魯氏接合酵母對高鹽和高溫脅迫響應(yīng)的差異性與共性分析

劉夢奇，閆珍珍，胡 娜，陳 雄，李 欣

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業(yè)微生物重點實驗室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068）

魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是一種重要的產(chǎn)香食品酵母，在醬油釀造中發(fā)揮著重要作用[1-3]，也是食品腐敗微生物之一[4]。長期以來，魯氏接合酵母具備兩種截然相反的特點，對高濃度鹽的高耐受性和對高溫的高敏感性。該酵母的耐鹽機(jī)理備受研究者的關(guān)注，明確了高鹽下酵母細(xì)胞的生理變化特點，篩選和鑒定出一系列耐鹽相關(guān)基因和蛋白[5-7]。然而，魯氏接合酵母耐溫、耐鹽特性差異研究較少，影響了雙重抗性優(yōu)良菌株的構(gòu)建。

微生物對逆境的響應(yīng)機(jī)理研究對理解微生物與環(huán)境的互作[8]和構(gòu)建高水平或新性狀菌株[9]非常重要。作為食品釀造中常見的微生物，酵母細(xì)胞逆境響應(yīng)機(jī)制研究采用兩種策略。第1種策略聚焦模式酵母細(xì)胞，主要是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[10-12]，以期獲得普遍性的酵母耐受機(jī)制；第2種策略圍繞具有特異性狀的酵母物種，如馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）[13-14]、魯氏接合酵母[15-16]、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）等[17-18]，探索特定種屬酵母的獨特的耐受機(jī)制。在各種逆境中，除了高濃度的不同外源物外（如乙酸、乳酸、高糖等）[19-23]，作為環(huán)境基本參數(shù)之一的溫度是研究工作者持續(xù)關(guān)注的壓力因子。針對這些環(huán)境壓力，研究者們從基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白和生理等不同層面和視角分析了酵母細(xì)胞對逆境的響應(yīng)[24-27]。作為酵母對外界環(huán)境響應(yīng)的重要一環(huán)，逆境調(diào)控基因，如HSF1（熱休克轉(zhuǎn)錄因子1）、MSN2/MSN4（SNF1突變蛋白2和4的多重拷貝抑制子）、HOG1（有絲分裂原激活蛋白激酶）和SOD1（超氧化物歧化酶1）的變化決定了細(xì)胞的生理狀態(tài)和參與特定環(huán)境響應(yīng)的基因集。雖然HSF1p是典型的熱激蛋白，但當(dāng)釀酒酵母遭遇甲萘醌刺激后，該蛋白充當(dāng)了細(xì)胞拯救基因的激活劑，通過維持氧化還原穩(wěn)態(tài)和蛋白穩(wěn)定避免細(xì)胞的氧化損傷[28]。作為靜止期糖酵解基因的主要調(diào)節(jié)因子，MSN4的缺失顯著減少了釀酒酵母對熱激的響應(yīng)或降低NaCl誘導(dǎo)的NTH1活性，并且下調(diào)高滲透脅迫條件下細(xì)胞乙二醛酶I（glyoxalase 1，GLO1）的表達(dá)水平[29-31]。HOG1對細(xì)胞在逆境下的存活至關(guān)重要。HOG1基因的失效會增強(qiáng)海洋酵母漢斯德巴氏酵母（Debaryomyces hansenii）對高濃度NaCl的敏感性[32]。過表達(dá)HOG1提高了釀酒酵母SPSC01對逆境的耐受能力以及生物乙醇的產(chǎn)量[33]。對SOD1基因而言，該基因的缺失可顯著改變釀酒酵母細(xì)胞應(yīng)答真菌細(xì)胞壁抑制劑CFW（Calcofluor Write）脅迫的全基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜[34]，同時降低釀酒酵母細(xì)胞在高溫和高滲透壓逆境下的耐受性[35]。然而，這些逆境調(diào)控基因在魯氏接合酵母適應(yīng)不利環(huán)境時的作用尚未可知。此外，耐溫機(jī)制研究中所普遍采用的短時間高溫刺激[36-39]并不能真實反映釀造過程中魯氏接合酵母所遭遇的長時間高溫壓力。同時，在絕大部分研究中使用的酵母細(xì)胞通用培養(yǎng)基為酵母提取物蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD），其營養(yǎng)豐富但物質(zhì)組成不清的特性給尋找逆境耐受關(guān)鍵基因帶來干擾。

