甜瓜抗霜霉病KASP分子標(biāo)記的開發(fā)與驗證

摘"要：【目的】""開發(fā)及驗證與甜瓜霜霉病抗性基因緊密連鎖的KASP分子標(biāo)記，為甜瓜抗霜霉病分子標(biāo)記輔助育種提供理論基礎(chǔ)。

【方法】""以高抗霜霉病甜瓜品種“PI 438685”與高感霜霉病甜瓜品種“黃旦子”為親本，構(gòu)建F2代分離群體。利用BSA-seq技術(shù)，對甜瓜霜霉病抗性基因進行QTL定位，根據(jù)SNP分布位置在定位區(qū)間內(nèi)開發(fā)66對與甜瓜霜霉病抗性基因緊密連鎖的KASP分子標(biāo)記，并使用F2代分離群體進行篩選驗證。

【結(jié)果】""霜霉病抗性基因定位到9號染色體末端區(qū)域，篩選出9對在雙親間具有多態(tài)性的KASP分子標(biāo)記。獲得1對與甜瓜霜霉病抗性基因緊密連鎖的KASP分子標(biāo)記（KASP_24832572），其基因分型準(zhǔn)確率為79%，準(zhǔn)確度較高。

【結(jié)論】""在9號染色體上定位到1個與甜瓜霜霉病抗性相關(guān)的區(qū)間，在此區(qū)間內(nèi)開發(fā)并篩選出1對與甜瓜霜霉病抗性基因緊密連鎖的KASP分子標(biāo)記，該標(biāo)記有助于甜瓜抗霜霉病分子標(biāo)記輔助育種。

關(guān)鍵詞：""甜瓜；霜霉病；BSA-seq；KASP分子標(biāo)記；分子標(biāo)記輔助育種

中圖分類號："S436.5""""文獻標(biāo)志碼："A""""文章編號："1001-4330（2024）11-2626-09

0"引 言

【研究意義】甜瓜（Cucumis melo L）是葫蘆科（Cucurbitaceae）甜瓜屬（Cucumis）一年蔓生草本植物［1］。瓜類霜霉病病原菌為古巴假霜霉菌（Pseudoperonospora cubensis），是一種氣傳性專性寄生菌［2］，其成熟的孢子囊可隨氣流廣泛傳播，從而導(dǎo)致病害不斷擴大蔓延，對葫蘆科作物的危害大［3］。瓜類霜霉病多于高溫、高濕時發(fā)生，多個病斑匯合成片導(dǎo)致全葉卷縮干枯，嚴重時可至整株干枯死亡。瓜類霜霉病對甜瓜的栽培生產(chǎn)帶來了嚴重的不利影響［4］，如在甜瓜霜霉病流行年份，霜霉病的發(fā)生可使甜瓜減產(chǎn)30%～50%，嚴重時高達70%～80%，甚至絕產(chǎn)［5］。在甜瓜實際生產(chǎn)中，往往會使用化學(xué)藥劑防治霜霉?。?］。而選育具有霜霉病抗性的甜瓜種質(zhì)資源才是提高甜瓜霜霉病抗性經(jīng)濟有效的方法之一?！厩叭搜芯窟M展】隨著分子標(biāo)記技術(shù)的成熟，不少研究者相繼開發(fā)出與霜霉病抗性基因連鎖的簡單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記［7-10］。SSR標(biāo)記雖然在構(gòu)建遺傳圖譜中發(fā)揮著重要作用，但通常與目標(biāo)基因距離較遠且其通用性未得到檢驗，因此限制了SSR標(biāo)記在分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用［11］。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，序列信息的可用性促進了單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記的識別與開發(fā)。SNP標(biāo)記具有遺傳穩(wěn)定性好、分布密度高以及可批量篩選和檢測等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種的研究中［12］。基于SNP位點所開發(fā)的KASP分子標(biāo)記，結(jié)合競爭性等位基因特異性PCR技術(shù)，可以對SNP以及InDel位點進行精準(zhǔn)的雙等位基因分型。加之KASP分子標(biāo)記相較于其他分子標(biāo)記具有批量化、自動化和標(biāo)準(zhǔn)化的特點，適用于群體的高通量檢測，使其逐漸成為主要的分子標(biāo)記檢測方法之一［13］。目前，KASP分子標(biāo)記在構(gòu)建遺傳圖譜、基因定位和種質(zhì)資源分析等方面均發(fā)揮了重要作用。此外，KASP分子標(biāo)記在甜瓜重要性狀的品種選育中得到廣泛應(yīng)用，如果皮外觀［14］、果實形狀［15］、果肉顏色［16］、抗硫［17］和抗?。?8，19］等?！颈狙芯壳腥朦c】目前KASP分子標(biāo)記在甜瓜抗霜霉病分子標(biāo)記輔助育種中的開發(fā)及應(yīng)用卻鮮有報道。利用傳統(tǒng)雜交育種手段選育抗霜霉病的甜瓜品種具有周期長、篩選效率低等缺點，在一定程度上限制了甜瓜霜霉病抗性品種選育的進程。而分子標(biāo)輔助育種可以克服傳統(tǒng)育種的缺點，加快霜霉病抗性品種選育的步伐，因此亟需開發(fā)與甜瓜霜霉病抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分別以高抗品種“PI 438685”與高感品種“黃旦子”為親本，構(gòu)建F2代分離群體。利用BSA-seq技術(shù)對甜瓜霜霉病抗性基因進行QTL定位，并開發(fā)具有多態(tài)性的KASP分子標(biāo)記。利用F2代分離群體對KASP分子標(biāo)記進行驗證，最終獲得與甜瓜霜霉病抗性緊密連鎖的KASP分子標(biāo)記，可用于甜瓜霜霉病的抗性鑒定，為選育甜瓜抗霜霉病的品種提供理論依據(jù)。

