噬菌體Pu29特性分析及其在沙門氏菌磁分離富集中的應(yīng)用

丁一峰，張 宇，劉 茜，黃晨曦，邵彥春，王小紅

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

沙門氏菌（Salmonella）是一種定植于人類和動(dòng)物腸道的病原體，是導(dǎo)致人類食物中毒、傷寒、急性胃腸炎和敗血癥的主要病原體之一[1]，對其進(jìn)行快速檢測可有效控制沙門氏菌的感染和爆發(fā)。在日常生活中引起沙門氏菌感染的食物主要包括受污染的肉品、水果、牛奶和雞蛋等[2]。由于沙門氏菌在食品樣品中的豐度通常比較低且分布不均勻，因而需要通過對樣品中的沙門氏菌進(jìn)行預(yù)富集，例如預(yù)增菌培養(yǎng)等，提高檢測的靈敏度和檢出限[3-4]。但預(yù)增菌耗費(fèi)時(shí)間長，無法滿足快速檢測的要求[5]，因此，亟待研究開發(fā)新型快速樣品前處理方法，提高檢測效率。

磁性納米顆粒因其具有獨(dú)特的磁性引起了許多領(lǐng)域的關(guān)注與研究，如生物醫(yī)學(xué)、藥物輸送和診斷學(xué)[6]。免疫磁性分離是一種有效的分離技術(shù)，它將標(biāo)記有目標(biāo)分析物特異性抗體的磁珠與樣品進(jìn)行孵育；在樣品管附近的磁鐵吸引與分析物結(jié)合的磁珠，隨后移除剩余的液體[7]?？贵w標(biāo)記的磁性納米顆粒已被證明能有效地從牛肉、牛奶和水樣品中分離出大腸桿菌O157:H7[8]，以及從雞、魚、牛奶和奶酪樣品中分離出單核細(xì)胞性李斯特菌[9]。然而，這一方法在捕獲效率和成本方面還有待改進(jìn)[5]。其中，作為識別元件的高親和力抗體有著昂貴、難以獲得、不能區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞等缺陷，從而限制了免疫標(biāo)記磁珠使用范圍[10-11]。因此，有待進(jìn)一步發(fā)掘新型的識別元件，用于食源性病原菌的特異性識別。

噬菌體是能特異性感染宿主細(xì)菌的病毒，結(jié)構(gòu)簡單，由蛋白質(zhì)外殼和遺傳物質(zhì)核酸組成[12]。它們廣泛分布于土壤、地面、水質(zhì)和食物中，能夠高特異性識別宿主菌，與抗體相比，噬菌體對惡劣環(huán)境的耐受性強(qiáng)，還可以區(qū)分死細(xì)菌和活細(xì)菌[13]。由于噬菌體高度特異性的識別能力以及只能結(jié)合活細(xì)菌宿主，可將其用作快速細(xì)菌篩選中的檢測探針。He Yong等[14]將噬菌體PAP1與功能化磁珠偶聯(lián)制備生物探針，結(jié)合生物發(fā)光法在2 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)銅綠假單胞菌的快速檢測，檢測限達(dá)到2.0×102CFU/mL。Yan Chenghui等[15]利用金黃色葡萄球菌噬菌體與磁珠偶聯(lián)形成的生物探針，結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體識別金黃色葡萄球菌，在90 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對食品樣品中金黃色葡萄球菌的快速檢測，檢測限為2.47×103CFU/mL。但是噬菌體在食源性病原菌檢測方面的研究仍顯不足，有待進(jìn)一步擴(kuò)展噬菌體的應(yīng)用范圍。

