高郵鴨蛋特征品質(zhì)指標分析

陳夢穎，龔 蘭，何 濤，朱 磊，欒楓婷，豆維勝，邵雪梅，方曉敏，尤兆榮，魏瑞成,*，王 冉

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，江蘇 南京 210014；3.高郵鴨蛋協(xié)會，江蘇 揚州 225600）

我國鴨蛋食用有幾千年歷史，是全球禽蛋生產(chǎn)和消費大國，鴨蛋生產(chǎn)量居世界首位[1]。高郵麻鴨作為我國三大名鴨之一，產(chǎn)于江蘇省高郵市，所產(chǎn)鴨蛋個頭大、品質(zhì)好，腌制后蛋白細嫩、蛋黃油潤翻沙，具有獨特鮮味，于2002年被國家質(zhì)監(jiān)總局批準為“國家地理標志產(chǎn)品”[2]。高郵鴨蛋富含多種促進人體健康、提高人體免疫力的營養(yǎng)成分，如鋅、鍺、硒、鈣等微量元素[3]，深受消費者喜愛。目前對高郵鴨蛋營養(yǎng)成分的研究較少，王珍珍等[4]基于常規(guī)蛋品質(zhì)對4 個品種的鴨蛋進行分析，發(fā)現(xiàn)4 個品種中紹興鴨蛋的蛋殼質(zhì)量最優(yōu)，縉云麻鴨的新鮮度最優(yōu)。陶志云等[5]基于部分基礎營養(yǎng)指標對高郵鴨蛋和金定鴨蛋的營養(yǎng)價值進行評價，發(fā)現(xiàn)兩者在蛋白營養(yǎng)及風味上均無明顯區(qū)別?，F(xiàn)有研究多數(shù)從感官品質(zhì)和基礎營養(yǎng)指標進行評價分析，特征成分和品質(zhì)優(yōu)點不明，并且受限于分析手段的單一化，很多特征營養(yǎng)物質(zhì)沒有作為優(yōu)質(zhì)品質(zhì)指標使用。研究表明，非靶向代謝組學技術(shù)通過高通量化學分析可對不同生物品種內(nèi)小分子化合物進行深入定性分析[6]，該技術(shù)已廣泛應用于食品、微生物、醫(yī)療等研究領域。B?ttcher等[7]采用代謝組學技術(shù)對洋蔥中的低聚果糖、氨基酸、S-半胱氨酸、皂苷類等極性及半極性成分進行了全面的輪廓分析，共表征出123 個代謝物，可用于全面闡明特異性代謝物模式。目前，在鴨蛋中采用代謝組學技術(shù)研究特征成分還鮮見報道。因此，本研究采用非靶向代謝組學技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計分析，對高郵鴨蛋及其他5 種鴨蛋的常規(guī)蛋品質(zhì)指標、基礎營養(yǎng)指標、小分子代謝物進行測定和分析，篩選出高郵鴨蛋的差異代謝物，明確高郵鴨蛋的特征營養(yǎng)品質(zhì)指標，以期為高郵鴨蛋的品質(zhì)評價研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗選取高郵鴨蛋、廣西海鴨蛋、淇河纏絲鴨蛋（3 種地理標志鴨蛋來自各核心產(chǎn)區(qū)）及市場主要銷售品種的3 類鴨蛋各30 枚作為主要材料，于養(yǎng)殖場蛋鴨生產(chǎn)后當天低溫快速運回實驗室，在3 d內(nèi)進行常規(guī)蛋品質(zhì)指標測定，將蛋清、蛋黃分離，存于－70 ℃冰箱，用于基礎營養(yǎng)指標、代謝組學測定。

甲醇、乙腈（均為色譜純）美國Sigma公司；甲酸（色譜純）上海安譜公司；所有實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