1"材料與方法

1.1"材 料

采用高感品種“黃旦子”（P1）為母本，高抗品種“PI 438685”（P2）為父本，均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心提供。通過P1與P2雜交獲得F1代，F(xiàn)1代植株通過自交獲得F2代分離群體，該群體用于甜瓜霜霉病的抗性鑒定以及KASP分子標(biāo)記的篩選與驗證。植物材料于2葉1心時定植于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心試驗基地并進行常規(guī)管理。

1.2"方 法

1.2.1"試驗設(shè)計

供試菌株為古巴假霜霉病菌，取自海南三亞早期自然發(fā)病的甜瓜葉片。接種前對發(fā)病葉片進行預(yù)處理，首先將采集的霜霉病葉片使用無菌水清洗，去除葉片表面雜菌與老化的霜霉病孢子囊；隨后，使用干凈毛刷蘸取無菌水輕柔地將葉片背面的新鮮孢子刷在無菌燒杯中，配置成孢子懸浮液。利用顯微鏡檢測孢子懸浮液中孢子的狀態(tài)，鏡檢合格后，通過血球計數(shù)板將其最終濃度調(diào)整為5×10 3 個/ mL，待后續(xù)接種使用。

在甜瓜幼苗第3片真葉完全展開時，選取2片真葉作為接種對象并做好標(biāo)記，于16：00之后接種。接種方法采用噴霧法，使用手持微型噴霧器將孢子懸浮液均勻噴灑在葉片背面，直到葉片滴落水珠為止。將接種后幼苗覆蓋遮光膜進行24 h黑暗培養(yǎng)，保持相對濕度為80%～90%，24 h后進行常規(guī)管理，即晝溫為23～25℃，濕度為80%～85%；夜溫為18～20℃，濕度為85%～90%。

1.2.2"霜霉病抗性等級鑒定

待接種霜霉病病原菌的葉片充分發(fā)病時（約接種后10～15 d），調(diào)查P1、P2、F1和F2分離群體發(fā)病情況。參照Criswell［20］和Epinat C［21］的抗性分級標(biāo)準(zhǔn)對P1、P2、F1和F2分離群體評估霜霉病抗性等級。病情級別為0和1級被視作抗病，其余被視作感病。表1

1.2.3"DNA提取及BSA-seq分析

取雙親及F2代分離群體植株幼嫩葉片（0.5～1 g）置于2 mL離心管中，用于提取基因組DNA。使用DNA提取試劑盒（Plant Zol，北京全式金）提取DNA，具體操作流程參照說明書依次進行。隨后，通過超微量分光光度計（Quawell，美國）對DNA濃度測定，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。依據(jù)F2代分離群體霜霉病抗性評估結(jié)果，選取30株極端抗病單株和30株極端感病單株，將其檢測合格的DNA分別等量混合，構(gòu)建極端抗感基因池。并委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司（北京），對2個親本和2個極端抗感基因池分別進行全基因組重測序。將測序得到的Clean resds比對到甜瓜參考基因組（DHL92_4.0），采用GATK3.3軟件檢測SNP，根據(jù)ΔSNP-index閾值確定與甜瓜霜霉病抗性相關(guān)的候選區(qū)域，篩選與甜瓜霜霉病抗性連鎖的SNP位點。