本研究以篩選得到的1 株雞白痢沙門氏菌噬菌體Pu29（NCBI GenBank登錄號為OQ267695）為研究對象，全面分析其生物學(xué)及基因組特性，并將其作為特異性識別沙門氏菌的識別元件，利用酰胺反應(yīng)與羧基化的磁珠偶聯(lián)形成噬菌體-磁珠探針PhagePu29-MBs，同時(shí)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立一種快速、準(zhǔn)確的噬菌體磁分離技術(shù)，用于樣品中沙門氏菌的快速分離富集，旨在為快速分離富集食品樣品中的致病微生物提供新方法與思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞白痢沙門氏菌C519以及其他測定噬菌體宿主譜的細(xì)菌菌株均為實(shí)驗(yàn)室保存菌種。本實(shí)驗(yàn)所用污水樣品于2018年采集自湖北武漢市家庭小區(qū)周邊的某下水道。

LB培養(yǎng)基、LB瓊脂（LA）培養(yǎng)基、瓊脂 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；0.22 μm微孔濾膜 美國Millipore公司；雙層瓊脂培養(yǎng)基平板：下層培養(yǎng)基為LA培養(yǎng)基、上層培養(yǎng)基為含0.7%瓊脂粉的LB半固體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

Allegra X-30R臺式高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼公司；5417R小型臺式冷凍離心機(jī) 德國艾本德公司；M200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；7000FA100 kV透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）日本日立高新技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體分離與純化

參照聶若男等[16]的方法，采用雙層平板法對單一噬菌斑反復(fù)純化4～6 次直至噬菌斑大小基本一致，即得到純化的雞白痢沙門氏菌噬菌體。

1.3.2 噬菌體特性分析[17-18]

1.3.2.1 噬菌體宿主譜

采用點(diǎn)樣法測定雞白痢沙門氏菌噬菌體Pu29的宿主范圍。取100 μL培養(yǎng)至對數(shù)期的測試菌株加入到溫?zé)岚牍腆w培養(yǎng)基中，混勻后倒入預(yù)先準(zhǔn)備的LA平板上，待其凝固后，取5 μL效價(jià)109PFU/mL噬菌體Pu29滴加至上層平板表面，自然晾干后置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～8 h，觀察其裂解菌株情況。

1.3.2.2 噬菌體形態(tài)觀察

使用磷鎢酸負(fù)染法，取20 μL噬菌體液和2%磷鎢酸（pH 7）分別滴于封口膜上，輕取銅網(wǎng)置于噬菌體液中，浸泡10 min之后用濾紙吸去多余液體，再將銅網(wǎng)置于磷鎢酸染料中染色10 min后，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣緩慢吸去多余液體，自然晾干至完全干燥，制備好的銅網(wǎng)在TEM下觀察噬菌體形態(tài)，并用軟件Digital Micrograph Demo 3.9.1測量其大小。

1.3.2.3 生物學(xué)特性

采用雙層平板法測定噬菌體Pu29的最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）、吸附速率、一步生長曲線。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次設(shè)2 個(gè)平行。吸附速率及裂解量分別按式（1）、（2）計(jì)算：

1.3.2.4 噬菌體穩(wěn)定性評估

將109PFU/mL噬菌體置于恒溫水浴鍋中，分別于30～90 ℃保溫0、30 min和60 min，采用雙層平板法測定噬菌體的效價(jià)。每個(gè)溫度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每次設(shè)2 個(gè)平行。

取109PFU/mL噬菌體懸液分別加入到不同pH值（2～13）的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，放于37 ℃恒溫水浴鍋中2 h。采用雙層平板法測定噬菌體效價(jià)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次設(shè)2 個(gè)平行。

1.3.2.5 噬菌體基因組測序及分析

取1 mL高效價(jià)的噬菌體樣品（1010PFU/mL），參考Czajkowski等[19]的氯化鋅沉淀法提取DNA，利用超微量分光光度計(jì)定量濃度。采用Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行噬菌體全基因組測序。應(yīng)用軟件SPAdes v3.9.0對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭拼裝，構(gòu)建scaffold和conting。使用GeneMarkS（http://exon.gatech.edu/GeneMark/）和RAST（https://rast.nmpdr.org/rast.cgi）網(wǎng)站對全基因組序列進(jìn)行基因預(yù)測。使用在線BLASTp工具進(jìn)行蛋白編碼基因的功能注釋。將基因組上傳至NCBI獲得序列號?；蚪M圖用軟件BRIG（0.95）生成。分別在毒力因子數(shù)據(jù)庫（The Virulence Factor Database，VFDB）（http://www.mgc.ac.cn/VFs/）和耐藥基因數(shù)據(jù)庫（Antibiotic Resistance Genes Database，ARDB）（https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi）中查找可能的毒力基因和耐藥基因。依據(jù)國際病毒分類委員會（The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）的病毒分類和NCBI數(shù)據(jù)庫的BLASTn（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），選擇末端酶大亞基相似度較高的噬菌體。利用MEGA 7.0軟件分別建立基于末端酶大亞基的進(jìn)化樹，分析噬菌體Pu29的親緣關(guān)系。

