygen content of different oat cultivars under low-nitrogen stress

所有試驗品種的丙二醛（MDA）含量在低氮脅迫下也均有不同程度地升高（圖7），上升幅度最大的是青燕2號（64.62%），其次是魅力（60.65%）和甜燕2 號（51.84%），青海444 上升的最少（1.69%）。

圖7 不同皮燕麥品種的丙二醛含量在低氮脅迫下的變化Fig.7 Changes of MDA content of different oat cultivars under low-nitrogen stress

2.6 低氮脅迫下皮燕麥滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

低氮脅迫下，試驗品種的可溶性蛋白（SP）含量均下降。甜燕2 號的下降幅度最大（70.78%），青燕1 號下降了62.44%，美達下降了59.78%，駿馬下降的最少（1.69%），青引1 號下降了6.59%。與此同時，可溶性糖（SS）含量也呈下降趨勢。邊鋒下降了59.07%，駿馬和青燕2 號分別下降了54.25%、51.68%，二者的降幅較一致；槍手變化最?。?.17%），青海甜燕麥下降6.98%，其余品種的降幅趨于一致（圖8）。

圖8 不同皮燕麥品種的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在低氮脅迫下的變化Fig.8 Changes of osmotic adjustment substances of different oat cultivars under low nitrogen stress

2.7 各指標耐低氮系數(shù)相關性分析

對植物在逆境脅迫下的耐性評價，通常采用耐性系數(shù)，耐性系數(shù)越高代表植物耐受能力就越強，反之就越弱。本試驗中皮燕麥各形態(tài)、生理指標變化趨勢不盡相同，為避免皮燕麥自身的固有差異，運用1.4.1 中的公式計算了能準確反映皮燕麥各指標變化的耐低氮系數(shù)（表4）。所試皮燕麥的株高、地上部鮮重、凈光合速率、蒸騰速率、胞間CO2濃度、氣孔導度、硝態(tài)氮含量、硝酸還原酶活性、谷氨酸脫氫酶活性、可溶性蛋白、可溶性糖含量的耐低氮系數(shù)均小于1，超氧陰離子、過氧化氫、丙二醛等指標的耐低氮系數(shù)均大于1?；谝陨希瑢?8 份試驗材料的7 項形態(tài)指標和14 項生理指標進行相關性分析（圖9），結果表明有16 對指標間存在相關性，其中12 對指標呈極顯著相關（P<0.01）。地下部干重（RDW）與地下部鮮重（RFW）、地上部鮮重（SFW）、根冠比（RSR）、根長（RL）均呈極顯著正相關（P<0.01），其中根冠比（RSR）與地下部干重（RDW）的相關系數(shù)最高，為0.89，地上部鮮重（SFW）與可溶性蛋白（SP）、谷氨酸合成酶（GOGAT）與胞間CO2濃度（Ci）、谷氨酰胺合成酶（GS）與可溶性蛋白（SP）均呈極顯著負相關（P<0.01），其中GS 與SP 的相關系數(shù)最低，為-0.63。

表4 18 份皮燕麥材料各綜合指標耐低氮系數(shù)Table 4 The comprehensive index of 18 oat cultivars is resistant to low nitrogen coefficient

圖9 18 份皮燕麥材料低氮脅迫下各指標耐低氮系數(shù)相關性分析Fig.9 Correlation analysis of low-nitrogen tolerance coefficient of each index under low nitrogen stress of 18 oat cultivars

2.8 皮燕麥各指標主成分分析

從相關性分析可以看出，雖然所測指標間存在一定聯(lián)系但相關程度不一致，且大量信息重疊，影響耐低氮性評價效果。因此采用主成分降維的方法對18 份皮燕麥材料的21 項指標進行主成分分析。將累計方差貢獻率大于80%且特征值≥1 作為判別條件，可提取7 項主成分因子（表5）。主成分1（PC1）的特征值為4.658，貢獻率為22.181%；主成分2（PC2）的特征值為2.702，貢獻率為12.869%；主成分3（PC3）的特征值為2.559，貢獻率為12.187%；主成分4（PC4）的特征值為2.291，貢獻率為10.907%；主成分5（PC5）的特征值為2.049，貢獻率為9.755%；主成分6（PC6）的特征值為1.561，貢獻率為7.433%；主成分7（PC7）的特征值為1.180，貢獻率為5.620%。前7 個主成分累計貢獻率達80.952%，具有較好的代表性，與燕麥苗期耐低氮性具有直接聯(lián)系，可作為評價燕麥苗期耐低氮性的綜合指標。

表5 各綜合指標系數(shù)及貢獻率Table 5 Coefficients and proportion rates of various comprehensive indicators