1.2.4"KASP分子標(biāo)記開發(fā)及驗證

在候選區(qū)域內(nèi)檢測雙親中具有差異的SNP位點，并選取純和的SNP位點開發(fā)KASP分子標(biāo)記。根據(jù)選取的SNP位點側(cè)翼序列設(shè)計2個特異的上游引物和1個通用的下游引物，引物委托生工有限公司（上海）合成。分別以“PI 438685”、“黃旦子”及極端抗感池的DNA為模板，通過PCR擴增篩選在雙親及極端抗感池中具有多態(tài)性的KASP分子標(biāo)記，并利用135株F2代分離群體進行進一步驗證。依據(jù)F2代分離群體單株表型及基因型鑒定結(jié)果，計算KASP分子標(biāo)記的基因分型準(zhǔn)確率。

PCR總反應(yīng)體系為：2× KASP Mix 1 μL、Primer1 0.003 μL、Primer2 0.003 "μL、Primer Common 0.008 "μL和DNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94℃ 10 min，1個循環(huán)；94℃ 20 s，61℃ 45 s，10個循環(huán)；94℃ 20 s，55℃ 20 s，40個循 環(huán)；4℃保存。PCR程序在Gene Matrix TM高通量基因分型系統(tǒng)（HC Scientific，成都）的Matrix Cycler和Matrix Scanner上進行；利用Matrix Master軟件進行基因型數(shù)據(jù)分析。

2"結(jié)果與分析

2.1"甜瓜親本及F2分離群體霜霉病抗性鑒定

研究表明，“PI 438685”植株生長狀態(tài)良好，葉片表面無病斑未發(fā)生霜霉病，病情級別為0級，即高抗霜霉??；“黃旦子”葉片表面形成黃褐色角斑并伴有灰黑色霉層產(chǎn)生，且病斑面積占整個葉片面積的3/4以上，病情級別為5級，即高感霜霉病。圖1

以“PI 438685”和“黃旦子”為雙親，雜交獲得135株F2代分離群體。對F2代分離群體于幼苗期進行霜霉病接種，待接種幼苗充分發(fā)病后觀察其表型，并統(tǒng)計其病情級別。共有28株幼苗抗性級別為0級，9株為1級，7株為2級，12株為3級，63株為4級，8株為5級。F2分離群體霜霉病抗性級別分布規(guī)律為連續(xù)分布，甜瓜霜霉病抗性為數(shù)量遺傳性狀。圖2

2.2"BSA-seq分析

研究表明，對2個親本池、極端抗病池（3-0）和極端感病池（3-5）進行基因組重測序。此次測序共產(chǎn)生29.84 G Raw data。其中，“PI 438685”的Clean Base約為5 G， “黃旦子”的Clean Base約為5.2 G，后代極端抗感混池的Clean Base分別約為10 G和9.4 G。測序樣品Q20百分比均大于96.4%，Q30百分比均大于96.7%。GC含量百分比在36.81%～37.45%，Clean Base與甜瓜參考基因組比對率在93.18%～95.86%。測序樣本數(shù)據(jù)量充足，測序質(zhì)量較高，可用于后續(xù)SNP位點變異檢測及目標(biāo)性狀的QTL定位。表2

得到2 461 802個高質(zhì)量SNP位點。以親本“PI 438685”基因組作為參考，計算兩個子代間Δ（SNP-index）值。9號染色體末端區(qū)域的Δ（SNP-index）值高于95%置信水平的閾值線。因此，將該區(qū)間作為甜瓜霜霉病抗性基因的候選區(qū)間。圖3

2.3"KASP標(biāo)記開發(fā)及多態(tài)性篩選 "

研究表明，縮小甜瓜霜霉病抗性基因的候選區(qū)間，在9號染色體23～24 Mb均勻地開發(fā)66個KASP分子標(biāo)記。分別以“PI 438685”和“黃旦子”的DNA為模板進行PCR擴增，篩選在親本中具有多態(tài)性的KASP分子標(biāo)記。33對KASP分子標(biāo)記在雙親中具有多態(tài)性，多態(tài)性效率為50%。表3