1.3.3 噬菌體-磁珠PhagePu29-MBs的制備及富集沙門氏菌分離

1.3.3.1 PhagePu29-MBs的制備

取10 mg/mL經(jīng)超聲分散充分混勻的羧基化磁珠（MBs），利用磁性分離架進(jìn)行磁分離，待固液分離后去除上清液，保留MBs。加入嗎啉乙磺酸溶液（50 mmol/L，pH 5.0）清洗磁珠。隨后，迅速加入N-羥基琥珀酰亞胺溶液（終質(zhì)量濃度為10 mg/mL）和碳化二亞胺溶液（終質(zhì)量濃度為10 mg/mL），混勻，37 ℃活化30 min?；罨Y(jié)束后用PBS清洗磁珠3 次。加入噬菌體Pu29（109PFU/mL）到磁珠中，在37 ℃振蕩混勻30 min。使用PBS清洗3 次以去除未偶聯(lián)的噬菌體。用含0.5 g/100 mL BSA的PBS封閉剩余結(jié)合位點(diǎn)，于37 ℃振蕩混勻30 min，得到PhagePu29-MBs。該探針保存于含0.25 g/100 mL BSA的PBS（pH 7.4）中，4 ℃存放待用。

1.3.3.2 PhagePu29-MBs分離富集沙門氏菌的條件優(yōu)化

將100 μL的106CFU/mL沙門氏菌與制備的PhagePu29-MBs在37 ℃孵育20 min。使用磁性分離器分離細(xì)菌磁性復(fù)合物，用PBS洗滌3 次。然后，通過平板計(jì)數(shù)法確定上清液中細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量（Na/（CFU/mL））。為了確定未用噬菌體PhagePu29-MBs（N0/（CFU/mL））處理的沙門氏菌細(xì)胞總數(shù)，將細(xì)菌樣品直接涂布在LA板上。使用式（3）計(jì)算PhagePu29-MBs的捕獲效率：

為了進(jìn)一步提高PhagePu29-MBs捕獲沙門氏菌的效率，對噬菌體磁分離的應(yīng)用參數(shù)進(jìn)行改進(jìn)。

參照1.3.3.1節(jié)的方法，選取粒徑為200 nm的磁珠作為對象，將其與噬菌體偶聯(lián)，分別在4 ℃過夜，37 ℃偶聯(lián)0.5、2、4、6 h。采用點(diǎn)樣法測定PhagePu29-MBs上偶聯(lián)的噬菌體效價(jià)。選取噬菌體效價(jià)高的制備條件作為最優(yōu)條件制備PhagePu29-MBs。

依據(jù)上述探針分離富集沙門氏菌的步驟，分別優(yōu)化下述條件：1）分別將不同量的PhagePu29-MBs（10～200 μg）與沙門氏菌混合；2）PhagePu29-MBs與沙門氏菌混合液在37 ℃振蕩分別孵育5～30 min；3）PhagePu29-MBs與沙門氏菌混合液分別在4、25、37 ℃振蕩孵育20 min。測定PhagePu29-MBs對沙門氏菌的捕獲效率，以最高捕獲效率對應(yīng)的參數(shù)作為最佳探針使用量、最佳捕獲時(shí)間和最佳孵育溫度。