基于以上考慮，本研究針對釀造產(chǎn)香魯氏接合酵母，確定了全合成最少營養(yǎng)組分的培養(yǎng)基，基于此探索酵母細(xì)胞在長時期（120 h）的高鹽（18% NaCl）和高溫（40 ℃）脅迫下對營養(yǎng)需求特點，并進(jìn)一步研究從適應(yīng)期到對數(shù)生長初期的有機(jī)酸代謝、氨基酸代謝、胞內(nèi)相容抗逆物質(zhì)和重要逆境響應(yīng)調(diào)控基因表達(dá)等方面的兩種逆境響應(yīng)差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魯氏接合酵母2013310（中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC M 2013310）是功能酵母和釀造微生物實驗室從中國傳統(tǒng)食品釀造中分離出的1 株酵母菌株。

全合成生長通用培養(yǎng)基（葡萄糖20.0 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、脯氨酸8.0 g/L、無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）培養(yǎng)基1.7 g/L）被用于酵母生長對照。YEPD固體培養(yǎng)基（酵母粉10.0 g/L、蛋白胨20.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L和瓊脂15.0 g/L）被用于種子液的制備，115 ℃、20 min滅菌。

全合成魯氏接合酵母生長培養(yǎng)基（葡萄糖20.0 g/L、脯氨酸4.0 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、無水硫酸鎂0.5 g/L、泛酸鈣1.0 mg/L和葉酸1.0 mg/L）被用于正常生理環(huán)境下魯氏接合酵母細(xì)胞的培養(yǎng)。高鹽逆境全合成培養(yǎng)基為添加有18% NaCl的全合成魯氏接合酵母生長培養(yǎng)基。高溫逆境全合成培養(yǎng)基是含有30%葡萄糖的全合成魯氏接合酵母生長培養(yǎng)基，110 ℃、20 min滅菌。

以上試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Labconco FreeZone 12 L凍干機(jī) 北京中科科爾儀器有限公司；ZXMP-A1230恒溫恒濕箱 上海智城分析儀器制造有限公司；高速冷凍離心機(jī) 艾本德中國有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JY02S紫外分析儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；7890B型氣相色譜 美國安捷倫公司；NanoDrop One C微量分光光度計 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子細(xì)胞的制備和培養(yǎng)條件

在30 ℃靜置培養(yǎng)2 d的魯氏接合酵母種子瓶中加入適量無菌水，輕微振蕩混勻，制成種子細(xì)胞懸液。所有培養(yǎng)條件下的初始OD600nm均為0.5±0.1。除高溫逆境培養(yǎng)溫度為40 ℃外，其他酵母細(xì)胞培養(yǎng)溫度均為30 ℃。所有培養(yǎng)條件下酵母細(xì)胞振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)周期均為200 r/min和120 h。

1.3.2 樣品的處理與檢測

通過測定600 nm波長處的吸光度評判魯氏接合酵母的生長情況[40]。取培養(yǎng)液4 ℃、12 000 r/min離心5 min，上清液和細(xì)胞沉淀分開收集，放入液氮淬滅1 min，－80 ℃保存?zhèn)溆?。酵母?xì)胞壁破碎采用物理破壁方法，具體步驟如下：淬滅后的酵母細(xì)胞泥中加入2 mL 40%乙醇溶液和玻璃珠（濕菌體與玻璃珠質(zhì)量比為1∶5），渦旋振蕩20 min，－4 ℃、8 000 r/min離心5 min。所有上清液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管，－4 ℃、12 000 r/min離心5 min，留上清液。分別取400、500 μL和400 μL上清液至氣相瓶，凍干后用于胞內(nèi)糖類、氨基酸和有機(jī)酸的檢測。硅烷化衍生方案、氨基酸的檢測和有機(jī)酸的檢測及其相應(yīng)氣相色譜條件均參考Wei Yangjian等[41]的方法。硅烷化衍生標(biāo)準(zhǔn)品包括甘油、琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、酮戊二酸、木糖、木糖醇、鼠李糖、檸檬酸/異檸檬酸、果糖、半乳糖、草乙酸、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、油酸酰胺、阿魏酸、芥酸酰胺、蔗糖、乳糖、海藻糖、棉子糖。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺/絲氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。胞內(nèi)外代謝物標(biāo)準(zhǔn)品包括正丁醇、乙偶姻、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸。

