烹飪溫度對(duì)牦牛肉蛋白質(zhì)氧化和體外消化特性的影響

張 燕，李升升,2, ，趙立柱，張強(qiáng)龍

（1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810000；2.國(guó)家牦牛肉加工專業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，青海 西寧 810000）

牦牛（Bos gruniens）是分布于中國(guó)青藏高原及其沿線的特有畜種[1]，能較好地適應(yīng)高寒、低氧及牧草缺乏的地區(qū)。目前，全球約有1 600萬(wàn) 頭牦牛，95%以上的牦牛分布在國(guó)內(nèi)的青海、西藏、甘肅、四川、云南、新疆等地[2]。牦牛肉為高原人提供所需的必需氨基酸、脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等[3-4]，而且青藏高原地區(qū)的人們將牦牛肉作為動(dòng)物蛋白的主要來(lái)源。由于牦牛肉脂肪含量較低，蛋白質(zhì)含量較高，深受消費(fèi)者的歡迎[5]。

肉類在烹飪過(guò)程中，高溫加熱雖然能消滅有害微生物，保證肉類食用的安全性，但同時(shí)也會(huì)生成活性氧等自由基，進(jìn)而攻擊蛋白質(zhì)分子，促使氧化的發(fā)生[6]。因此，肉制品的蛋白質(zhì)在加工過(guò)程中很容易發(fā)生氧化，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，對(duì)其功能特性產(chǎn)生一定影響[7]。許多研究表明肉制品的烹飪會(huì)加劇蛋白質(zhì)氧化的程度，而蛋白質(zhì)氧化程度在消化過(guò)程中會(huì)進(jìn)一步加重[8]。在人體消化過(guò)程中，蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物也會(huì)因消化液中的促氧化劑（pH值、抗壞血酸、鐵離子等）而不斷發(fā)生氧化[9]。目前，直接研究肉類蛋白質(zhì)在人體內(nèi)的消化代謝很困難，所以主要通過(guò)體外模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究[10]。一些學(xué)者通過(guò)對(duì)肉類蛋白進(jìn)行模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，肉制品經(jīng)過(guò)烤制[11]、煮制、蒸制、高壓[12]以及真空烹飪[13]等加工后其肌肉蛋白更容易被消化吸收，顯著提高了蛋白質(zhì)的消化率。但Li Li等[14]對(duì)100 ℃燉煮的豬肉進(jìn)行體外模擬消化后發(fā)現(xiàn)，與原料肉相比，其消化率降低。此外，在消化過(guò)程中蛋白質(zhì)氧化主要表現(xiàn)為蛋白變性和蛋白水解，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性的改變。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在70 ℃甚至更高的溫度條件下烹飪豬肉，會(huì)增加豬肉蛋白的胃蛋白酶水解能力，在長(zhǎng)時(shí)間的消化過(guò)程中，熱處理提高了蛋白質(zhì)的降解能力[15]。綜上所述，肉制品的加工條件會(huì)顯著影響肉制品蛋白的消化性以及在消化過(guò)程中肉蛋白的生物利用率。

目前，關(guān)于牦牛肉制品在胃腸道消化過(guò)程中的消化性以及蛋白質(zhì)氧化的研究較少，為此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬體外胃腸道消化，研究烹飪牦牛肉至不同中心溫度后其肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）氧化程度及消化性的變化，旨在為牦牛肉的精深加工和新產(chǎn)品研發(fā)技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛肉購(gòu)自青海夏華清真肉類食品有限公司。挑選6 頭（36±6）月齡的生長(zhǎng)發(fā)育良好、體況相近的牦牛，宰后采集背最長(zhǎng)肌，在（3±1）℃運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，待用。

牛血清白蛋白 美國(guó)Sigma公司；胃蛋白酶（牛源，酶活力≥3 000 NFU/mg）、胰蛋白酶（牛源，酶活力≥2 500 U/mg）上海源葉生物科技有限公司；三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、5,5’-二巰代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA）、尿素、硫酸亞鐵、碘酸鈉、無(wú)水乙醇、KHPO4、KCl、KHPO4、KOH、MgCl2、甲醇、氯仿、冰醋酸 北京索萊寶科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電磁爐 美的集團(tuán)；家用煮鍋 浙江蘇泊爾股份有限公司；平底鍋 寧波方太廚具有限公司；FSH-II型高速電動(dòng)勻漿機(jī) 江蘇金壇市振興儀器廠；電熱恒溫振蕩水浴鍋 上海一恒科技有限公司；UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)美國(guó)安捷倫公司；DYCZ-24DN型電泳槽、DYY-6C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；2500R凝膠成像儀上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛肉加工

