核桃葉片生理性焦枯與礦質(zhì)元素關(guān)系研究

王霞磊，梁鑫淼，劉佳樂，賈 鵬，陳利英，齊國輝,2,4＊

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北 保定 071000；2. 河北省核桃技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 臨城 054300；3. 河北綠嶺果業(yè)有限公司，河北 臨城 054300；4. 河北?。ㄐ吓_）核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 臨城 054300)

核桃（Juglans regiaL.）是胡桃科核桃屬落葉喬木，是“木本油料之王”，綜合開發(fā)利用價值極高[1]。我國核桃產(chǎn)量大于消費量，部分產(chǎn)品主要用于出口，中國核桃出口量及出口金額呈現(xiàn)上漲態(tài)勢，2023 年1—3 月中國核桃出口量為6.33 萬噸，出口金額為1.63 億美元[2]。生長發(fā)育條件不適宜時會導(dǎo)致生理性病害的發(fā)生，使核桃體內(nèi)的礦質(zhì)元素失衡。葉片出現(xiàn)脈間失綠、邊緣焦枯等癥狀，造成核桃的產(chǎn)量和品質(zhì)下降[3-4]。李源等[5]指出核桃葉片焦枯癥會造成20.0%～30.0%的核桃園發(fā)生不同程度的生理病害，葉緣變褐、焦枯，果實變黑、萎縮，發(fā)病核桃樹商品率僅為60.0%～80.0%。張計峰等[6]指出南疆地區(qū)核桃園發(fā)生不同程度的生理病害，葉片出現(xiàn)葉緣焦枯的癥狀，使品質(zhì)嚴(yán)重下降、商品率較低，造成的經(jīng)濟損失高達1 000～3 000 元·（667 m2）-1。郭全恩等[7]發(fā)現(xiàn)，秦安縣鄭川鄉(xiāng)一帶大面積蘋果樹出現(xiàn)葉緣焦枯，甚至死亡現(xiàn)象。果園受害面積迅速擴大，受害程度不斷加重，對蘋果樹生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響。

礦質(zhì)元素是植物生長發(fā)育、生理代謝與果實品質(zhì)形成的物質(zhì)基礎(chǔ)和重要調(diào)控因子，對樹體的正常生長發(fā)育有著不可代替的作用[8-9]，失衡會影響樹體發(fā)生相應(yīng)的生理變化，使葉片發(fā)生焦枯[10]。但關(guān)于核桃葉片生理性焦枯與礦質(zhì)元素之間的關(guān)系還不明確。本研究以葉片營養(yǎng)診斷的方法對核桃葉片的礦質(zhì)元素進行測定，找出核桃葉片焦枯發(fā)生的原因，為核桃生產(chǎn)栽培管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2021 年6 月在河北省臨城縣河北綠嶺果業(yè)有限公司示范園核桃基地進行。該基地位于臨城縣城北 6 km 處， 114°31 '38.13 ″ E，37°31'49.79″ N，海拔96 m。年均日照2 653 h，年均氣溫13.0 ℃，年均降水量521 mm。

1.2 試驗材料

以葉片不同焦枯程度的‘綠嶺’核桃樹為試材，按焦枯程度占整片葉的百分比對核桃樹進行分級（圖1，CK：0.0%，0.0%＜Ⅰ級≤25.0%，25.0%＜Ⅱ級≤50.0%，50.0%＜Ⅲ級≤75.0%，75.0%＜Ⅳ級≤100.0%），共設(shè)5 個級別。隨機排列。每個級別2 株為1 小區(qū)，3 次重復(fù)，共30 株試驗樹。于2021 年6 月20 日、7 月21 日、8 月20 日采樣，每株從東、西、南、北4 個方向分別取葉2 片，部位為結(jié)果枝上復(fù)葉的頂葉，每小區(qū)各處理分別采集16 枚葉片。

圖1 ‘綠嶺’核桃葉片不同焦枯程度的表觀形態(tài)Fig. 1 Apparent morphology of ‘Lyuling’ walnut leaves with different scorching levels

1.3 試驗方法

1.3.1 葉綠素含量的測定[11]用6 mm 孔徑的手握式打孔機在葉片中部（距主葉脈3～5 mm）和葉緣部分（距葉片邊緣1～2 mm）取新鮮植物葉片0.1 g，利用乙醇提取法進行測定。