EMT-7300II 多功能蛋品品質(zhì)測定儀 日本Robotmation股份有限公司；游標卡尺 無錫凱保鼎工具有限公司；Zeno TOFTM7600液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國SCIEX公司；高速離心機 德國Eppendorf生命科學公司；氮吹儀 北京康林科技公司；HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)蛋品質(zhì)指標測定

蛋質(zhì)量、蛋白高度、蛋黃色度、哈夫單位：采用多功能蛋品品質(zhì)測定儀測定。蛋形指數(shù)：蛋形指數(shù)＝長徑/短徑，其中長徑、短徑用游標卡尺測定。蛋殼厚度：分別選取鴨蛋的鈍端、中部、銳端用游標卡尺進行測定，求3 個部位的平均值作為蛋殼厚度。蛋黃指數(shù)＝蛋黃高度/蛋黃直徑，其中蛋黃高度、蛋黃直徑由游標卡尺測定。每個指標設置6 個平行樣品。

1.3.2 基礎營養(yǎng)指標測定

水分質(zhì)量分數(shù)測定參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[8]；粗蛋白質(zhì)量分數(shù)測定采用凱氏定氮法，參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》[9]；粗脂肪質(zhì)量分數(shù)測定采用索氏提取法，參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》[10]；氨基酸相對含量測定參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》[11]；脂肪酸相對含量測定參照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》[12]。每個指標設置6 個平行樣品。

1.3.3 代謝組學分析

1.3.3.1 前處理

冰上稱取鴨蛋樣品置于2 mL離心管中，放置4 ℃低溫離心機，1 500 r/min離心30 s，加入200 μL 4 ℃水，勻漿儀進行勻漿破碎（6.1 m/s，60 s，3 次）。加入800 μL的乙腈-甲醇（1∶1，V/V）。渦旋30 s，超聲10 min（冰?。胖茫?0 ℃冰箱1 h。4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上清液置于氮吹儀中吹干（冰?。?。加乙腈-水（1∶1，V/V）復溶，渦旋30 s，超聲5 min（冰浴），4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上清液，過濾膜于進樣瓶中，分別從各樣品中取15 μL溶液，混勻，置于進樣小瓶中作為質(zhì)量控制樣品，待測定。每種鴨蛋設置6 個生物學平行樣品。

1.3.3.2 儀器條件

柱溫：40 ℃；流速：0.30 mL/min，進樣量：2 μL；正離子采集模式流動相：A相：0.05%甲酸-水溶液；B相：乙腈；負離子采集模式流動相：A相：0.05%甲酸-水溶液；B相：乙腈。

0.0～0.1 min，99% A、1% B；0.1～1.5 min，99% A、1% B；1.5～13.0 min，99%～1% A、1%～99% B；13.0～16.5 min，1% A、99% B；16.5～16.6 min，1%～99%A、99%～1% B；16.6～20.0 min，99% A、1% B。

采集模式：正電噴霧電離＋負電噴霧電離；質(zhì)譜一級全掃描＋二級離子掃描；掃描范圍：一級全掃描：m/z50～1 000；累積時間：0.1 s；二級離子掃描：m/z40～1 000；累積時間：0.05 s；化合物參數(shù)：去簇電壓：80/－80 V；碰撞電壓：（35±15）/（－35±15）V；源氣參數(shù)：氣簾氣壓：35 psi；加熱氣1氣壓：55 psi；加熱氣2氣壓：55 psi；加熱溫度：550 ℃；離子噴霧電壓：5 500/－4 500 V。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件整理記錄數(shù)據(jù)，SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，采用Duncan多重比較，P＜0.05表示差異顯著。實驗結(jié)果以±s表示。代謝組學數(shù)據(jù)采集完成后，通過MarkerView軟件進行提峰，MetDNA平臺進行化合物鑒定，metaboanalyst平臺及SIMCA-P軟件進行數(shù)據(jù)的主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法分析（partial leastsquares discrimination analysis，PLS-DA）、層次聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA），找出高郵鴨蛋的差異代謝物，利用SCIEX OS軟件對差異代謝物進行定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)蛋品質(zhì)結(jié)果分析