1.3.3 逆境下的魯氏接合酵母營養(yǎng)需求分析

考慮到作為蛋白質(zhì)輔基的維生素的重要生理功能，選擇了7 種維生素（硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、鈷胺素和抗壞血酸）添加到培養(yǎng)基中。逆境下的細(xì)胞可能遭遇能量物質(zhì)供給不足，考察7 種能量相關(guān)物質(zhì)（AMP、ADP、ATP、GMP、IMP、GMP和UMP）對魯氏接合酵母細(xì)胞生長能力的影響。作為主要代謝途徑之一的丙酮酸溢流代謝和三羧酸循環(huán)代謝在逆境下的酵母細(xì)胞中代謝活性可能下降，導(dǎo)致有機(jī)酸供給不足，因此，8 種有機(jī)酸也是研究對象之一，包括丙酮酸、丙酸、丁酸、草酰乙酸、反丁烯二酸、檸檬酸、蘋果酸和α-酮戊二酸。同時，基于逆境下酵母細(xì)胞可能出現(xiàn)氨基酸供應(yīng)不足的問題，選擇14 種氨基酸（組氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、半胱氨酸和谷氨酸）添加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中維生素、有機(jī)酸和能量相關(guān)物質(zhì)的終質(zhì)量濃度均為1.0 mg/L。氨基酸終質(zhì)量濃度為4.0 g/L。

1.3.4 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA

無菌條件下收集200 mg濕菌體，放入無RNA酶的2 mL EP管內(nèi)，快速放入液氮中速凍5～10 min，隨后貯存在－80 ℃超低溫冰箱中備用。總RNA提取試劑盒用于提取總RNA。對RNA的濃度和純度進(jìn)行微量分光光度計檢測。采用R23-01逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）條件為50 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃變性5 s。

1.3.5 real-time PCR測定

采用Q711試劑盒進(jìn)行real-time PCR，相關(guān)參數(shù)按照說明書。計算：ΔCt（循環(huán)閾值）＝Ct（目標(biāo)基因）－Ct（管家基因ENO1），－ΔΔCt＝Ct（對照樣品）－ΔCt（循環(huán)閾值）；最終以2－ΔΔCT計算其倍數(shù)變化。內(nèi)參基因為ENO1。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有實驗重復(fù)3 次。使用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析（計算平均值，確定標(biāo)準(zhǔn)差），并使用Origin Pro 2019b及GraphPad Prism 9軟件繪制變化圖。使用SPSS Statistics 23.0軟件確定方差分析的顯著差異。通過標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間，對檢測的有機(jī)酸、氨基酸、糖類物質(zhì)進(jìn)行定性分析；采用內(nèi)標(biāo)法對氣相色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立全合成最低營養(yǎng)生長培養(yǎng)基

為了規(guī)避逆境非必要營養(yǎng)物質(zhì)對代謝分析和基因表達(dá)分析的干擾，同時也為尋找逆境必須營養(yǎng)物提供干凈的背景，以YNB為對照培養(yǎng)基和出發(fā)培養(yǎng)基，選取酵母最適葡萄糖為唯一碳源，以脯氨酸為唯一氮源，采用單因素遞減策略對微量元素進(jìn)行評估，建立魯氏接合酵母最低營養(yǎng)需求的全合成培養(yǎng)基。魯氏接合酵母在全合成培養(yǎng)基中及其不同逆境下的生長曲線如圖1A所示。

