卵巢癌腹水中不同腫瘤相關(guān)性巨噬細胞亞型IL-10、IL-12表達的差異

宋玉霞，趙 濤，王宏衛(wèi)，郭 清，王雪娟

(河北省石家莊市第一醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050011)

·論 著·

卵巢癌腹水中不同腫瘤相關(guān)性巨噬細胞亞型IL-10、IL-12表達的差異

宋玉霞，趙 濤，王宏衛(wèi)，郭 清*，王雪娟

(河北省石家莊市第一醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050011)

目的研究不同臨床分期的卵巢癌患者腹水或腹腔沖洗液中M2/M1比值；采用流式細胞學(xué)方法分選出M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞；檢測與M1、M2相關(guān)的細胞因子白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)、IL-12 mRNA的相對表達量，從細胞因子水平初步闡述卵巢癌腹腔播散和轉(zhuǎn)移的免疫學(xué)機制。方法①用CD64、CD163分別標記M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞，觀察10例卵巢癌患者及17例卵巢良性腫瘤患者腹水或腹腔沖洗液中M2/M1比值。②用流式細胞學(xué)方法分選出M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞。③采用RT-PCR方法檢測檢測M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞中IL-10、IL-12 mRNA的相對表達量。結(jié)果對照組M2/M1比值低于Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期，卵巢癌Ⅰ+Ⅱ期M2/M1比值低于Ⅲ+Ⅳ期，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IL-10在M2型巨噬細胞中的相對表達量高于M1型巨噬細胞，IL-12在M1型巨噬細胞中的相對表達量高于M2型巨噬細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論在上皮性卵巢癌患者腹水中有巨噬細胞浸潤，早期患者M1型巨噬細胞所占比例較高，晚期患者M2型巨噬細胞所占比例較高；M2型巨噬細胞比例較高提示卵巢癌期別較高；IL-10、IL-12的表達差異提示M2型巨噬細胞可能有助于卵巢癌腹腔的播散及遠處轉(zhuǎn)移。

卵巢腫瘤；巨噬細胞；白細胞介素10；白細胞介素12

卵巢癌是婦科腫瘤中惡性程度最高的疾病，腹膜轉(zhuǎn)移是晚期卵巢癌的特征之一。晚期卵巢癌患者腹水微環(huán)境的浸潤細胞包括內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、成纖維細胞、巨噬細胞等，其中巨噬細胞是含量最豐富的免疫細胞。近年來研究發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細胞浸潤數(shù)量與卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移及臨床進展有顯著的相關(guān)性[1]。M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞在某些細胞因子的表達上有所差異。本研究通過分析不同期別卵巢癌患者及卵巢良性腫瘤患者腹水或腹腔沖洗液中M2/M1比值的差異，采用RT-PCR方法比較M1巨噬細胞和M2型巨噬細胞白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)、IL-12表達的差異，初步篩選出腫瘤細胞中的關(guān)鍵分子靶點，旨在為解釋卵巢癌的腹腔播散和轉(zhuǎn)移提供新的線索，并為卵巢癌分子靶點的干預(yù)策略提供理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇自2014年1月—2015年7月在河北省石家莊市第一醫(yī)院婦科門診及住院的首診上皮性卵巢癌患者10例為觀察組，年齡53～67歲，平均(60.12±4.51)歲，行腫瘤細胞減滅術(shù)，術(shù)后FIGO分期為Ⅰ～Ⅳ期，F(xiàn)IGO Ⅰ、Ⅱ期4例，F(xiàn)IGO Ⅲ、Ⅳ期6例。選擇同期卵巢良性腫瘤患者17例為對照組，年齡33～47歲，平均(41.24±3.81)歲。卵巢良性腫瘤需要手術(shù)者排除盆腔炎性疾病、子宮肌瘤、子宮腺肌癥或交界性瘤、免疫系統(tǒng)疾病等能引起腹腔免疫環(huán)境改變的并發(fā)癥患者。