如表1所示，在6 種不同品種的鴨蛋中，高郵鴨蛋蛋質(zhì)量為86.91 g/枚，顯著高于其他5 種鴨蛋。蛋形指數(shù)以高郵鴨蛋最高，為1.41，顯著高于市場鴨蛋2和市場鴨蛋3。蛋殼厚度高郵鴨蛋處于中間水平，顯著高于廣西海鴨蛋、淇河纏絲鴨蛋（P＜0.05）。蛋黃色度以高郵鴨蛋最高，為15.67，分別比廣西海鴨蛋、淇河纏絲鴨蛋、市場鴨蛋1、市場鴨蛋2、市場鴨蛋3顯著高出2.54、1.67、1.42、1.85、2.77。鴨蛋的蛋白高度和哈夫單位是反映蛋品質(zhì)新鮮度和蛋白質(zhì)量的重要指標，在相同貯藏時間下，高郵鴨蛋的哈夫單位最高，顯著高于淇河纏絲鴨蛋、市場鴨蛋1、市場鴨蛋2、市場鴨蛋3（P＜0.05）。依據(jù)美國農(nóng)業(yè)部分級標準，高郵鴨蛋定為AA級（哈夫單位不小于72）[13]。蛋白高度以高郵鴨蛋最高，為8.17 mm，顯著高于其他5 種鴨蛋，分別高22.31%、35.04%、95.92%、74.57%、68.45%，表明高郵鴨蛋蛋白質(zhì)量高于其他幾種。蛋黃指數(shù)體現(xiàn)的是蛋黃在整蛋中的占比，本研究中高郵鴨蛋最高，為0.44，顯著高于其他5 種鴨蛋（P＜0.05）。

表1 不同品種鴨蛋常規(guī)蛋品質(zhì)指標對比Table 1 Comparison of conventional quality indicators of duck eggs from different breeds

2.2 基礎營養(yǎng)指標分析

2.2.1 水分、粗脂肪、粗蛋白含量分析

如表2所示，在6 種鴨蛋基礎營養(yǎng)指標中，高郵鴨蛋的水分和粗脂肪質(zhì)量分數(shù)處于中間水平；高郵鴨蛋粗蛋白質(zhì)量分數(shù)為13.68%，顯著高于其他品種鴨蛋0.37%～1.42%（P＜0.05）。

表2 不同品種鴨蛋基礎營養(yǎng)指標對比Table 2 Comparison of basic nutritional indicators of duck eggs from different breeds %

2.2.2 氨基酸含量分析

氨基酸的含量和比例是蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值評價的重要指標，因此，對6 種不同品種鴨蛋的氨基酸相對含量進行測定。如表3所示，高郵鴨蛋的總氨基酸相對含量最高，與廣西海鴨蛋差異顯著（P＜0.05）。聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織規(guī)定的蛋白質(zhì)理想模式為E/T（必需氨基酸/總氨基酸）40%左右，E/N（必需氨基酸/非必需氨基酸）60%以上[14]。高郵鴨蛋的E/T為44%、E/N為78%，均符合要求，表明高郵鴨蛋的蛋白符合理想蛋白的指標標準。高郵鴨蛋的鮮味氨基酸相對含量最高，為5.76%，其中，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸含量最高，分別為1.29%、1.95%、0.45%，可能是影響高郵鴨蛋滋味的一個因素。谷氨酸除呈現(xiàn)鮮味外，在進入人體后還參與各種重要的生理代謝活動，如解除氨的毒害、保護肝臟等[15]。高郵鴨蛋的支鏈氨基酸（branched-chain amino acid，BCAAs）即亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸相對含量最高，分別為1.16%、0.89%、0.62%，BCAAs通過促進胰島素釋放和生長激素釋放兩種途徑來促進肌肉增長，并減緩運動后的肌肉酸痛[16]，增強老年肌少癥患者的肌肉力量[17]。因此，相比其他鴨蛋品種，高郵鴨蛋更適合兒童、健身人群及老年人群。