以極端抗感池的DNA為模板，利用具有多態(tài)性的33對分子標(biāo)記進行PCR擴增，共有9對KASP分子標(biāo)記（KASP_23399433、KASP_23401162、KASP_23408092、KASP_23420662、KASP_23470437、KASP_23796506、KASP_23798623、KASP_24060858和KASP_24832572）能夠?qū)O端抗感單株進行基因型鑒定。計算9對KASP分子標(biāo)記的基因分型準(zhǔn)確率，其中KASP_24832572分子標(biāo)記的基因分型準(zhǔn)確率最高，可達76%。圖4

2.4"KASP分子標(biāo)記在F2分離群體中的驗證

研究表明，在135株F2代分離群體中共檢測到28株基因型為aa的抗病植株、67株基因型為Aa的雜合感病植株以及30株基因型為AA的純和感病植株。結(jié)合前期F2代分離群體表型鑒定結(jié)果，計算KASP_24832572分子標(biāo)記對F2代分離群體基因型鑒定的準(zhǔn)確率，其基因型鑒定準(zhǔn)確率高達79%。KASP_24832572分子標(biāo)記與甜瓜霜霉病抗性基因緊密連鎖，可用于甜瓜抗霜霉病分子標(biāo)記輔助育種中。圖5

3"討 論

3.1

不適當(dāng)?shù)脑耘喙芾泶胧┮约安贿m宜的光照條件均會引起甜瓜霜霉病的發(fā)生［22-23］。甜瓜霜霉病病原菌主要通過氣流傳播，因此發(fā)病速度極快，防治較為困難，嚴重影響甜瓜產(chǎn)量及品質(zhì)［24］。在實際生產(chǎn)中，殺菌劑的長期使用導(dǎo)致甜瓜霜霉病病原菌產(chǎn)生了極強的耐藥性，同時也對環(huán)境造成了不利的影響。因此，培育具有霜霉病抗性的甜瓜品種是最安全有效的防治措施［25］。

目前，已有大量與霜霉病抗性遺傳規(guī)律相關(guān)的研究報道。Epinat的研究結(jié)果顯示，在抗病品系PI 414723、MR-1和PI 124112中，MR-1和PI l241l2的抗性則是由單隱形基因控制的［26］；而抗病材料MR-1［27］、PI 124111［28］以及來源于印度的PI 124111F［29］中霜霉病的抗性是由多個不完全顯性基因所控制。研究通過對“PI 438685”與“黃旦子”雜交得到的F2代分離群體病情級別的統(tǒng)計分析得知，“PI438685”中霜霉病抗性是由多基因控制，與Thomas等［29］的研究結(jié)果相似。目前，甜瓜霜霉病抗性的遺傳規(guī)律至今沒有明確的定論，可能是由于植物材料、霜霉病病原菌以及表型鑒定標(biāo)準(zhǔn)等存在差異，導(dǎo)致研究結(jié)果有所不同。"""3.2

隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，不少研究者利用分子生物學(xué)手段開發(fā)與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，對目標(biāo)性狀進行了選擇與跟蹤定位［30］。Perchepied等［31］通過PI 124112×Védrantais 的RIL群體開發(fā)了17對SSR標(biāo)記，用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，并定位到了11個與霜霉病抗性相關(guān)的QTLs。張學(xué)軍等［32］將BSA-seq技術(shù)與SSR標(biāo)記相結(jié)合，在霜霉病抗性材料“PI 390452”的5、9和10號染色體上各定位到一個與霜霉病抗性相關(guān)的候選區(qū)間。此外，Toporek利用MR-1×Ananas Yok'neam的RIL群體開發(fā)的SSR標(biāo)記將霜霉病抗性候選區(qū)間定位到9號染色體上［33］。研究利用“PI 438685”與“黃旦子”雜交得到的F2代分離群體，通過BSA-seq技術(shù)在9號染色體末端區(qū)域定位到了與甜瓜霜霉病相關(guān)的QTL。在此候選區(qū)間內(nèi)成功開發(fā)了KASP_24832572分子標(biāo)記，其基因分型的準(zhǔn)確率為79%，可用于甜瓜霜霉病抗性鑒定及分子標(biāo)記輔助育種。今后將在此基礎(chǔ)上進一步結(jié)合F2： 3家系的基因型和表型對甜瓜霜霉病抗性基因進行精細定位，并明確甜瓜霜霉病抗性基因具體的分子作用機制。"