第1 主成分中貢獻率較大的是地下部干重（RDW）和地上部分生物量，主要反映了低氮脅迫后燕麥的生物量變化，在低氮脅迫下維持較高的生物量水平能反映出品種的耐低氮性；第2 主成分中谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）的貢獻率較高，GS 和GDH 活性反映了植物的氮代謝效率，低氮脅迫下燕麥幼苗的氮代謝能力越強，其耐低氮性也越強；第3 主成分中貢獻率較大的是氣孔導度（Gs）和蒸騰速率（Tr），在低氮脅迫下維持較高的光合水平也能反映品種的耐低氮性；第4 主成分中過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2·-）的貢獻率較大，反映了燕麥的抗氧化能力，低氮環(huán)境下植物細胞內(nèi)活性氧含量越低，表明其抗氧化能力越強，耐低氮性也就越強；第5 主成分中可溶性蛋白（SP）和地下部鮮重（RFW）的貢獻率較大，反映了滲透調(diào)節(jié)能力以及積累有機物的能力，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可表明細胞受到脅迫后的調(diào)節(jié)能力，滲透調(diào)節(jié)能力越強，其耐低氮性越強；第6 主成分中硝酸還原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）的貢獻率較大，與第2 主成分反映的能力一致；第7 主成分中谷氨酸脫氫酶（GDH）和株高（PH）的貢獻率較大，與第1、2 主成分反映的能力一致。綜合7 個主成分分析結果，燕麥的生物量、氮代謝效率因子、光合因子、抗氧化能力因子、滲透調(diào)節(jié)因子可作為燕麥苗期耐低氮性評價的綜合指標。

2.9 隸屬函數(shù)分析及綜合評價

采用隸屬函數(shù)法對各指標進行綜合評價，根據(jù)1.4.2 中的公式（1）計算出18 份材料分別在7 個主成分下的隸屬函數(shù)值（表6）。對于綜合指標主成分1 而言，青海444 的隸屬函數(shù)值最大，為U（X1）=1.000，而青燕2 號的隸屬函數(shù)值最小，為U（X1）=0.000；說明在主成分1 下，青海444 的耐低氮性最強，而青燕2 號的耐低氮性最弱。進一步結合7 個主成分的貢獻率，根據(jù)1.4.3 中的公式（2）計算出7 個主成分的權重，分別為0.274、0.159、0.151、0.135、0.121、0.092、0.069。最后利用公式（3）計算出18 份材料耐低氮性的綜合評價值（D）。從表6 可知，18 份燕麥材料耐低氮性按D值由大到小排序為：甜燕70>青海甜燕麥>青海444>美達>燕王>青引1 號>魅力>青燕1 號>蒙燕1 號>領袖>牧王>邊鋒>槍手>莫妮卡>太陽神>青燕2 號>甜燕2 號>駿馬。

表6 18 份皮燕麥材料各綜合指標值、權重、隸屬函數(shù)值、D 值及綜合評價Table 6 The comprehensive indicator values，index weight，membership function value，D values and comprehensive evaluation of 18 oat cultivars

2.10 耐低氮性聚類分析

對不同耐低氮性指標進行R 型聚類分析，結果顯示21 個耐低氮性指標可分為3 類，第一類包含了株高（PH）、根長（RL）、根冠比（RSR）、地下部干重（RDW）、地下部鮮重（RFW）、胞間CO2濃度（C）i等指標，主要以地下部相關指標為主，可歸納為根系因子；第二類包含地上部鮮重（SFW）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）、硝態(tài)氮（NO3--N）、硝酸還原酶（NR）、谷氨酸脫氫酶（GDH）、凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）等指標，可歸納為氮代謝效率因子、滲透調(diào)節(jié)因子以及光合因子，并且這一類因子總體水平較低；第三類包含谷氨酸合成酶（GOGAT）、超氧陰離子（O2·-）、過氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）等指標，可歸納為抗氧化能力因子（圖10）。對18 份材料進行Q 型聚類分析，結果顯示，這些材料可分為兩類（Ⅰ和Ⅱ），第Ⅰ類包括青海甜燕麥、美達、青海444、牧王、領袖、邊鋒；第Ⅱ類材料又可分為兩個亞組：Ⅱ-a（魅力、太陽神、莫妮卡、甜燕2 號、青燕2 號、槍手）和Ⅱ-b（燕王、青燕1 號、青引1 號、駿馬、甜燕70、蒙燕1 號）。第Ⅰ類皮燕麥品種中的MDA 這一指標相較于第Ⅱ類皮燕麥品種偏低，說明第Ⅰ類皮燕麥品種受到的氧化損傷較輕，其抗低氮能力更強，且第Ⅰ類品種的地下部生物量較高，說明此類材料對低氮脅迫的耐受性較高，可將這6 份皮燕麥品種劃分為耐低氮型品種。Ⅱ-a 組品種的MDA含量較高，GOGAT 活性較低，說明Ⅱ-a 中品種的抗氧化能力和氮代謝能力都相對較低，可將Ⅱ-a 的品種劃分為氮敏感品種；Ⅱ-b 中MDA 含量屬于中等，表明此類材料受到的氧化脅迫程度為中度，因此可劃分為中等耐低氮性品種。