1.3.2 元素的測定[12]全N：凱氏定氮法；全P：鉬銻鈧比色法；全K、Na、Ca、Mg：稀釋一定的濃度后，用原子吸收分光光度計直接測定；Fe、Mn、Cu、Zn：原子吸收分光光度計直接測定；B：姜黃素比色法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel，用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析：組間差異顯著性采用單因素方差分析，用Duncan 法對各組數(shù)據(jù)平均值進行多重比較；Pearson 相關(guān)性分析和多元有序Logistic回歸分析。采用GraphPad Prism、origin 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同焦枯程度核桃樹的生長形態(tài)

通過對‘綠嶺’核桃樹生長形態(tài)進行觀察并拍照，核桃葉片形態(tài)出現(xiàn)不同程度的焦枯（圖2 ）。病樹的新生葉片均發(fā)現(xiàn)有焦枯現(xiàn)象。病葉表現(xiàn)為葉片邊緣發(fā)黃連成波紋型向主葉脈方向延伸，直至整個葉片發(fā)黃焦枯，葉片的正背面無霉?fàn)钗?、菌膿等病征，為非侵染性病害（圖2a～f ）。隨著時間和焦枯程度的增加，葉片邊緣逐漸由黃變褐，最后枯萎脫落（圖2f、h）。隨時間增加，各級病葉占全樹比例未發(fā)現(xiàn)有明顯變化。

圖2 ‘綠嶺’核桃不同焦枯程度的樹體形態(tài)Fig. 2 Tree morphology of ‘Lyuling’ walnut trees with different scorching levels

2.2 不同焦枯程度核桃葉片光合色素含量的變化

在葉片中部（表1），隨著焦枯程度的增加，各月份葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量大體呈下降的趨勢。6、7 月份Ⅳ級的類胡蘿卜素含量，8 月份Ⅳ級的葉綠素a、葉綠素b 含量下降最為顯著，與對照相比，分別降低了26.7%、24.4%，24.4%、31.9%。6、7 月份葉綠素a、葉綠素b 含量，8 月份類胡蘿卜素含量無顯著性差異。隨時間的推移，各級別葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)下降的趨勢。8 月〇、Ⅰ、Ⅳ級葉綠素a 含量，Ⅰ級葉綠素b 含量與6 月份相比分別降低了23.9%、31.7%、33.0%，31.4%。6 月到7 月份，各級別光合色素含量無顯著性差異。

表1 不同焦枯程度的‘綠嶺’核桃葉片中部葉綠素含量Table 1 Chlorophyll contents in the middle of‘Lyuling’ walnut leaves with different scorching levels

在葉緣部分（表2），隨著焦枯程度和時間的增加，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量呈下降的趨勢。各月份Ⅲ、Ⅳ級葉綠素b、類胡蘿卜素含量與對照相比均有顯著性差異。6 月份Ⅳ級葉綠素a 含量，8 月份Ⅳ級葉綠素b、類胡蘿卜素含量與對照相比下降最為明顯，分別降低了60.0%，76.8%、79.5%。各月份〇、Ⅰ級的葉綠素a 含量無明顯差異。6 月到7 月份，各級別光合色素含量無顯著性差異。8 月份Ⅰ級的葉綠素a，Ⅱ級葉綠素b 含量，Ⅳ級類胡蘿卜素含量與6 月份相比下降最為明顯，分別降低了44.4%，63.1%，75.0%。

表2 不同焦枯程度的‘綠嶺’核桃葉緣部葉綠素含量Table 2 Chlorophyll contents in the leaf margin of‘Lyuling’ walnut with different scorching levels

2.3 不同焦枯程度核桃葉片大量元素含量變化

不同焦枯程度核桃葉片大量元素含量變化如圖3 所示，隨焦枯程度的增加，葉片N、P 含量大致呈上升的趨勢，K、Na、Ca 含量變化情況比較復(fù)雜，Mg 含量變化相對穩(wěn)定。6 月份Ⅱ、Ⅲ級，7 月份Ⅰ、Ⅳ級N 含量顯著高于對照，最高高出26.1%；8 月份各級別與對照無顯著差異。6 月、8 月份Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級以及7 月份Ⅱ、Ⅲ級P 含量顯著高于對照，7 月份Ⅳ級與對照有差異但不顯著。6 月份Ⅱ、Ⅲ級，7 月份Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級K 含量顯著高于對照，8 月份各級別與對照無顯著差異。6、8 月份Ⅰ級Na 含量最高，分別為0.33 g·kg-1、0.22 g·kg-1，7 月份對照Na 含量最高，為0.26 g·kg-1。6 月份對照Ca 含量最高，7 月份Ⅳ級Ca 含量最高，8 月份Ⅲ級Ca 含量最高。Mg 含量各級別與對照均無顯著差異。