1.3.4 PhagePu29-MBs捕獲沙門氏菌的能力評估

1.3.4.1 PhagePu29-MBs的靈敏度

參考1.3.3節(jié)步驟，PhagePu29-MBs與不同濃度的雞白痢沙門氏菌C519（100～108CFU/mL）混合，測定PhagePu29-MBs對不同濃度沙門氏菌的捕獲效率。

1.3.4.2 PhagePu29-MBs的特異性

依據(jù)1.3.3節(jié)步驟，PhagePu29-MBs分別與106CFU/mL不同種屬細(xì)菌（雞白痢沙門氏菌C519、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、腸炎沙門氏菌ATCC 13076、豬霍亂沙門氏菌ATCC 10708、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21、單核細(xì)胞性李斯特菌ATCC 19114、單核細(xì)胞性李斯特菌ATCC 19115、副溶血性弧菌ATCC 33846、副溶血性弧菌ATCC 17802）混合，測定PhagePu29-MBs對不同種屬細(xì)菌的捕獲效率。

1.3.4.3 PhagePu29-MBs捕獲沙門氏菌的透射電鏡觀察

按照1.3.3.2節(jié)步驟，獲得PhagePu29-MBs捕獲沙門氏菌的復(fù)合物，加入2.5%戊二醛固定液。采用負(fù)染法，銅網(wǎng)碳面扣在樣品上，吸附樣品5 min。用濾紙垂直吸掉多余液體直至看不到殘留液體。將銅網(wǎng)碳面扣在磷鎢酸液滴上染色20～30 s，用濾紙吸干，放在濾紙上，在陰涼處自然干燥，隨即進(jìn)行TEM觀察。同時(shí)采用TEM觀察200 nm的羧基磁珠。

1.3.5 PhagePu29-MBs在加標(biāo)樣品中富集沙門氏菌的應(yīng)用

LB培養(yǎng)基采用高壓蒸汽滅菌法滅菌（121 ℃，20 min），5%和15%的全脂牛奶（市售）或脫脂牛奶，通過巴氏殺菌法滅菌。分別將103CFU/mL和106CFU/mL沙門氏菌C519加入到上述樣品中，按照1.3.4節(jié)的步驟，測定PhagePu29-MBs對樣品中沙門氏菌的捕獲效率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

使用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)據(jù)，并使用Student’st-test確定差異顯著性（P＜0.05，差異顯著），運(yùn)用GraphPad軟件進(jìn)行繪圖與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體Pu29分離純化及形態(tài)觀察

如圖1A所示，經(jīng)過5 次純化后，噬菌體Pu29的噬菌斑形態(tài)大小一致，直徑約為3.5～4.2 mm，效價(jià)可以達(dá)到3.4×109PFU/mL。經(jīng)過超速離心沉淀噬菌體顆粒后，通過TEM觀察噬菌體形態(tài)，如圖1B所示，噬菌體Pu29有一個(gè)二十面體的頭部，尾部較長且彎曲，不可收縮。用軟件Digital Micrograph Demo 3.9.1測量其大小可知，Pu29頭部直徑為（68.63±1.68）nm，尾部長度為（179.91±3.50）nm，尾部直徑為（9.23±0.21）nm。根據(jù)噬菌體的形態(tài)學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，Pu29屬于長尾噬菌體。

圖1 噬菌體Pu29分離純化及形態(tài)觀察Fig.1 Plaques and morphological observation of phage Pu29

2.2 噬菌體Pu29宿主譜

如表1所示，噬菌體Pu29可以裂解30 株沙門氏菌（30/36＝83.33%），且出現(xiàn)較清晰透明的噬菌斑，特別是對兩株雞白痢沙門氏菌的裂解效果最佳。噬菌體Pu29還可以裂解5 株大腸桿菌（5/10＝50.00%），對單核細(xì)胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌無裂解效果。結(jié)果表明噬菌體Pu29是1 株寬譜的烈性噬菌體。