1.2 腹腔巨噬細胞分離、培養(yǎng)與純度鑒定

1.2.1 腹腔巨噬細胞分離 對照組采用腹腔沖洗液，觀察組有腹水者收集腹水，沒有腹水者采用腹腔沖洗液，嚴格無菌操作。離心收集細胞沉淀(1 200 r/min，15 min，4 ℃)，F(xiàn)icoll 密度梯度法收集中間層單個核細胞(1 000 r/min，20 min，23 ℃)， PBS 重懸后再次離心(800 r/min，7 min，23 ℃)。

1.2.2 腹腔巨噬細胞培養(yǎng) 細胞以無血清RPMI 1640重懸后種于100 mm細胞培養(yǎng)皿，細胞種植密度為1.0×106/mL，培養(yǎng)箱中靜置 2 h 使細胞貼壁，用預(yù)熱的PBS潤洗3次， 除去懸浮細胞。加入10%FBS-RPMI 1640，置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，備用。

1.2.3 腹腔巨噬細胞純度鑒定 以免疫熒光的方式鑒定分離培養(yǎng)巨噬細胞純度。細胞刮輕刮培養(yǎng)皿收集巨噬細胞，離心收集的細胞沉淀1 200 r/min， 5 min，23 ℃。棄上清，以CD68抗體標記巨噬細胞，37 ℃，1 h。PBS洗滌3遍，標記熒光二抗，37 ℃，1 h。PBS洗滌3遍，Hocest染核5min。PBS洗滌3遍，熒光顯微鏡觀察，統(tǒng)計。

1.3 腹腔巨噬細胞各亞型比例的檢測 以CD68作為腹腔巨噬細胞(M0)的表面標記，以CD64作為M1巨噬細胞的表面標記，以CD163作為M2型巨噬細胞的表面標記。將對照組和觀察組不同分期收集的腹腔沖洗液或腹水離心收集細胞沉淀，取1.0×106個細胞，分別標記上述熒光抗體，采用流式細胞學(xué)方法檢測M2/M1比值。

1.4 方法 采用流式細胞學(xué)方法分選出卵巢癌患者腹腔沖洗液或腹水中M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞：以CD64作為M1巨噬細胞的表面標記，以CD163作為M2型巨噬細胞的表面標記；將對照組和觀察組不同分期收集的腹腔沖洗液或腹水離心收集的細胞沉淀，取1.0×106個細胞，分別標記上述熒光抗體，用流式細胞儀進行分選。將分選出來的M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞分別培養(yǎng)：細胞以無血清RPMI 1640重懸后種于100 mm細胞培養(yǎng)皿，細胞種植密度為1.0×106/mL，培養(yǎng)箱中靜置 2 h 使細胞貼壁，用預(yù)熱的PBS潤洗3次， 除去懸浮細胞；加入10%FBS-RPMI 1640，置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，備用。采用RT-PCR方法檢測M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞中IL-10、IL-12 mRNA的表達：取生長狀態(tài)良好且細胞密度在80%～90%的M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞，收集細胞，分別提取其總RNA。根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書，檢測M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞中IL-10、IL-12 mRNA表達量，引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較分別采用t檢驗、F檢驗和q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Sequence of RT-PCR primers

2 結(jié) 果

2.1 3組M2/M1比值比較 對照組M2/M1比值低于卵巢癌Ⅰ+Ⅱ期與Ⅲ+Ⅳ期，卵巢癌Ⅰ+Ⅱ期M2/M1比值低于Ⅲ+Ⅳ期，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 對照組、Ⅰ+Ⅱ期組、Ⅲ+Ⅳ期組M2/M1比值比較Table 2 M2/M1 ratio of control group,Ⅰ+Ⅱ stage and Ⅲ+Ⅳ stage

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與卵巢癌Ⅰ+Ⅱ期比較(q檢驗)

2.2 IL-10、IL-12分別在M1、M2型巨噬細胞中的相對表達量 IL-10在M2型巨噬細胞中的相對表達量高于M1型巨噬細胞，IL-12在M1型巨噬細胞中的相對表達量高于M2型巨噬細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 IL-10、IL-12分別在M1、M2型巨噬細胞的相對表達量Table 3 The relative expression of IL-10 and IL-12 in M1 and M2 macrophages respectively