隨時間的推移，N、K、Na 含量大致呈逐漸下降的趨勢，P、Ca、Mg 含量大致呈先下降后升高的趨勢。8 月份Ⅱ、Ⅲ級N 含量顯著低于6 月份。7 月份Ⅳ級P 含量顯著低于6、8 月份，8 月份各級別P 含量與6 月份無顯著差異。7、8 月份Ⅱ、Ⅲ級K 含量顯著低于6 月份。7、8 月份對照、Ⅰ、Ⅳ級Na 含量顯著低于6 月份。8 月Ⅲ級葉片Ca 含量最高，為40.89 g·kg-1，7 月Ⅱ級葉片Ca 含量最低，為18.18 g·kg-1。

2.4 不同焦枯程度核桃葉片微量元素含量變化

不同焦枯程度核桃葉片微量元素含量變化如圖4 所示，隨焦枯程度的增加，葉片F(xiàn)e、Cu、Zn 含量變化情況比較復(fù)雜，Mn、B 含量大致呈下降的趨勢。6 月份對照Fe 含量顯著高于Ⅰ、Ⅱ級，7 月份對照與各級別Fe 含量無顯著差異，而8 月份對照Fe 含量顯著低于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ級。6 月份Mn 含量各級別與對照無顯著差異，7、8 月份對照Mn 含量與各級別差異顯著，分別為185.34 mg·kg-1、180.01 mg·kg-1。6 月份對照Cu 含量最低，Zn 含量最高，分為30.61 mg·kg-1、38.96 mg·kg-1；8 月份對照Cu 含量最高，為68.20 mg·kg-1；Ⅲ級Zn 含量最低，為16.38 mg·kg-1。除6 月份Ⅰ級與對照B 含量無顯著差異外，各月份對照與各級別B 含量均有顯著差異，最大降低了57.1%。

圖4 ‘綠嶺’核桃葉片不同焦枯程度下微量元素含量Fig. 4 Contents of trace elements in leaves of ‘Lyuling’ walnut at different scorching levels

隨時間的推移，葉片對照、Ⅱ、Ⅲ級Fe 含量大致呈逐漸下降的趨勢，Ⅰ、Ⅳ級Fe 含量大致呈先下降后上升的趨勢，Mn 含量大致呈先上升后下降的趨勢，B 含量變化相對穩(wěn)定。7、8 月份對照、Ⅳ級Fe 含量顯著低于6 月份。7、8 月份對照、Ⅱ級Mn 含量，對照、Ⅰ、Ⅱ級Cu 含量顯著高于6 月份。8 月份對照、Ⅲ、Ⅳ級Zn 含量顯著低于6 月份。8 月份Ⅲ級B 含量顯著高于6 月份，Ⅳ級B 含量最低，為46.79 mg·kg-1，且顯著低于6 月份。

2.5 不同焦枯葉片的礦質(zhì)元素間、病情程度與礦質(zhì)元素的相關(guān)性

不同焦枯葉片礦質(zhì)元素間的相關(guān)性見圖5，葉片N 與K 含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.66；與Mn、B 含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.62、-0.58。葉片P 與Mn、B 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.72、-0.69。葉片K 與Cu 含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.53。葉片Na 與Mg 含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.57；與Zn 含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.66。葉片Mg 與B 含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.59。葉片F(xiàn)e 與Zn 含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.52；與Cu 含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.58；與Mn 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.67。葉片Mn 與Cu、B 含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.66、0.71。

圖5 不同焦枯葉片礦質(zhì)元素間相關(guān)性Fig. 5 Correlation between mineral elements in different scorched leaves

將病情程度進行賦值（〇∶0、Ⅰ∶1、Ⅱ∶2、Ⅲ∶3、Ⅳ∶4）后，與礦質(zhì)元素進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3，病情程度與N 含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.63，與P 含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.76，與Mn、B 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.73、-0.91。

表3 病情程度與礦質(zhì)元素的相關(guān)性 Table 3 Correlation between disease severity and mineral element contents

2.6 基于多元有序Logistic 回歸模型的病情程度影響因素分析

將測定的11 個連續(xù)變量與病情程度（分類變量）進行多元有序Logistic 回歸處理，并滿足平行線檢驗后，得到的回歸結(jié)果見表4。綜合以上分析，K、Ca 含量雖然呈現(xiàn)出0.05 水平的顯著性（0.034、0.043＜0.050），但與病情程度的相關(guān)性不顯著，故不做考慮。B 含量回歸系數(shù)值為-0.872，且呈現(xiàn)出0.05 水平的顯著性（0.028＜0.050），說明B 元素含量對焦枯程度有顯著的負(fù)向影響關(guān)系。