表1 噬菌體Pu29宿主譜Table 1 Host spectrum of phage Pu29

2.3 噬菌體生物學(xué)特性

如圖2A所示，當(dāng)噬菌體Pu29的MOI為0.001時(shí)，噬菌體效價(jià)最高，達(dá)到9.33×108PFU/mL，而當(dāng)MOI為10時(shí)，噬菌體吸附、侵染效果最差，效價(jià)為9.00×107PFU/mL。結(jié)果表明當(dāng)噬菌體效價(jià)與宿主菌菌量以MOI為0.001侵染時(shí)，噬菌體宿主菌內(nèi)能夠增殖更多的子代噬菌體并裂解釋放。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用最佳MOI培養(yǎng)噬菌體。圖2B為噬菌體Pu29對宿主菌C519的吸附速率，噬菌體Pu29的吸附速率在0～15 min呈上升趨勢，15 min時(shí)達(dá)到峰值，最佳吸附速率可達(dá)88.67%，表明噬菌體Pu29在15 min能夠最大量地吸附在宿主細(xì)菌上。在15 min后，吸附速率逐步下降，直到33 min后完成吸附過程。如圖2C所示，噬菌體Pu29的潛伏期為30 min，裂解期為180 min，裂解量大約為115.74 PFU/cell。

圖2 噬菌體Pu29生物學(xué)特性分析Fig.2 Biological characteristic analysis of phage Pu29

2.4 噬菌體穩(wěn)定性

噬菌體Pu29的原始效價(jià)為3.65×109PFU/mL，其熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖3A所示，噬菌體Pu29溫度耐受力較強(qiáng)，在30～50 ℃溫度范圍內(nèi)，Pu29與原始效價(jià)幾乎一致，在60 ℃的環(huán)境下孵育1 h之后，其效價(jià)下降到3.25×108PFU/mL。在70～90 ℃之間，隨著溫度的升高，噬菌體的效價(jià)急劇降低。

圖3 噬菌體Pu29穩(wěn)定性Fig.3 Stability of phage Pu29

如圖3B所示，當(dāng)pH值為4～11時(shí)，對噬菌體Pu29的活性幾乎無影響，并且在此范圍內(nèi)其效價(jià)波動(dòng)較小。而處于pH 3或12的環(huán)境下對Pu29進(jìn)行2 h孵育后，其效價(jià)明顯降低。當(dāng)Pu29經(jīng)過pH值為2或13的條件處理后，其活性完全喪失。

2.5 噬菌體基因組分析

噬菌體Pu29的基因組長度為45 715 bp，堿基分布情況為A 12 145 個(gè)（26.57%）、T 12 506 個(gè)（27.36%）、C 10 614 個(gè)（23.22%）、G 10 450 個(gè)（22.86%），GC平均含量為21 064 個(gè)（46.08%）。將噬菌體Pu29全基因組核酸序列提交GenBank，獲取的登錄號為OQ267695。如圖4A所示，使用3 種預(yù)測蛋白功能工具（RAST、GeneMarkS和ORF Finder），預(yù)測出81 個(gè)編碼功能蛋白的基因，其中18 個(gè)蛋白通過NCBI的在線工具被注釋為已知功能，其余為假定功能蛋白。按照功能的不同類型，將其分為4大類：DNA包裝與核酸代謝（8 個(gè)）、除噬菌體尾部外的結(jié)構(gòu)蛋白（4 個(gè)）、有關(guān)裂解的蛋白（1 個(gè)）、尾部相關(guān)的蛋白（3 個(gè)）。在功能注釋的過程中沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)溶原性的基因，如整合酶等。通過VFDB和ARDB在線數(shù)據(jù)庫對噬菌體Pu29的全基因組序列進(jìn)行預(yù)測，并沒有預(yù)測出可能的毒力因子以及抗生素抗性基因。

圖4 噬菌體Pu29功能基因組學(xué)分析Fig.4 Functional genomic analysis of phage Pu29

使用BLASTn在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，篩選出18 株與噬菌體Pu29基因序列相似度高的噬菌體。以這18 株噬菌體和噬菌體Pu29的末端酶大亞基蛋白序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4B所示，Pu29的這兩個(gè)基因都與Vibriophage pYD38-A和Aeromonasphage pIS4-A形成一簇。因此，根據(jù)上述結(jié)果以及ICTV公布的病毒分類，表明Pu29屬于輪狀病毒屬（Roufvirus）的一個(gè)新物種。