將背最長(zhǎng)肌表面的筋、腱、膜及脂肪剔除，切成6 cm×6 cm×1.5 cm大小的肉樣。平底鍋中加油20 mL，在226～228 ℃條件下煎制，每30 s翻面1 次，肉樣連接K型熱電偶探頭數(shù)顯溫度計(jì)進(jìn)行中心溫度測(cè)定，直至肉樣中心溫度分別為40、50、60、70、80 ℃時(shí)立即取出，吸干表面油漬后冷卻至室溫并稱質(zhì)量，除去表皮放入液氮中速凍待后續(xù)分析[16]。原料肉作為對(duì)照組，所有處理組肉樣一式3 份。

1.3.2 MP提取

參考布鑫榮等[17]的方法并略作修改。將3.0 g肉樣放入8 倍體積磷酸鉀緩沖液（20 mmol/L）中，并在由KCl（0.1 mol/L）、EGTA（2 mmol/L）和MgCl2（2 mmo/L）配制而成的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 6.8）中混勻，1 000×g冷凍離心10 min后保留沉淀，以上操作重復(fù)3 次。用8 倍體積100 mmol/L的KCl溶液將沉淀溶解，1 000×g冷凍離心10 min后繼續(xù)保留沉淀，以上操作重復(fù)2 次，即得MP，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。采用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，x為蛋白質(zhì)量濃度，y為吸光度，牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.476 6x－0.005 3（R2＝0.994）。

1.3.3 體外模擬胃腸消化

參考Yin Yantao等[18]的方法，略作修改。用甘氨酸緩沖液（33 mmol/L，pH 1.8）將MP溶液的質(zhì)量濃度稀釋至4 mg/mL，將2 份制備好的樣品分別與胃蛋白酶（5 U/mg）按照體積比1∶3混合均質(zhì)，一份在37 ℃連續(xù)振蕩孵育90 min模擬胃消化，定量沉淀物質(zhì)量（m1，mg）。剩余的一份用甘氨酸緩沖液（33 mmol/L，pH 8.0）稀釋，按照體積比3∶1的比例與胰蛋白酶（6.6 U/mg）混合均質(zhì)，在37 ℃連續(xù)振蕩孵育1 h模擬腸消化，定量沉淀物質(zhì)量（m2，mg）。

1.3.4 蛋白質(zhì)水解率測(cè)定

將上述1.3.3節(jié)中的m1和m2代入式（1）～（3）分別計(jì)算胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解率及總水解率。

1.3.5 總羰基含量測(cè)定

參考韋婕妤[19]的方法并稍作修改。用100 mmol/L KCl溶液將MP溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為5 mg/mL，取2 份0.5 mL蛋白液，一份加2 mL含體積分?jǐn)?shù)為0.2% DNPH的2 mol/L HCl溶液，另一份加2 mL 2 mol/L HCl溶液作為對(duì)照，室溫避光反應(yīng)1 h（每10 min渦旋振蕩1 次）。分別添加2 mL體積分?jǐn)?shù)為20%三氯乙酸溶液沉淀蛋白，離心（8 000×g，5 min）。沉淀用2 mL乙酸乙酯-乙醇（體積比1∶1）清洗，重復(fù)3 次。分別加3 mL 20 mmol/L PBS（含6 mol/L鹽酸胍，pH 6.5）后置于37 ℃水浴中保溫30 min溶解沉淀，離心（8 000×g，5 min）取上清液，在370 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。按式（4）計(jì)算羰基含量：

式中：A1為370 nm 波長(zhǎng)處吸光度；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ε1為摩爾消光系數(shù)（22 000 mol/（L·cm））。

1.3.6 總巰基含量測(cè)定

參考萬(wàn)紅兵等[20]的方法并稍作修改。用25 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.25）調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL。取0.5 mL依次加入2 mL尿素-SDS溶液（含8.0 mol/L尿素、30 g/L SDS、0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液，pH 7.4）和0.5 mL 10 mmol/L DTNB試劑（含0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液，pH 7.4），室溫靜置反應(yīng)15 min，取上清液在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，25 mmol/L磷酸鉀緩沖液代替蛋白液用于空白對(duì)照。按式（5）計(jì)算總巰基含量：

式中：A2為412 nm波長(zhǎng)處吸光度；ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ε2為摩爾消光系數(shù)（13 600 mol/（L·cm））。