表4 多元有序Logistic 回歸模型分析結(jié)果Table 4 Analysis results of multivariate ordered Logistic regression model

2.7 噴硼對核桃葉片的影響

為進一步驗證缺B 導(dǎo)致的葉片焦枯，選擇發(fā)生焦枯的‘綠嶺’核桃進行葉面噴硼肥試驗，于2022 年6、 7 和8 月份噴施0.0%（ 對照）、0.2%和0.4%的硼砂，成熟期采集葉片測定相關(guān)生理指標(biāo)。

2.7.1 噴硼后核桃葉片的光合色素含量 噴硼后葉片的光合色素含量如表5 所示，總體上，噴施不同濃度的B 肥可以提高葉片的光合色素含量，隨著噴B 濃度的增加，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量呈上升的趨勢。噴B 濃度為0 時，Ⅰ級葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均顯著高于Ⅲ、Ⅳ級。當(dāng)噴B 濃度為0.2%和0.4%時，各級別葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均無顯著性差異，且均高于噴B 濃度為0 時的光合色素含量。

表5 噴硼后核桃葉片的光合色素含量Table 5 Photosynthetic pigments content in walnut leaves after boron spraying

2.7.2 噴硼后核桃葉片的大量元素含量 噴硼后葉片的大量元素含量如表6 所示，噴施B 肥各元素含量的變化情況比較復(fù)雜，大致降低了葉片N、P、K 元素含量。隨著噴B 濃度的增加，Ⅰ級P、Ca 元素、Ⅱ級K、Na 元素和Ⅲ、Ⅳ級Mg 元素含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，而Ⅲ級N、P 元素含量、Ⅳ級N、Na 元素含量、Ⅰ級Mg 元素含量呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。噴B 濃度為0.0%時，各級別N、Mg 元素含量均無顯著性差異。噴B 濃度為0.4%時，各級別P、K、Ca 元素含量均無顯著性差異。

表6 噴硼后核桃葉片的大量元素含量Table 6 Large element content in walnut leaves after boron spraying

2.7.3 噴硼后核桃葉片的微量元素含量 噴硼后葉片的微量元素含量如表7 所示，噴施B 肥后，葉片Mn、Zn、B 元素含量呈現(xiàn)出增加的趨勢。噴B 濃度為0.2%時，各級別Mn、Cu 元素含量均無顯著性差異，各級別B 元素含量分別比噴B 濃度為0.0%時高出52.1%、36.5%、45.7%、140.8%。噴B 濃度為0.4%時，各級別B 元素含量分別比噴B 濃度為0.0%時高出70.9%、55.7%、50.5%、108.3%。

表7 噴硼后核桃葉片的微量元素含量Table 7 Trace element content in walnut leaves after boron spraying

3 討論

除了N、P、K 等大量元素外，微量元素也是植物正常生長、發(fā)育、開花和結(jié)果所必需的[13]。Fe、Mn、Cu、Zn 和B 等元素參與了植物所有的新陳代謝和細(xì)胞功能。對植物生長（光合作用、色素和蛋白質(zhì)、酶活性、合成和細(xì)胞分裂）起到至關(guān)重要的作用[14]。本試驗研究了核桃葉片生理性焦枯與礦質(zhì)元素的關(guān)系，具有重要的現(xiàn)實意義，但因品種與栽培區(qū)的不同，葉片發(fā)生焦枯的因素有很多，且各種元素又常常相互影響[15]，情況比較復(fù)雜。本試驗以O(shè)lsen J[16]的核桃葉片分析解釋所示元素的正常臨界范圍為依據(jù)，綜合不同焦枯葉片礦質(zhì)元素間、病情程度與礦質(zhì)元素間的相關(guān)性分析和礦質(zhì)元素與病情程度的多元有序Logistic 回歸分析，并通過噴肥試驗驗證，為找出核桃葉片焦枯發(fā)生的原因以及精準(zhǔn)施肥提供了參考。