表3 不同品種鴨蛋氨基酸相對含量對比Table 3 Comparison of amino acid contents of duck eggs from different breeds %

2.2.3 脂肪酸含量分析

鴨蛋中脂肪酸含量對蛋營養(yǎng)品質(zhì)有較大影響，6 種鴨蛋中脂肪酸含量的測定結(jié)果見表4。高郵鴨蛋的總脂肪酸、不飽和脂肪酸相對含量最高，分別為96.602%、69.312%，6 種鴨蛋的脂肪酸相對含量均表現(xiàn)為單不飽和脂肪酸＞飽和脂肪酸＞多不飽和脂肪酸。飽和脂肪酸中，高郵鴨蛋的相對含量最低，為27.290%，6 種不同品種鴨蛋的飽和脂肪酸占總脂肪酸相對含量分別為28.25%、33.46%、31.72%、31.78%、31.22%、33.13%。6 種不同品種鴨蛋單不飽和脂肪酸的碳鏈數(shù)為16～18，其含量占總脂肪酸含量比例分別為59.72%、52.03%、58.44%、56.58%、53.44%、49.54%，高郵鴨蛋占比最高，為57.688%；其中，高郵鴨蛋的油酸含量最高，與廣西海鴨蛋、市場鴨蛋2、市場鴨蛋3差異顯著（P＜0.05）。6 種不同品種鴨蛋的多不飽和脂肪酸碳鏈數(shù)為18～22，高郵鴨蛋的花生烯酸和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）含量最高，分別為0.518%、0.260%，與其他品種鴨蛋存在顯著差異（P＜0.05）。研究表明，單不飽和脂肪酸在正向調(diào)節(jié)血脂代謝、降低低密度脂蛋白膽固醇氧化敏感性等方面發(fā)揮重要作用[18-20]。多不飽和脂肪酸具有明顯的降血脂、降血壓、抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，能顯著降低心血管疾病的發(fā)病率[21]。DHA是人體中不可或缺的多不飽和脂肪酸，對大腦細胞發(fā)育有著極其重要的作用[22]。因此，高郵鴨蛋相比其他品種鴨蛋，含有豐富的不飽和脂肪酸，更有利于人體健康。

表4 不同品種鴨蛋脂肪酸相對含量對比Table 4 Comparison of fatty acid contents of duck eggs from different breeds%

2.3 非靶向代謝組學分析

2.3.1 PCA

PCA可以反映不同樣品間的變異度大小[23]。不同品種鴨蛋蛋黃與蛋清的PCA如圖1所示，在蛋黃中，PC1的貢獻率是25.6%，PC2的貢獻率是10.3%；在蛋清中，PC1的貢獻率是25.6%，PC2的貢獻率是23.3%。結(jié)果表明，蛋黃中6 個不同品種鴨蛋存在部分重疊，但總體呈現(xiàn)分離趨勢；蛋清中，高郵鴨蛋除與廣西海鴨蛋有部分重疊外，與其他品種鴨蛋均能明顯區(qū)分，并且檢測樣本均在各組95%置信區(qū)間內(nèi)，結(jié)果可靠，可從整體上體現(xiàn)6 種不同品種鴨蛋的差異性。

圖1 蛋黃（a）與蛋清（b）的代謝物PCA得分圖Fig.1 PCA score plots of metabolites in egg yolk (a) and egg white (b)

2.3.2 PLS-DA

由于PCA為反映數(shù)據(jù)原始狀態(tài)的無監(jiān)督分析方法，只能用來觀察實驗樣品的自然分布和組別關系，不能忽略組內(nèi)誤差以及消除與研究目的無關的隨機誤差[24]。因此，為了深入明確高郵鴨蛋與其他品種鴨蛋之間的代謝差異性，采用PLS-DA，構(gòu)建PLS-DA模型，得到6 個不同品種鴨蛋樣品的得分圖。如圖2所示，高郵鴨蛋的蛋黃、蛋清除與廣西海鴨蛋有部分重合外，與其他品種鴨蛋均能完全區(qū)分開，說明高郵鴨蛋與其他品種鴨蛋之間代謝物存在明顯差異。