3 討論

3.1 低氮脅迫下皮燕麥農(nóng)藝性狀的變化

植物的形態(tài)特征和干物質(zhì)變化是植物對營養(yǎng)脅迫反應最直觀的指標，植物缺氮時，地上部干物質(zhì)重量通常會呈現(xiàn)下降趨勢，而適當?shù)牡偷{迫會促進根的生長發(fā)育，呈現(xiàn)根冠比和根干重上升的趨勢［22］。姜琳琳等［23］研究表明較低的氮濃度一定程度上對玉米的根系生長有促進作用，而氮濃度的進一步上升，會抑制根系的生長；陳瑩等［24］也發(fā)現(xiàn)低氮脅迫下苗期高羊茅（Festuca arundinacea）的株高、地上部生物量顯著降低。在本試驗中，所試品種的株高、地上部生物量均下降，與前人研究一致；而根長和地下部生物量整體呈下降趨勢，根冠比整體呈上升趨勢，但也有少數(shù)品種的根長和地上部生物量呈上升趨勢。造成這一現(xiàn)象的原因可能是皮燕麥為維持自身生長，增加吸收氮的面積，從而刺激根生長。低氮脅迫會影響植物地上部分和地下部分的生長情況，但是具體的變化跟植物種類和耐低氮性有關。

3.2 低氮脅迫下皮燕麥的光合變化

通過對前人的研究總結發(fā)現(xiàn)，評價光合性能機制一般是從氣孔因素和非氣孔因素兩方面來進行［25］，限制光合作用的氣孔因素主要包括氣孔數(shù)量和氣孔導度，非氣孔因素包括PEP 羧化酶或Rubisco 的羧化能力、電子傳遞能力和葉綠素含量等［26］。當氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和凈光合速率（Pn）都呈下降趨勢時，可認為是氣孔因素導致了Pn的下降；當Pn和Gs減小，而Ci增加時，則將Pn下降的原因歸結為非氣孔因素［27-28］。在本試驗中，燕麥的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導度（Gs）均呈下降趨勢（表3），但Ci下降趨勢不明顯，這一結果與李從鋒等［29］對玉米在低氮環(huán)境下的研究結果一致。因此推測早期皮燕麥在低氮脅迫下Pn下降可能是由于氣孔閉合導致的。

3.3 低氮脅迫下皮燕麥的氮代謝響應

目前的農(nóng)業(yè)模式中，作為植物氮肥來源的主要是硝酸鹽中的硝酸根（NO3-），因此對植物體內(nèi)的硝態(tài)氮含量的測定，可以直觀地看到周圍環(huán)境的氮水平變化及植物自身吸收氮的效率［2，30］。前人研究表明，在低氮環(huán)境中的植物，當可吸收的外界氮素減少時，其體內(nèi)的硝態(tài)氮含量也會隨外界氮素濃度的下降而降低［31］。在本試驗中發(fā)現(xiàn)低氮環(huán)境下，所有品種吸收的硝態(tài)氮都有不同程度的減少（圖1）；這與劉源［32］在大豆（Glycine max）的低氮脅迫研究中結果一致；范蓮雪等［31］在關于黃瓜（Cucumis sativus）的低氮試驗中也得出相似的結果，黃瓜的地上、地下部分硝態(tài)氮含量都低于正常氮處理。青引1 號的硝態(tài)氮含量降幅度最大，說明在供試的燕麥品種中，青引1 號的氮吸收能力最弱。