4"結(jié) 論

利用“PI 438685”和“黃旦子”為親本構(gòu)建F1代，F(xiàn)1代自交形成F2代分離群體，對F2代分離群體進行霜霉病抗性等級評估。在F2分離群體中各選取30株極端抗感單株用于構(gòu)建極端抗感混池，并進行BSA-seq分析，在9號染色體末端區(qū)域定位到1個與霜霉病抗性相關(guān)的QTL。在此候選區(qū)間內(nèi)開發(fā)了1對與甜瓜霜霉病抗性緊密連鎖的KASP分子標(biāo)記（KASP-24832572），該標(biāo)記在F2代分離群體中的基因分型準(zhǔn)確率高達79%，可用于甜瓜抗霜霉病品種的選育。

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Development and verification of KASP marker for resistance""to downy mildew in muskmelon

SHEN Yue1，LING Yueming2，DUAN Xiaoyu2，YANG Wenli2，LI Meihua2，""WANG Yirou2，WANG Huilin1，ZHANG Xuejun2

（1. College of Horticulture，Xinjiang Agricultural University， Urumqi "830052， China; 2. Hami Melon Research Center， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091， China）

Abstract：【Objective】 ""This study aims to develop and validate KASP molecular markers closely linked to melon downy mildew resistance genes， in the hope of providing a theoretical basis for downy mildew resistance molecular marker assisted breeding of downy mildew resistance in melons.

【Methods】 ""The accession ‘PI 438685’ with high resistance of downy mildew， and the accession ‘Huangdanzi’ with high sensitivity of downy mildew were used as parents to construct a separate population.QTL mapping of downy mildew resistance genes in melon was drawn through a combination of BSA and whole genome sequencing.KASP molecular markers closely linked to downy mildew resistance genes were developed within this interval， and then screened and validated using F2 separate populations.

【Results】 ""The downy mildew resistance gene was located on chromosome 9 through BSA analysis.We developed 66 pair of KASP molecular markers in the candidate region， screened 9 pairs of KASP molecular markers with high specificity.Subsequently， the 9 pairs of KASP molecular markers were validated， the KASP molecular marker （KASP-24832572）， closely linked to downy mildew resistance genes was obtained， and its accuracy of distinguish genotype could reach 79%.

【Conclusion】 ""One QTL related to downy mildew resistance has been located on chromosome 9 by BSA analysis， and a pair of KASP molecular markers closely linked to downy mildew resistance genes are developed in this interval ， which has contributed to downy mildew resistance breeding in melons.

Key words：""melon; downy mildew; BSA-seq；KASP molecular markers; molecular markers assisted breeding

Fund projects："""Tianshan Innovation Team of Xinjiang Uygur Autonomous Region （2022D14015）;Project of National Natural Science Foundation of China（32060689）；MOF and MARA “China Agriculture Research System” （CARS-25）; Hainan Provincial Academician Innovation Platform Scientific Research Special Project （Academician WU Mingzhu Team Innovation Center）; Hainan Provincial Academician Innovation Platform Scientific Research Special Project（YSPTZX202141）;Xinjiang Uygur Autonomous Region Key Research and Development Program for Special Projects（2022B02002）

Correspondence author："""WANG Huilin （1965-）， male， from Henan， associate professor， master's supervisor， research direction： watermelon cultivation and breeding，（E-mail） wanghuilin@126.com

ZHANG Xuejun （1980-）， male， from Siping， Jilin， researcher， master's supervisor， research direction： disease resistant breeding of watermelon and melon，（E-mail） zxj333@126.com

收稿日期（Received）："2024-04-19

基金項目：""新疆維吾爾自治區(qū)天山創(chuàng)新團隊（2022D14015）；國家自然科學(xué)基金項目（32060689）；財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部“國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助”項目（CARS-25）；海南省院士創(chuàng)新平臺科研專項（吳明珠院士團隊創(chuàng)新中心）；海南省院士創(chuàng)新平臺科研（YSPTZX202141）；新疆維吾爾自治區(qū)重點研發(fā)任務(wù)專項（2022B02002）

作者簡介："沈悅（1999-），女，新疆人，碩士研究生，研究方向為甜瓜霜霉病抗性基因精細定位，（E-mail）shenyue052442@163.com

通訊作者：""王惠林（1965-），男，河南人，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為西甜瓜栽培與育種，（E-mail）wanghuilin@126.com

張學(xué)軍（1980-），男，吉林四平人，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向為西瓜甜瓜抗病育種，（E-mail） zxj333@126.com