3 討 論

近年來,惡性腫瘤發(fā)病率及病死率逐年上升,婦科惡性腫瘤也不例外。卵巢癌是女性生殖器官中最常見的惡性腫瘤，由于至今無有效的疾病篩查及診斷方法，初診的卵巢癌患者中近70%已是晚期，卵巢癌已成為女性生殖系統(tǒng)腫瘤中病死率最高的疾病[2]。

卵巢惡性腫瘤主要的組織學(xué)類型為上皮性卵巢癌，但由于卵巢位于盆腔深部，不易被捫及，臨床發(fā)覺時多已是晚期，5年存活率為25%～30%，卵巢癌FIGOⅢ/Ⅳ期患者，病變多已轉(zhuǎn)移至盆腹腔內(nèi)的許多臟器，如轉(zhuǎn)移至大網(wǎng)膜、腸系膜根部或肝臟、膀胱等,導(dǎo)致上皮性卵巢癌成為婦科惡性腫瘤臨床診斷及治療中的難點。

巨噬細胞作為第一道免疫防線(固有免疫的主要細胞成分)，大量存在于人體正常腹腔微環(huán)境中,這些巨噬細胞的作用主要是維持腹腔正常免疫環(huán)境。晚期卵巢癌患者主要臨床特征為腹腔內(nèi)病灶的廣泛種植播散和大量腹水,在卵巢癌腹腔種植播散的過程中,巨噬細胞與腫瘤細胞存在一定的相互作用,從而影響腫瘤細胞的惡性表型和不良轉(zhuǎn)歸。機體中的巨噬細胞可塑性較強,在不同的微環(huán)境的作用下,可表現(xiàn)出不同性質(zhì)及功能，局部微環(huán)境是決定巨噬細胞發(fā)生類型和功能差異的主要因素[3-4]。根據(jù)發(fā)揮功能不同及活化狀態(tài)的不同,巨噬細胞主要可分為經(jīng)典活化的M1型巨噬細胞和替代性活化的M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞主要通過分泌促炎性細胞因子、專職提呈抗原、趨化因子,從而參與正向免疫應(yīng)答,發(fā)揮免疫監(jiān)視,使M1型巨噬細胞具有殺菌、抗腫瘤作用。所以在腫瘤發(fā)病早期,M1型巨噬細胞在抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。M1型巨噬細胞的特點是高IL-12,并產(chǎn)生IL-23,抗原遞呈能力強,主要促進Th1細胞免疫;而M2型巨噬細胞的特點是低IL-12和高IL-10,抗原遞呈能力較低,抑制Th1獲得性細胞免疫。

人IL-12由單核-巨噬細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞等抗原提呈細胞分泌，在人體內(nèi)發(fā)揮著非常重要的免疫調(diào)節(jié)功能。它可以刺激各種免疫細胞如自然殺傷細胞和T細胞產(chǎn)生γ- 干擾素(interferon-γ,IFN-γ)，促進多種黏附分子的表達；也能夠誘導(dǎo)初始CD4+T細胞分化成為Thl輔助細胞，同時促使Th2細胞產(chǎn)生多種免疫細胞因子如IL-4、IL-13等[5-6]。大量實驗研究證明，IL-12可以抑制腫瘤細胞的惡性增殖，延長荷瘤動物的生存壽命，具有一定的抗腫瘤功效，是一種重要的抗腫瘤細胞因子[7-9]。盡管如此，人們對于IL-12的具體抗腫瘤機制仍未完全明了，而且由于直接應(yīng)用IL-12的不良反應(yīng)較大，限制了IL-12在臨床抗腫瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用。

IL-10是一種炎癥負調(diào)控因子，能夠激活STAT3通路，高表達IL-10R[10-11]，并且通過多種途徑對免疫應(yīng)答進行負向調(diào)節(jié)：抑制CD4+T 細胞合成和產(chǎn)生IL-2、IL-5、腫瘤壞死因子α 和IFN-γ；抑制細胞毒性T細胞、自然殺傷細胞釋放IFN-γ；抑制巨噬細胞向Th1細胞提呈抗原，減少巨噬細胞表面的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅱ類分子、細胞間黏附分子[12-13]。IL-10也是拮抗IL-12生物學(xué)活性的重要細胞因子，有研究發(fā)現(xiàn)IL-10呈劑量依賴性地抑制IL-12誘導(dǎo)的血單核細胞的非MHC限制性殺傷活性及產(chǎn)生IFN-γ的能力。本研究證實IL-10與IL-12表達量呈負相關(guān)。同時，IL-12可迅速降低IL-10在腫瘤相關(guān)巨噬細胞的表達，可見IL-10與IL-12在細胞因子網(wǎng)絡(luò)中相互影響[14]。