圖1 高溫（40 ℃）和高鹽脅迫（18% NaCl）下魯氏接合酵母2013310在全合成培養(yǎng)基中的生長變化（A）和顯微鏡觀察（B）Fig.1 Growth changes of Z.rouxii 2013310 under HTS and HSS (A) and microscopic observation (B) of Z.rouxii 2013310 cultured in complete synthetic medium

魯氏接合酵母2013310在YNB培養(yǎng)基培養(yǎng)120 h的最大OD600nm達(dá)到31.01±0.72，而在全合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h最大OD600nm只有14.22±1.23。同時，該酵母在全合成培養(yǎng)基的高溫和高鹽逆境下培養(yǎng)120 h的最大OD600nm只有2.44±0.13和3.87±0.12。此外，與YNB培養(yǎng)基相似，酵母細(xì)胞在全合成培養(yǎng)基中的生長曲線也顯示出清晰的適應(yīng)期（0～12 h）、增殖期（12～84 h）和穩(wěn)定期（84～120 h）。由此可見，全合成培養(yǎng)基能滿足魯氏接合酵母在正常生理環(huán)境下的生長增殖需求。魯氏接合酵母在高鹽逆境下需要大約36 h適應(yīng)環(huán)境，而在高溫環(huán)境下的適應(yīng)期只有大約2 h。同時，在48 h時，高鹽逆境下的魯氏接合酵母進(jìn)入了對數(shù)生長前期，而高溫下的酵母細(xì)胞在4 h已經(jīng)處于對數(shù)生長前期。可見，該酵母對高溫環(huán)境的適應(yīng)能力比高鹽逆境好。鑒于魯氏接合酵母在兩種逆境下的不同生長曲線，高溫逆境前12 h和高鹽逆境前48 h（適應(yīng)期和對數(shù)生長初期）被用來研究魯氏接合酵母對兩種逆境的響應(yīng)差異。

通過掃描電鏡觀察魯氏接合酵母2013310在全合成培養(yǎng)基及不同逆境下的形態(tài)學(xué)差異（圖1B）。在全合成培養(yǎng)基培養(yǎng)下，魯氏接合酵母菌體主要呈圓形的單細(xì)胞狀態(tài)（與正常狀態(tài)下酵母形態(tài)一致），部分表面有褶皺，有明顯的出芽現(xiàn)象。發(fā)酵24 h后菌體全部呈圓形或橢圓形，表面圓潤飽滿，光滑無褶皺。在高鹽條件下，酵母在48 h對數(shù)前期細(xì)胞縮小，表面出現(xiàn)嚴(yán)重的褶皺變化，大部分呈單細(xì)胞存在。在高溫條件下的酵母在發(fā)酵8 h后，細(xì)胞大小較全合成培養(yǎng)基0 h較為接近，但存在部分細(xì)胞表面出現(xiàn)褶皺，且分布似乎有絮凝的趨勢，這可能與高溫對酵母細(xì)胞壁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響有關(guān)[42]。高鹽脅迫比高溫脅迫對全合成培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下酵母細(xì)胞形態(tài)影響更為顯著；而相對于高溫逆境，該酵母在高鹽條件展現(xiàn)出更高的生長活性。

2.2 魯氏接合酵母逆境條件下的營養(yǎng)需求差異

酵母細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的獲取只有兩條途徑，自身合成或轉(zhuǎn)運(yùn)外源營養(yǎng)物。微生物基因表達(dá)和代謝在逆境下會發(fā)生劇烈變化，對營養(yǎng)物的需求應(yīng)該會發(fā)生相應(yīng)的調(diào)整。考慮到高溫逆境和高鹽逆境可能會關(guān)閉某些營養(yǎng)物的自身合成途徑，使得酵母細(xì)胞對營養(yǎng)物獲取的方式發(fā)生變化，因此，分析全合成培養(yǎng)基中8 種有機(jī)酸、7 種維生素、7 種核苷類物質(zhì)和14 種氨基酸對酵母細(xì)胞生長的影響，將有助于闡明魯氏接合酵母在面對高溫逆境和高鹽逆境時的營養(yǎng)需求差異。