植物從土壤中吸收的NO3-無法直接利用，需要經(jīng)過一系列氮代謝反應將NO3-還原、NH4+同化，以便生成含氮有機物來維持植物生長發(fā)育，這也就涉及各種氮代謝相關酶［33］。氮代謝相關酶活性展現(xiàn)了植物的氮代謝能力，硝酸還原酶（NR）作為植物進行氮代謝的第一限速酶，是研究低氮脅迫的關鍵指標，其主要作用是將植物吸收的NO3-還原成NH4+［34］。谷氨酰胺合成酶（GS）是植物同化氨的關鍵酶之一，相關研究表明，低氮環(huán)境下，GS 活性與氮效率呈正相關，GS 高表達能增加植物的氮代謝效率［35］。植物的氮代謝過程中，GS/GOGAT 途徑是十分關鍵的一步，是氮代謝過程的重要樞紐，被NR 還原后的NH4+在GS 的催化作用下生成谷氨酰胺（glutamine，Gln），并在GOGAT 的作用下再次轉化為谷氨酸（glutamic acid，Glu）［36-37］。GDH 對作物的氮利用率同樣有重要的調(diào)控作用，有研究報道，當NH4+濃度增加時，會引起植物體內(nèi)GDH 的活性升高，從而催化谷氨酸（Glu）的合成，來抵抗NH4+中毒［36］；同時，GDH 活性升高還會促使脯氨酸的含量增加，增強植物的抗逆性［38-39］。在本試驗中，所有皮燕麥品種的NR、GS、GDH 活性均表現(xiàn)為下降趨勢，這與謝孟林等［40］在低氮脅迫下玉米苗期氮代謝相關酶活性的研究結果一致；并且駿馬、邊鋒的GS 活性下降得十分明顯，說明這兩個品種在低氮的環(huán)境下，其氨轉化能力最容易受到影響。另外本試驗中GOGAT 呈上升趨勢，也可能是因為皮燕麥GOGAT 的高表達將谷氨酰胺（Gln）轉化成了谷氨酸（Glu），消耗了大量NH4+，維持了自身生長需求，從而使皮燕麥植株體內(nèi)的NH4+沒有堆積對自身造成毒害，也因此沒有高濃度的NH4+來刺激GDH 活性升高。這可能就是皮燕麥在低氮脅迫下相關氮代謝酶的動態(tài)變化理論。

3.4 低氮脅迫下皮燕麥的抗氧化能力

當植物處于逆境環(huán)境中時，植物細胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和清除動態(tài)平衡就會被打破，從而導致ROS 含量增加［41］。ROS 又主要包括超氧陰離子（O2·-）和過氧化氫（H2O2）等，過多的ROS 會使細胞膜的膜脂系統(tǒng)受到損傷［42］。與此同時，植物在受到脅迫后細胞膜脂過氧化會明顯加劇，丙二醛（MDA）作為膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，對植物的蛋白質(zhì)、核酸和酶都有很強的破壞性，因此MDA 含量高低能反映植物受傷害程度的大?。?3］。本試驗發(fā)現(xiàn)，低氮處理下，所試皮燕麥材料的ROS 均大量累積（圖6），不同品種的累積情況不同，這與王峰［34］在低氮脅迫下不同耐低氮性作物的ROS 變化研究結果一致。并且在低氮脅迫下，所有皮燕麥的 ROS 含量上升的同時，皮燕麥MDA 含量較正常氮情況下均上升（圖7），這與葉宇波等［44］對杉木（Cunninghamia lanceolata）幼苗在低氮脅迫下的MDA 變化趨勢一致。本試驗中的ROS 與MDA 含量的顯著上升結果表明，低氮脅迫會對皮燕麥的膜脂系統(tǒng)造成損傷，導致皮燕麥體內(nèi)的自由基變多，從而使皮燕麥受到氧化損傷；另外皮燕麥在低氮脅迫下的氧化反應，也表明皮燕麥的抗氧化能力變?nèi)?，這可能與抗氧化酶活性有關。