2.6 PhagePu29-MBs條件優(yōu)化

如圖5A 所示，噬菌體Pu 29 原液的效價(jià)為3.4×109PFU/mL，噬菌體Pu29-200 nm磁珠偶聯(lián)物在4 ℃過夜，PhagePu29-MBs的效價(jià)為1.5×107PFU/mL?？瞻捉M（MBs）沒有出現(xiàn)任何透亮的噬菌斑現(xiàn)象。因此噬菌體Pu29與200 nm粒徑的羧基磁珠在4 ℃過夜偶聯(lián)的效果最佳。

圖5 基于噬菌體Pu29磁分離富集沙門氏菌條件優(yōu)化Fig.5 Optimization of magnetic separation and enrichment of Salmonella based on phage Pu29

如圖5B所示，10 μg PhagePu29-MBs對宿主菌液的捕獲效率最低，當(dāng)增加用量至25 μg時(shí)，捕獲效率最高，達(dá)到76.12%。但繼續(xù)增加探針的用量時(shí)，其捕獲效率有所降低，并且保持較穩(wěn)定的富集效果。因此25 μg探針對宿主細(xì)胞的富集作用能夠達(dá)到最佳效率，后續(xù)研究將選取25 μg PhagePu29-MBs富集細(xì)菌。

如圖5C所示，當(dāng)孵育5 min時(shí)，PhagePu29-MBs對宿主菌液的捕獲效率為62.61%，孵育時(shí)間從5 min逐漸延長至20 min時(shí)，PhagePu29-MBs富集宿主菌液的效率在不斷上升，孵育20 min時(shí)，捕獲效率最高，達(dá)到76.09%。但繼續(xù)延長孵育時(shí)間至30 min時(shí)，PhagePu29-MBs的捕獲效率又有所下降。因此選用20 min的孵育時(shí)間對細(xì)菌進(jìn)行富集。

如圖5D 所示，在4 ℃環(huán)境下孵育20 min 后的PhagePu29-MBs捕獲效率較差，僅為53.96%，當(dāng)環(huán)境溫度上升時(shí)，探針對宿主菌的捕獲量也隨之增加，在37 ℃恒溫條件下其能夠達(dá)到最佳富集效率，捕獲效率達(dá)到74.15%。經(jīng)過以上條件的優(yōu)化，選擇使用25 μg PhagePu29-MBs在37 ℃與宿主菌C519孵育振蕩20 min進(jìn)行富集實(shí)驗(yàn)。

2.7 PhagePu29-MBs分離富集沙門氏菌的能力

2.7.1 PhagePu29-MBs分離富集不同濃度的沙門氏菌

如圖6A所示，當(dāng)菌液濃度為4.5×109CFU/mL時(shí)，捕獲效率為67.41%，依次加入梯度稀釋至4.5×103CFU/mL菌液的過程中，隨著菌液濃度梯度的降低，PhagePu29-MBs捕獲效率不斷增長，當(dāng)加入4.5×103CFU/mL菌液時(shí)，其捕獲效率最高，可達(dá)83.93%。在PhagePu29-MBs中加入4.5×102CFU/mL的宿主菌液時(shí)，捕獲效率為57.78%。在加入最低菌量45 CFU/mL的條件下，PhagePu29-MBs仍能捕獲25 CFU/mL的宿主細(xì)菌，因此噬菌體Pu29與200 nm羧基磁珠偶聯(lián)物對不同濃度宿主菌C519有良好的前處理分離富集效果。