高鹽逆境下的魯氏接合酵母2013310的生長不需要額外有機(jī)酸，但丙酮酸和草酰乙酸卻能促進(jìn)高溫逆境下酵母細(xì)胞的增殖，較對照分別提高了34.5%和24.2%（圖2A）。無論是高鹽還是高溫逆境，魯氏接合酵母2013310對丙酸和正丁酸敏感。這兩種有機(jī)酸幾乎完全抑制了高鹽逆境下酵母細(xì)胞的生長。高溫逆境下，添加丙酸、正丁酸的魯氏接合酵母2013310 OD600nm較對照（OD600nm＝2.81）分別降低了85.1%、74.0%。高鹽逆境下，不同類型維生素對魯氏接合酵母高鹽脅迫下生長無顯著效果（圖2B1）；高溫逆境下，維生素的添加，在整體上促進(jìn)了菌體生長，其中添加硫胺素菌體OD600nm較對照（OD600nm＝2.51）提高了1.47 倍（圖2B2）。不同類型核苷酸在兩種條件下對魯氏接合酵母2013310生長均無顯著影響（圖2C）。

圖2 魯氏接合酵母2013310在高鹽和高溫脅迫下的營養(yǎng)需求Fig.2 Nutritional requirements of Z.rouxii 2013310 under HTS and HSS

氨基酸的添加對高鹽和高溫脅迫下的魯氏接合酵母2013310生長有明顯影響（圖2D）。高鹽逆境下，蛋氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、色氨酸均能緩解菌體所受高鹽脅迫，OD600nm較對照分別提高2.72、3.40、2.73 倍和2.42 倍；高溫逆境下，能緩解細(xì)胞所受脅迫的氨基酸有賴氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、亮氨酸和精氨酸，其OD600nm較對照分別提高52.0%、31.1%、49.2%、34.5%、66.2%、19.4%和57.1%。絲氨酸和半胱氨酸均并不利于魯氏接合酵母2013310耐受高鹽和高溫脅迫。

總體而言，遭遇高鹽壓力的魯氏接合酵母細(xì)胞更需要外源氨基酸，而補(bǔ)充維生素和氨基酸有助于緩解酵母細(xì)胞的高溫壓力。這些結(jié)果也表明，魯氏接合酵母的維生素和氨基酸自我合成代謝被高溫壓力所抑制。同時，谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸是魯氏接合酵母細(xì)胞在兩種環(huán)境壓力下均需要的氨基酸。纈氨酸和蛋氨酸是魯氏接合酵母細(xì)胞在高鹽壓力下生長所需的獨特氨基酸，而賴氨酸、天冬酰胺和精氨酸是高溫壓力下魯氏接合酵母細(xì)胞所需的獨特氨基酸。由于氨基酸是蛋白質(zhì)的重要組成單位[43]，蛋白質(zhì)又參與酶的形成、物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)等[44]，這表明有必要從蛋白層面進(jìn)一步研究魯氏接合酵母對高鹽和高溫壓力響應(yīng)的機(jī)理。

2.3 高鹽和高溫脅迫下魯氏接合酵母胞內(nèi)外代謝物差異

有機(jī)酸具有多重生理功能，也參與了生命體核心代謝途徑，如丙酮酸溢流代謝和三羧酸循環(huán)。在選取的6 種被檢測有機(jī)酸物質(zhì)中，兩種逆境下的魯氏接合酵母2013310細(xì)胞的胞內(nèi)均只有乙酸被檢測到，而且變化過程相似，如圖3所示。乙酸在細(xì)胞生長適應(yīng)前期（高鹽的12 h，高溫的2 h）在細(xì)胞內(nèi)大量積累，最高含量分別達(dá)到（78.60±3.23）μg/g（細(xì)胞干質(zhì)量，下同）和（126.30±10.56）μg/g。在隨后的12 h（高鹽）或2 h（高溫），胞內(nèi)乙酸水平大幅下降，分別降為（19.54±3.56）μg/g（高鹽，24 h）和（38.30±7.02）μg/g（高溫，4 h）。此后，乙酸含量幾乎維持穩(wěn)定。

圖3 高鹽和高溫脅迫下魯氏接合酵母2013310胞內(nèi)外代謝物的差異Fig.3 Differences in intracellular and extracellular metabolites in Z.rouxii 2013310 under HTS and HSS