Fe 雖然不是葉綠素的成分，但在葉綠素的卟啉環(huán)形成中起作用，直接參與光系統(tǒng)I、光系統(tǒng)II 和細(xì)胞色素復(fù)合物的形成[17-18]。植物缺Fe 時，葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育不完整，長度和厚度下降，片層結(jié)構(gòu)異常和模糊，基粒數(shù)目減少。嚴(yán)重缺Fe 時葉綠體會變小、甚至解體或液泡化，因此Fe 含量與葉綠素含量成正相關(guān)，缺Fe 直接導(dǎo)致植物失綠黃化，嚴(yán)重時，除靠近葉柄處的部分呈綠色外，其它均呈黃色至白色，葉片逐級失去光澤，葉緣也易發(fā)生破裂，甚至枯死[19-20]。本研究中，F(xiàn)e 含量在臨界范圍內(nèi)波動，且與病情程度與相關(guān)性不顯著，認(rèn)為Fe 對核桃葉片光合色素含量的降低沒有明顯影響。

Mn 是植物葉綠體的組成部分，它維護葉綠體膜結(jié)構(gòu)葉片，直接參與植物的光合作用，光系統(tǒng)II 中有一種錳蛋白，參與催化水分解反應(yīng)，催化氧的釋放，并向類囊體偶聯(lián)的電子傳遞鏈提供電子，因此缺Mn 會導(dǎo)致葉片的光合能力降低[21-22]，葉片失綠、脈間黃化，葉脈仍為綠色；有時出現(xiàn)一系列的黃褐色或黑褐色斑點；有時葉片發(fā)皺、卷曲，甚至凋萎[23]。本研究中，病情程度與Mn 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，但Mn 含量在臨界范圍內(nèi)波動且回歸結(jié)果不顯著，在一定程度上或許可認(rèn)為光合色素含量的下降與Mn 含量的下降有關(guān)。

Cu 在光合作用、呼吸作用和防止氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著重要作用。質(zhì)體藍(lán)蛋白是最豐富的銅蛋白，參與細(xì)胞色素b6f 復(fù)合物與類囊體腔中的光系統(tǒng)I 之間的電子傳遞。由于缺乏質(zhì)體藍(lán)素，缺Cu 會導(dǎo)致光合電子傳遞缺陷。植物表現(xiàn)出葉部焦化枯萎和皺縮落葉。表皮逐漸出現(xiàn)深褐色，枝條回退枯萎，枝條附近的樹皮上出現(xiàn)小黑褐色病斑[24]。

B 在植物中的主要功能是維持細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和功能，這種元素形成鼠李糖乳糖醛酸-II-B（RG-IIB）復(fù)合物，穩(wěn)定果膠網(wǎng)絡(luò)并調(diào)節(jié)細(xì)胞壁孔的大小[25]；B 還參與核酸和糖的代謝、蛋白質(zhì)的合成、磷代謝、苯酚和含氮化合物代謝以及激素調(diào)節(jié)等[26]。B 缺乏葉片生長發(fā)育遲緩，尖端腫脹，卷曲發(fā)黃，嚴(yán)重情況下死亡；B 過量則表現(xiàn)為褪綠或壞死斑塊，通常出現(xiàn)在成熟葉片的邊緣和尖端[27-28]。本研究中，病情程度與B 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，而B 隨焦枯程度的增加，其含量呈逐漸下降且低于正常臨界范圍，對焦枯程度有顯著的負(fù)向影響關(guān)系，且呈現(xiàn)出0.05 水平的顯著性。B 含量顯著下降，可能是核桃果實在膨大期的需B 量較大，B 轉(zhuǎn)運到了果實中而葉片又不能土壤中得到有效補充，葉片B 的生理功能出現(xiàn)紊亂[29]，從而出現(xiàn)缺B 的癥狀。使葉片的光合色素含量下降，發(fā)生焦枯現(xiàn)象。

為進一步驗證缺B 導(dǎo)致的葉片焦枯，選擇發(fā)生焦枯的‘綠嶺’核桃進行葉面噴硼肥試驗后發(fā)現(xiàn)，噴施不同濃度的B 肥后，葉片的光合色素含量、Mn、Zn、B 元素含量增加，葉片N、P、K 元素含量降低，各礦質(zhì)元素含量均在臨界范圍內(nèi)波動，葉片表觀形態(tài)正常無焦枯現(xiàn)象發(fā)生，焦枯癥狀得到了有效緩解，與姜存?zhèn)}等[30]對臍橙的研究相似。

4 結(jié)論

本研究分析‘綠嶺’核桃焦枯葉片11 種礦質(zhì)元素含量的關(guān)系，并進行噴肥試驗后證實缺B 是導(dǎo)致‘綠嶺’核桃葉片焦枯的最主要原因，為核桃生產(chǎn)栽培管理提供了理論參考。