2.7.2 PhagePu29-MBs的特異性

探究噬菌體Pu29與磁珠偶聯(lián)之后對不同種屬細(xì)菌富集的特異性，結(jié)果如圖6B所示，PhagePu29-MBs對宿主細(xì)菌雞白痢沙門氏菌C519、鼠傷寒沙門氏菌14028、腸炎沙門氏菌13076、豬霍亂沙門氏菌10708、大腸桿菌NCTC 12900和大腸桿菌T10的捕獲效率較好，其中對雞白痢沙門氏菌C519的捕獲效率最高，可達(dá)75.76%，對豬霍亂沙門氏菌10708的捕獲效率較差，為58.20%。另外，相對于沙門氏菌屬不同血清型的菌株，對大腸桿菌、單核細(xì)胞性李斯特菌及副溶血性弧菌的富集效果較差，其中對單核細(xì)胞性李斯特菌19114的捕獲效率最低，為24.04%。證明噬菌體Pu29與磁珠的結(jié)合物能對不同血清型的沙門氏菌以及大腸桿菌進(jìn)行富集且捕獲效率較理想。而對其他菌株的捕獲效率均小于36%，說明PhagePu29-MBs具有良好的特異性。

2.7.3 PhagePu29-MBs捕獲沙門氏菌的TEM

通過TEM對200 nm（10 mg/mL）羧基磁珠進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖7A所示，在2 μm視野下觀察到大量微球顆粒聚集。PhagePu29-MBs分離富集宿主菌C519，對復(fù)合物進(jìn)行TEM觀察，結(jié)果如圖7B所示，視野中觀察到PhagePu29-MBs捕獲沙門氏菌（紅色箭頭）。因此，PhagePu29-MBs能夠?qū)ι抽T氏菌進(jìn)行分離富集。

圖7 TEM觀察PhagePu29-MBs捕獲沙門氏菌Fig.7 TEM observation of PhagePu29-MBs-captured Salmonella

2.8 PhagePu29-MBs對樣品中沙門氏菌的分離富集

如圖8所示，PhagePu29-MBs對脫脂牛奶的整體富集效果最佳，當(dāng)在5%脫脂牛奶中加入3.77×103CFU/mL菌液時(shí)，捕獲效率達(dá)到最大值，為92.92%。在LB中富集宿主菌的效率較低，當(dāng)對3.77×103CFU/mL的菌液進(jìn)行富集后，捕獲效率為75.90%，對3.77×106CFU/mL菌液的捕獲效率相比之下有所下降，為63.98%。然而在全脂奶粉配制成的5%及15%牛奶中，PhagePu29-MBs對宿主菌C519的富集效率明顯降低，在15%全脂牛奶中加入3.77×106CFU/mL的菌液后，經(jīng)過37 ℃振蕩20 min的富集，PhagePu29-MBs的捕獲效率最低，僅達(dá)到51.69%。

圖8 PhagePu29-MBs在不同基質(zhì)樣品中對雞白痢沙門氏菌的分離富集Fig.8 Isolation and enrichment of PhagePu29-MBs for Salmonella in different sample matrices

3 討論

沙門氏菌病是由沙門氏菌引起的第二大食源性疾病，對公眾健康構(gòu)成巨大威脅，并給許多國家造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，尤其是食品行業(yè)[20-21]。沙門氏菌可以在各種食物中檢測到，如雞蛋、蛋制品、肉類、奶酪、新鮮水果和蔬菜[2,22]。因此，在整個(gè)食品供應(yīng)鏈中快速準(zhǔn)確地監(jiān)測和檢測沙門氏菌對于早期預(yù)防食源性疾病爆發(fā)至關(guān)重要[23]。在食品樣品中沙門氏菌通常規(guī)定為不得檢出[24]，但是沙門氏菌在實(shí)際樣品中的豐度通常比較低且分布不均勻，這對于檢測技術(shù)提出了更高的要求[4,21]。噬菌體作為一種新型的識別元件，在食源性病原菌的預(yù)富集以及檢測方面有著廣闊的應(yīng)用前景[25-27]。例如Zhang Yun等[28]將噬菌體O157-IOV-4與功能化磁珠偶聯(lián)制備生物探針，結(jié)合比色法在2 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7的快速檢測，檢測限達(dá)到4.9×104CFU/mL。