在高鹽逆境下也只檢測到單一的胞外有機(jī)酸乙酸（圖3B1）。乙酸在生長前期（0～12 h）快速積累并在12 h達(dá)到峰值（（364.09±15.65）μg/L），24 h后乙酸被快速消耗至（117.09±17.01）μg/L（36 h）。在高溫下，除了乙酸，胞外還存在多種有機(jī)酸，包括正丁醇、丙酮、丙酸、丁酸和異丁酸。除乙酸外，5 種有機(jī)酸在培養(yǎng)的前2 h就完成了胞外的積累。乙酸在胞外持續(xù)積累，最大質(zhì)量濃度達(dá)到（566.32±13.76）mg/L（10 h）。乙偶姻是一種酮類物質(zhì)，是魯氏接合酵母在胞外積累的第二大化合物。乙酸代謝可能在魯氏接合酵母長期適應(yīng)高溫高鹽壓力中起著重要的作用，是有機(jī)酸代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。推測乙酸的存在有利于乙酰輔酶A的合成，因為乙酰輔酶A是一種重要的抗逆中間代謝物[45]。同時，考慮到全合成培養(yǎng)基的特點，胞外有機(jī)酸的出現(xiàn)源于胞內(nèi)有機(jī)酸代謝及其分泌。相比于高鹽壓力，糖代謝在高溫壓力下更活躍。可見，魯氏接合酵母針對高鹽和高溫逆境采用了不同的有機(jī)酸代謝策略。無論是高鹽還是高溫脅迫，魯氏接合酵母均不會在胞內(nèi)積累有機(jī)酸，這應(yīng)該是避免有機(jī)酸的傷害，與前面營養(yǎng)需求研究結(jié)果一致。

2.4 高鹽和高溫脅迫下魯氏接合酵母氨基酸代謝的差異

由于本研究使用的是最低營養(yǎng)需求的全合成培養(yǎng)基，除脯氨酸外其他氨基酸只能來自細(xì)胞自身代謝過程。魯氏接合酵母2013310氨基酸代謝對高鹽壓力和高溫壓力的響應(yīng)差異巨大，如圖4所示。鑒于脯氨酸與其他氨基酸在含量上存在巨大差異，胞外脯氨酸的變化未在胞外氨基酸圖中呈現(xiàn)。高鹽壓力下，只檢測到4 種氨基酸（蘇氨酸、異亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）（圖4A1、B1），遠(yuǎn)低于高溫壓力下的7 種氨基酸（脯氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸和蛋氨酸）（圖4A2、B2）。異亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸參與了魯氏接合酵母對高鹽和高溫的響應(yīng)。蘇氨酸只參與高鹽壓力響應(yīng)，脯氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸只參與高溫壓力響應(yīng)。異亮氨酸和脯氨酸分別是高鹽壓力和高溫壓力下酵母胞內(nèi)主要響應(yīng)的氨基酸。高鹽壓力下，異亮氨酸在0～12 h快速積累至（119.34±0.56）μg/g，然后，基本在121.80 μg/g附近波動；高溫條件下，脯氨酸含量在0～6 h快速積累至峰值（（117.30±5.18）μg/g），然后呈下降趨勢。色氨酸和蛋氨酸分別是高鹽壓力和高溫壓力下酵母胞外主要響應(yīng)的氨基酸。高鹽逆境下，培養(yǎng)24 h色氨酸快速累積至（17.97±0.01）μg/L，36 h下降至（7.04±0.01）μg/L；高溫壓力下，甲硫氨酸含量在0～6 h快速累積并在6 h達(dá)到峰值（（197.50±7.48）mg/L），8 h存在小幅下降至（164.10±6.85）mg/L，后維持穩(wěn)定。結(jié)合營養(yǎng)需求差異分析（圖2B2），色氨酸是值得關(guān)注的魯氏接合酵母耐受逆境的氨基酸。

圖4 高鹽和高溫脅迫下魯氏接合酵母胞內(nèi)外氨基酸的差異Fig.4 Differences in intracellular and extracellular amino acids in Z.rouxii 2013310 under HTS and HSS