Reinartz等[15]將IL-10R阻斷抗體注射入小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤巨噬細胞迅速發(fā)生了從M2向M1表型的轉(zhuǎn)變，并在16 h內(nèi)對腫瘤產(chǎn)生持續(xù)的免疫反應(yīng)。此外，除了阻斷IL-10R外，還發(fā)現(xiàn)阻斷IL-6 能在一定程度上遏制M1 型巨噬細胞向M2 型轉(zhuǎn)化,但其是否能使M2向M1表型進行逆分化仍需進一步研究證明[16-17]。

綜上所述，本研究證明了上皮性卵巢癌患者腹水中有巨噬細胞浸潤，早期患者M1型巨噬細胞所占比例較高，晚期患者M2型巨噬細胞所占比例較高。提示隨著卵巢癌患者腹腔微環(huán)境的變化，由最初的M0主要向M1分化轉(zhuǎn)變?yōu)镸0向主要M2分化；M2型巨噬細胞比例較高提示卵巢癌患者期別較晚。M1型巨噬細胞的特點是高IL-12低IL-10，M2型巨噬細胞的特點是低IL-12和高IL-10，已有大量的研究證實了IL-12的抗瘤、抑瘤作用，這就為IL-12應(yīng)用于卵巢癌的治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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(本文編輯：劉斯靜)

Differences in IL-10 and IL-12 expression of different tumor-associated macrophage subtypes in ascites of ovarian carcinoma

SONG Yu-xia, ZHAO Tao, WANG Hong-wei, GUO Qing*, WANG Xue-juan
(DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstHospitalofShijiazhuangCity,HebeiProvince,Shijiazhuang050011，China)

Objective To detecte M2/M1 ratio of ascites or peritoneal washings of different macrophages subtypes of ovarian cancer patients at different stages, to separate M1 subtype macrophages and M2 subtype macrophages by flow cytometry, to test the mRNA expression of M1- and M2-related cytokines IL-10 and 1L-12, and to explain the immune mechanism of ovarian cancer abdominal metastasis at the point of cytokines. Methods ①M1 macrophages and type M2 macrophages were labeled with CD64 and CD163 respectively, and the ratio of M2/M1 in ascites or peritoneal lavage fluid in 10 cases of ovarian cancer and 17 cases of benign ovarian tumor was observed. ②Flow cytometry was used to separate M1 subtype macrophages and M2 subtype macrophages. ③RT-PCR was used to test the mRNA expression of M1- and M2-related cytokines IL-10 and 1L-12. Results M2/M1 ratio in control group was lower than that in Ⅰ+Ⅱ stage and Ⅲ+Ⅳ stage; while Ⅰ+Ⅱ stage M2/M1 ratio was lower than Ⅲ+Ⅳ stage, and there was statistically significant differencein two groups(P<0.05). IL-10 expression in M2 subtype macrophages was higher than it in M1 subtype macrophages. IL-12 expression in M1 subtype macrophages was higher than that in M2 subtype macrophages. There was statistically significant difference respectively(P<0.05). Conclusion There were macrophages in epithelial ovarian cancer patients' ascites. M1 subtype macrophages accounted for high proportion at the early stage, while M2 subtype macrophages accounted for high proportion at the terminal stage.The high proportion of M2 subtype macrophages indicated that ovarian cancer patients were at the terminal stage. The difference expression of IL-10 and IL-12 indicated that M2 macrophages may create favorable conditions for ovarian cancer peritoneal dissemination and distant metastases.

ovarian neoplasms; macrophages；interleukin-10；interleukin-12

2016-12-15；

2017-02-04

宋玉霞(1981-)，女，河北藁城人，河北省石家莊市第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事婦科疾病診治研究。

R737.31

A

1007-3205(2017)06-0676-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.06.014

*通訊作者