3.5 低氮脅迫下皮燕麥的滲透調(diào)節(jié)能力

相關研究表明，當植物受到逆境脅迫時，會通過調(diào)節(jié)自身一系列生理生化反應來適應逆境，其中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量可作為評價植物的抗性指標之一，可溶性糖（SSC）和可溶性蛋白（SP）等有機物質(zhì)含量的增加，可以維持植物葉片的水分吸收能力并延緩葉片的衰老［45］。而低氮脅迫中，因外界氮素的缺失，從而導致自身吸收合成的氮化物過少，可合成的蛋白質(zhì)減少，氮素的缺失會使植物自身的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)生改變［34］。陳瑩等［24］在高羊茅的相關研究中發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫使高羊茅的SP 顯著下降，指出SP 的合成受到了低氮脅迫的影響；李強等［46］在玉米苗研究中發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫下的SP 呈下降趨勢，且耐低氮型玉米的下降幅度要小于氮敏感型玉米，同時指出耐低氮品種在低氮脅迫下更能維持自身的滲透調(diào)節(jié)能力；張楚等［47］在對苦蕎（Fagopyrum tataricum）的低氮脅迫中同樣發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫下苦蕎的SP 顯著下降；以及王寧等［48］在對玉米的低氮脅迫研究中發(fā)現(xiàn)SSC 含量下降，并且發(fā)現(xiàn)SSC 降低的幅度與生物量降低幅度一致。在本研究中發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫會造成皮燕麥SSC、SP 含量顯著降低（P<0.05），基于以上，可以看出低氮環(huán)境會導致皮燕麥自身合成的氮化物減少，從而影響皮燕麥SSC 和SP 的合成，降低皮燕麥自身水分吸收能力與滲透調(diào)節(jié)能力，誘導早期皮燕麥葉片衰老。并且，耐低氮品種（青引1 號）的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的降幅小于氮敏感品種（駿馬、邊鋒、太陽神），因此可以認為，耐低氮型皮燕麥可以保持相對較高的滲透調(diào)節(jié)能力從而增強自身的抗逆性，其延緩葉片衰老的能力也更強，這可能就是皮燕麥耐低氮脅迫的重要生理機制之一。

3.6 耐低氮品種篩選

氮脅迫是影響作物產(chǎn)量的重要因素之一，且不同品種對氮脅迫也會有不同程度的響應，而幼苗期作物的形態(tài)指標、農(nóng)藝性狀、生理指標都可作為評判耐性的主要依據(jù)［46-47］。植物的形態(tài)指標可直觀地反映品種在脅迫下的耐性，植物的生理生化特性是植物在內(nèi)部機理上對低氮脅迫產(chǎn)生的響應，進而影響了其形態(tài)特征及產(chǎn)量等指標［49-50］，形態(tài)和生理指標可分別反映植物外部及內(nèi)部的抗性。因此，綜合形態(tài)與生理指標來評價植物可以更全面地反映材料的耐低氮性。同時，鑒于各品種的固有差異，采用耐低氮系數(shù)來科學評價各品種的相對變化。并且，基于各指標間相關性差異，運用主成分分析和隸屬函數(shù)分析可以實現(xiàn)降維分析，能全面地分析各個指標的數(shù)據(jù)及其相關性［51］。綜上，為了更準確地對皮燕麥抗性進行評價，本試驗采用燕麥的形態(tài)指標、光合指標、氮代謝相關酶活性、硝態(tài)氮含量、活性氧含量及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等21 個指標的耐低氮系數(shù)，通過相關性分析、主成分分析、隸屬函數(shù)分析、聚類分析相結合的方式來綜合評價18 份皮燕麥的耐低氮性。本研究首先采用隸屬函數(shù)與主成分分析相結合的方法，計算耐低氮綜合值（D）來評價皮燕麥的耐低氮性，盡可能減少單一方法的片面性。結果發(fā)現(xiàn)在低氮脅迫中，所試驗的品種里，耐低氮性較強的品種是甜燕70、青海甜燕麥和青海444，較弱的是駿馬、甜燕2 號和青燕2 號，其余材料耐低氮性居中。聚類分析將青海甜燕麥、美達、青海444、牧王、領袖、邊鋒劃分為耐低氮品種；將魅力、太陽神、莫妮卡、甜燕2 號、青燕2 號、槍手劃分為氮敏感品種；其余品種均為中等耐低氮品種。結合隸屬函數(shù)綜合評價與聚類分析所得結果來看，青海甜燕麥、青海444 在以上分析結果中均屬于耐低氮型品種，而甜燕2號、青燕2 號這兩份品種均屬于氮敏感型品種，所得結果還需大田試驗進行驗證。對于所篩選出來的耐低氮型品種青海甜燕麥，發(fā)現(xiàn)其在低氮脅迫下的活性氧含量大幅增加，但它的丙二醛（MDA）含量卻沒有大幅變化，這可能與其交替呼吸途徑強弱有關，因此推測青海甜燕麥的抗氧化脅迫能力較強，但還需后續(xù)試驗進行驗證。

4 結論

1）低氮脅迫對皮燕麥早期的形態(tài)及生理生化有顯著影響，早期燕麥的株高、地上部生物量在低氮脅迫下均呈顯著下降趨勢，根長變化以及地下部生物量變化不盡相同；同時凈光合速率、硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶等活性、可溶性蛋白與可溶性糖含量在受到低氮脅迫時均下降，而脅迫后的谷氨酸合成酶活性、活性氧含量與丙二醛含量會上升。

2）不同皮燕麥的耐低氮性不同，18 份材料中，耐低氮性較強的品種是青海甜燕麥、青海444，較弱的是甜燕2號和青燕2 號。