2.5 高鹽和高溫脅迫下魯氏接合酵母抗逆代謝物的差異

微生物合成抗逆代謝產(chǎn)物來抵御環(huán)境壓力是一種重要的壓力響應(yīng)機(jī)制。如圖5所示，魯氏接合酵母胞內(nèi)糖代謝對高鹽和高溫逆境產(chǎn)生了兩種截然不同的響應(yīng)。高鹽逆境下的魯氏接合酵母細(xì)胞內(nèi)只有鼠李糖和半乳糖（圖5A）。在適應(yīng)初期的12 h，酵母細(xì)胞大量積累鼠李糖，而半乳糖在胞內(nèi)只有少量增加，但二者在24 h下降。進(jìn)入細(xì)胞生長期時，這兩種糖的胞內(nèi)濃度顯著上升。與之不同，高溫逆境下魯氏接合酵母胞內(nèi)存在葡萄糖、海藻糖、木糖醇和甘油（圖5B）。傳統(tǒng)上的抗逆保護(hù)劑（海藻糖和甘油）在魯氏接合酵母胞內(nèi)只有極少量的積累，最大含量分別為（369.00±21.01）μg/g和（268.10±21.18）μg/g（8 h），而木糖醇水平卻顯著上升（（1 788.20±100.56）μg/g，8 h）。這表明對魯氏接合酵母2013310而言，木糖醇，而非海藻糖和甘油，是其高溫壓力下的抗逆保護(hù)劑。Wei Yangjian等[41]的研究也證實了處于穩(wěn)定期的魯氏接合酵母在高溫環(huán)境下會大量合成木糖醇。然而，本研究結(jié)果表明，高鹽壓力下的魯氏接合酵母細(xì)胞內(nèi)沒有葡萄糖。這可能是兩個因素導(dǎo)致的：其一，高鹽下的魯氏接合酵母對外源葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力不強(qiáng)[46]，導(dǎo)致胞內(nèi)葡萄糖濃度處于檢測線之下；其二，對高鹽環(huán)境下的魯氏接合酵母而言，葡萄糖可能并不是最適碳源，胞內(nèi)葡萄糖被快速轉(zhuǎn)化成其他糖類物質(zhì)。全合成培養(yǎng)基中添加木糖醇、海藻糖、甘油對魯氏接合酵母在高鹽環(huán)境下的生長均有促進(jìn)作用，相比空白對照，OD600nm分別提高了115.4%、217.0%、223.9%（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖5 高鹽脅迫（A）和高溫脅迫（B）下魯氏接合酵母2013310糖類代謝物的差異Fig.5 Differences in intracellular carbohydrate metabolites in Z.rouxii under HSS (A) and HTS (B)

2.6 相關(guān)基因在高鹽和高溫脅迫下的時間表達(dá)差異

全局調(diào)控基因在生命體響應(yīng)外界環(huán)境變化中扮演重要角色。營養(yǎng)需求和代謝層面所展示的魯氏接合酵母2013310對高鹽和高溫逆境的響應(yīng)差異說明兩種逆境下的相關(guān)全局調(diào)控基因和抗逆基因表達(dá)存在不同。4 種常見的逆境響應(yīng)調(diào)控基因在兩種逆境下的時序表達(dá)差異如圖6所示。

圖6 魯氏接合酵母2013310相關(guān)基因?qū)Ω啕}逆境和高溫逆境的響應(yīng)Fig.6 Responses of genes in Z.rouxii 2013310 to HTS and HSS