在PLS-DA模型中，R2代表所建立的模型對數(shù)據(jù)的解釋率，Q2代表模型的預測能力，R2與Q2越接近1表明模型越穩(wěn)定可靠，其中Q2大于0.5認為該模型有效[25]。本研究中，蛋黃的R2為0.915，Q2為0.733；蛋清的R2為0.931，Q2為0.631。為防止模型擬合過度，采用200 次響應對模型進行置換驗證。置換檢驗是通過隨機改變分類變量Y的排列順序，多次建立對應的PLS-DA模型以獲取隨機模型的R2與Q2值。此檢驗在避免模型過擬合以及評估模型的統(tǒng)計顯著性上有重要作用[26]。如圖3所示，從左到右，最右邊為R2和Q2的原始點，所有R2點均低于原始的R2點，所有Q2點均低于原始的Q2點，且Q2點的回歸線與縱坐標的交叉點小于等于0[27]。證明此模型可靠，可進行后續(xù)差異化合物的查找。

2.3.3 HCA

為找出高郵鴨蛋與其他品種鴨蛋的差異性成分，對代謝物在不同鴨蛋中的積累模式進行層次聚類分析，建立樣品聚類分析熱圖[28]。如圖4所示，橫坐標和縱坐標分別為樣品和代謝質(zhì)譜特征，不同顏色為數(shù)據(jù)標準化處理后得到的數(shù)值，紅色區(qū)域代表高表達含量，藍色區(qū)域代表低表達含量。在蛋黃與蛋清中，高郵鴨蛋熱圖的色塊分布除與廣西海鴨蛋有部分相似之外，與其他品種鴨蛋有顯著差異。說明高郵鴨蛋與其他品種鴨蛋之間的代謝物有較大差異，可以篩選出差異化合物。

圖4 蛋黃（a）與蛋清（b）的聚類分析熱圖Fig.4 Cluster analysis heatmaps of egg yolk (a) and egg white (b)

2.3.4 差異代謝物的篩選和分析

采用單變量統(tǒng)計分析與多變量統(tǒng)計分析相結(jié)合的方法，根據(jù)P＜0.05、|log2差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）|＞1以及變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）＞1篩選差異代謝物。P值表示差異顯著，P值越小，差異性越顯著；計算樣品之間代謝物濃度的FC，log2FC的絕對值越大，表示差異越大；VIP是根據(jù)PLS-DA生成的變量投影重要性，數(shù)值越大表明該差異代謝物對樣品組間的分類判別的影響強度和解釋能力越強[29]。如表5所示，對高郵鴨蛋及其他品種鴨蛋進行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)蛋黃中鑒別到代謝物252 個，篩選差異化合物22 個，主要是氨基酸（6 種）、有機酸（2 種）、脂類（8 種）、核苷酸（2 種）、其他小分子代謝物（4 種）；蛋清中鑒別出184 個代謝物，篩選差異化合物40 個，主要是氨基酸（12 種）、脂類（4 種）、核苷酸（15 種）、糖類（2 種）、其他小分子代謝物（7 種）。蛋黃中，尿苷5’-單磷酸、順式-5,8,11,14-二十碳四烯酸為主要差異代謝物，相對含量顯著高于其他品種鴨蛋（P＜0.05），且順式-5,8,11,14-二十碳四烯酸僅在高郵鴨蛋黃中發(fā)現(xiàn)，其他品種鴨蛋黃中未檢出；蛋清中，鳥苷5’-單磷酸、N-乙?；?D-葡萄糖胺、吲哚為主要差異代謝物，鳥苷5’-單磷酸和N-乙?；?D-葡萄糖胺在高郵鴨蛋蛋清中顯著高于其他品種鴨蛋（P＜0.05），而吲哚在高郵鴨蛋清中未檢出。