噬菌體作為是一類專門吸附細(xì)菌的生物，具有特異性識別宿主細(xì)菌的特點(diǎn)[29]。利用這一特點(diǎn)已經(jīng)開發(fā)了一些方法用于細(xì)菌的特異性檢測，這些方法主要是基于噬菌體尾部中的受體結(jié)合蛋白（尾纖蛋白或尾刺蛋白），或者由相關(guān)裂解酶的識別區(qū)等介導(dǎo)[30]。噬菌體的宿主范圍可以很寬也可以很窄，因此有可能識別出整個(gè)屬或物種[13,31]。此外，在溫度、pH值和離子強(qiáng)度等因素方面，噬菌體比抗體表現(xiàn)出更大的穩(wěn)定性。噬菌體的低成本、大容量制備和高靶向特異性特點(diǎn)使其有望在病原體控制和檢測中應(yīng)用開發(fā)[32]。本研究采用的沙門氏菌噬菌體Pu29能夠在15 min就能實(shí)現(xiàn)對沙門氏菌的最大吸附，為88.67%。將其與羧基化的納米磁珠偶聯(lián)，得到PhagePu29-MBs，其捕獲效率最高為83.93%，最低捕獲菌量為45 CFU/mL，該方法分離富集沙門氏菌的時(shí)間大約為30 min，展現(xiàn)出其特異性捕獲沙門氏菌的特點(diǎn)。噬菌體Pu29的潛伏期為30 min，而PhagePu29-MBs在20 min內(nèi)即可完成對樣品中沙門氏菌的分離富集，能夠較大程度分離富集沙門氏菌。但長時(shí)間的孵育，噬菌體的裂解活性會導(dǎo)致細(xì)菌裂解。在后續(xù)的研究中，可利用噬菌體受體結(jié)合蛋白作為檢測食源性病原菌的識別元件，避免操作過程中時(shí)間過長噬菌體導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生裂解作用。

在加入一定菌量宿主菌的5%和15%脫脂牛奶中，PhagePu29-MBs能夠高效地富集到大量宿主菌C519，捕獲效率達(dá)到92.92%左右。而因?yàn)槿Ｄ逃懈嗟闹竞椭苄跃S生素等物質(zhì)，比脫脂牛奶的成分更加復(fù)雜，故在5%和15%的全脂牛奶中，PhagePu29-MBs對宿主菌的捕獲效率大大降低，為53.86%左右。黃震等[33]將抗體與磁珠偶聯(lián)制備免疫磁分離探針，構(gòu)建的免疫磁性分離方法能夠在35 min內(nèi)完成牛奶中大腸桿菌O157:H7的高效富集，捕獲效率在50%～93%之間。Zhou Yan等[34]將噬菌體P100與磁性微粒偶聯(lián)制備生物探針，該探針在20 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)單核細(xì)胞性李斯特菌的分離富集，捕獲效率為40%左右。因此，本研究基于噬菌體Pu29建立的快速分離富集沙門氏菌方法具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究分離純化得到1 株輪狀病毒屬（Roufvirus）的沙門氏菌噬菌體Pu29，其具有二十面體的頭部和不可收縮、彎曲的長尾部。該噬菌體的生物學(xué)特性和基因組分析表明，其具有吸附時(shí)間短、溫度和pH值耐受性良好、能夠特異性識別沙門氏菌等特點(diǎn)。Pu29基因組不攜帶編碼毒性或抗性因子的基因。利用酰胺反應(yīng)將其與羧基化的磁性納米材料偶聯(lián)得到探針PhagePu29-MBs。在最優(yōu)條件下，該探針用于分離富集沙門氏菌，捕獲效率最高可達(dá)到83.93%，最低捕獲細(xì)菌濃度為45 CFU/mL，孵育時(shí)間為20 min，分離富集所需時(shí)間為30 min，可有效用于加標(biāo)樣品中沙門氏菌的分離富集。因此，本研究基于噬菌體Pu29建立了一種快速、特異性強(qiáng)的沙門氏菌磁分離方法，可為開發(fā)基于噬菌體快速分離富集食品中的病原菌奠定一定的研究基礎(chǔ)。