在高鹽逆境下，熱激調(diào)控蛋白基因HSF1表達(dá)量除在24 h下調(diào)29.3%外，其他培養(yǎng)時間的表達(dá)量沒有顯著改變。逆境調(diào)控響應(yīng)基因MSN4以及滲透脅迫響應(yīng)基因HOG1表達(dá)量均在12 h上調(diào)，分別為初始的1.4、1.3 倍。氧化脅迫調(diào)控基因SOD1轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平在整個培養(yǎng)階段均低于初始對照?？梢?，MSN4和HOG1是兩個主要參與魯氏接合酵母對高鹽適應(yīng)生長的調(diào)控基因，且主要在適應(yīng)初期（12 h）發(fā)生響應(yīng)。Dhar等[47]通過對實驗室進(jìn)化所構(gòu)建的耐鹽釀酒酵母中的壓力響應(yīng)基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)MSN4的表達(dá)水平顯著上調(diào)。在對漢斯德巴氏酵母的鹽和氧化壓力進(jìn)行分析時，Laura等[48]發(fā)現(xiàn)用200 mmol/L NaCl處理該酵母10 min已能導(dǎo)致MSN2和HOG1上調(diào)。HOG1蛋白參與基因表達(dá)的現(xiàn)象在極端耐鹽的黑酵母Hortaea werneckii中也能觀察到[49]，這些結(jié)果與魯氏接合酵母相似。雖然高鹽常常被認(rèn)為會引起氧化脅迫，然而魯氏接合酵母細(xì)胞并沒有遭遇氧化脅迫，這可能是研究采用的低營養(yǎng)環(huán)境導(dǎo)致。

在高溫逆境下，熱激調(diào)控蛋白基因HSF1表達(dá)量隨培養(yǎng)時間延長持續(xù)上調(diào)，在12 h上調(diào)到最大值（5.1 倍）。逆境調(diào)控響應(yīng)基因MSN4相對轉(zhuǎn)錄水平在12 h內(nèi)無顯著變化。滲透脅迫響應(yīng)基因HOG1轉(zhuǎn)錄水平隨培養(yǎng)時間延長持續(xù)下調(diào)，2、4、12 h分別下調(diào)41.7%、43.8%、69.3%。氧化脅迫調(diào)控基因SOD1轉(zhuǎn)錄水平在培養(yǎng)2 h上調(diào)至2.3 倍，但隨后上調(diào)水平逐漸回落。可見，除MSN4外，其他3 種調(diào)控基因均參與了魯氏接合酵母對高溫逆境的適應(yīng)。與釀酒酵母HSF1在熱刺激初期大量上調(diào)而后恢復(fù)至正常水平的現(xiàn)象不同[50]，魯氏接合酵母在高溫逆境下持續(xù)增加HSF1表達(dá)用于滿足增殖期間蛋白體系穩(wěn)定的需要。雖然30%葡萄糖達(dá)不到超滲水平，但該濃度對HOG1的表達(dá)產(chǎn)生抑制效應(yīng)，引起了氧化脅迫（SOD1表達(dá)上調(diào)）?？紤]到不同逆境之間存在交聯(lián)關(guān)系[48]，魯氏接合酵母中高溫抑制高滲而激活氧化脅迫的機(jī)理還有待深入研究。

3 結(jié)論

溫度壓力和鹽壓力是魯氏接合酵母在醬油高鹽固態(tài)發(fā)酵過程中遭遇的主要逆境[51]。與其他環(huán)境壓力不同，微生物對這兩種逆境無法通過采用降解壓力因子的方式緩解。本研究基于低營養(yǎng)全合成培養(yǎng)基，在營養(yǎng)、代謝和轉(zhuǎn)錄3 個層面分析了魯氏接合酵母2013310從生長適應(yīng)期到對數(shù)生長初期的高鹽和高溫逆境響應(yīng)。總體而言，該酵母采用了不同的策略來適應(yīng)高溫和高鹽逆境。遭遇高鹽壓力的魯氏接合酵母細(xì)胞更需要外源氨基酸，而補(bǔ)充維生素和氨基酸有助于緩解酵母細(xì)胞的高溫壓力。谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸和乙酸代謝對酵母細(xì)胞適應(yīng)高溫和高鹽逆境極其重要。本研究加深了對耐鹽魯氏接合酵母耐溫機(jī)制的理解。同時，微生物不同抗性之間存在交互作用[52-53]。魯氏接合酵母耐高鹽的特性與對溫度的高敏感性之間的關(guān)聯(lián)性有待研究，這將有助于為雙抗逆新型魯氏接合酵母細(xì)胞株的構(gòu)建提供方向和著力點。