表5 蛋黃和蛋清差異化合物Table 5 Differential compounds in egg yolk and egg white

尿苷5’-單磷酸與鳥苷5’-單磷酸均為呈味核苷酸，尿苷5’-單磷酸是由尿嘧啶、核糖和磷酸組成的單核苷酸，可通過從頭合成途徑或體內(nèi)核苷酸和核酸的降解產(chǎn)物獲得，在生物體內(nèi)廣泛參與糖代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝[30]。鳥苷5’-單磷酸具有獨特的香菇樣鮮味和抗氧化活性，可以保護細胞免受活性自由基的侵害，促進肝功能恢復。N-乙?；?D-葡萄糖胺是生物體內(nèi)多種多糖的組成單位，可增強人體免疫力，抑制癌細胞或纖維細胞的過度生長。順式-5,8,11,14-二十碳四烯酸即花生四烯酸，屬于n-6系列的長鏈多不飽和脂肪酸，主要以磷脂的形式存在于哺乳動物的器官、肌肉和血液里，尤其是腦和神經(jīng)組織中，是大腦功能和視網(wǎng)膜發(fā)育中必不可少的物質(zhì)。花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物在降血脂、抑制血小板聚集、抗炎癥、抗癌、抗脂質(zhì)氧化、促進腦組織發(fā)育等方面具有獨特的生物活性[31]。吲哚存在于植物和微生物中[32]，可作為飼料添加劑[33]，而本實驗選取的高郵鴨蛋采取核心養(yǎng)殖模式——湖區(qū)外放養(yǎng)，此模式下高郵鴨食用天然的高蛋白餌料，如魚、蝦、螺絲、蚌、水藻等，因此可能是造成吲哚在高郵鴨蛋清中未鑒定出的原因。

3 結(jié)論

本研究對高郵鴨蛋與其他5 種鴨蛋的常規(guī)蛋品質(zhì)、基礎營養(yǎng)指標及小分子代謝物進行測定，采用單變量統(tǒng)計與多變量統(tǒng)計相結(jié)合的方法進行分析，結(jié)果表明，高郵鴨蛋的蛋質(zhì)量、蛋形指數(shù)、蛋黃色度、哈夫單位、蛋白高度、蛋黃指數(shù)均為最高；基礎營養(yǎng)指標中，高郵鴨蛋的粗蛋白含量最高；氨基酸含量中，高郵鴨蛋的總氨基酸、鮮味氨基酸、支鏈氨基酸含量均為最高，利于人體吸收轉(zhuǎn)化，適合健身人群及老年人群；高郵鴨蛋的不飽和脂肪酸含量最高，利于大腦發(fā)育和人體健康。代謝組學數(shù)據(jù)分析得到，蛋黃中篩選出差異化合物22 種，蛋清中40 種差異化合物。其中，花生四烯酸、尿苷5’-單磷酸、鳥苷5’-單磷酸、N-乙?；?D-葡萄糖胺、吲哚為主要差異代謝物?；ㄉ南┧醿H在高郵鴨蛋黃中發(fā)現(xiàn)，尿苷5’-單磷酸在高郵鴨蛋黃中的表達量顯著高于其他品種鴨蛋（P＜0.05），鳥苷5’-單磷酸和N-乙?；?D-葡萄糖胺在高郵鴨蛋清中的表達量顯著高于其他品種鴨蛋（P＜0.05），且吲哚在高郵鴨蛋清中未檢出。該研究從感官、基礎營養(yǎng)指標和代謝組學層面比較了高郵鴨蛋與其他品種鴨蛋的品質(zhì)指標，明確了高郵鴨蛋的特征品質(zhì)指標并篩選出小分子差異代謝物質(zhì)，可為后期高郵鴨蛋特征品質(zhì)研究及分級評價提供一定的參考。