1.3.7 Schiff堿含量測(cè)定

Schiff堿含量的測(cè)定參照Gatellier等[21]的方法。按照蛋白液（1 mg/mL）∶PBS（20 mmol/L）＝1 mL∶20 mL混勻后取上清液進(jìn)行測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫為10 nm，待測(cè)范圍為400～500 nm；所有樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.8 紫外吸收光譜測(cè)定

參考張海璐等[22]的方法并稍作修改。將MP 用10 mmol/L PBS稀釋至1 mg/mL后離心7 000×g，取上清液倒入比色皿中并置于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定，掃描波長(zhǎng)范圍為240～350 nm，掃描速率快速，采樣間隔為2 nm。

1.3.9 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

參考鄭云芳等[23]的方法并稍作修改。用0.6 mol/L PBS將MP溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為0.5 mg/mL，PBS作對(duì)照組，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為295 nm，發(fā)射光譜范圍為300～400 nm。

1.3.10 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）測(cè)定

將各蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液以體積比3∶1比例混合，沸水加熱5 min。制樣完畢后，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的分離膠組成的電泳系統(tǒng)中，每孔加入10 μL樣品，在120 V條件下進(jìn)行電泳操作，結(jié)束后取下膠片，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色1.5 h。用混合溶液（甲醇∶乙酸∶水＝45∶10∶45，V/V）進(jìn)行脫色。最后用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行拍照[20]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 26軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，各組間差異用Duncan多重比較法，結(jié)果用±s表示；采用Origin 2021軟件繪圖；所有統(tǒng)計(jì)分析的顯著水平均為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛肉蛋白質(zhì)消化率變化

如表1所示，采用胃蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解率模擬胃消化率，胰蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解率模擬腸消化率。與原料肉相比，經(jīng)加工后牦牛肉的胃蛋白酶水解率和總蛋白酶水解率均顯著降低（P＜0.05），胰蛋白酶水解率顯著升高（P＜0.05）。隨著中心溫度的升高，胃蛋白酶對(duì)MP的水解率呈先升高后降低的趨勢(shì)，60 ℃時(shí)胃蛋白酶水解率最高達(dá)74.89%。胰蛋白酶水解率隨著中心溫度的升高呈先上升后降低的趨勢(shì)，70 ℃時(shí)水解率最大，為23.37%?？偟鞍姿饴孰S著中心溫度的升高先增大后減小，在60 ℃時(shí)水解率最大（88.64%）。相較于原料肉，80 ℃時(shí)胃蛋白酶水解率和總蛋白酶水解率分別降低了34.10%和22.47%，胰蛋白酶水解率提高了75.34%?？偟鞍姿饴逝c胃蛋白酶水解率變化趨勢(shì)一致，可見(jiàn)蛋白質(zhì)的消化性主要取決于胃蛋白酶水解作用。

表1 不同中心溫度下經(jīng)胃腸消化前后MP消化率變化Table 1 Changes in gastrointestinal digestibility of MP from yak meat cooked to different internal temperatures

上述研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)經(jīng)加工后，在胃腸消化過(guò)程中水解率降低，可能是因?yàn)榧庸た梢哉T導(dǎo)與肌肉蛋白質(zhì)氧化相關(guān)的修飾，從而通過(guò)影響胃蛋白酶的水解位點(diǎn)來(lái)降低其消化率[24]。此外，胃蛋白酶在早期對(duì)蛋白質(zhì)的水解作用較弱時(shí)，胰蛋白酶的降解作用會(huì)增強(qiáng)，這與Santé-Lhoutellier等[25]的研究結(jié)果類似。

2.2 牦牛肉總羰基含量變化

蛋白羰基產(chǎn)物可通過(guò)直接氧化產(chǎn)生或者與脂肪氧化產(chǎn)物發(fā)生加成作用形成[26]，其含量是測(cè)定蛋白氧化程度的重要指標(biāo)之一，反映了蛋白質(zhì)被氧化破壞的程度。一般來(lái)說(shuō)，羰基含量越高，蛋白氧化程度越大[27]。如圖1所示，牦牛肉蛋白質(zhì)經(jīng)胃腸消化前后的總羰基含量均隨中心溫度的升高顯著增大（P＜0.05），且高于原料肉。與原料肉相比，80 ℃時(shí)消化前的蛋白質(zhì)總羰基含量增大了85.16%，經(jīng)胃消化后蛋白質(zhì)的總羰基含量增大了81.42%，經(jīng)腸消化后的總羰基含量增大了77.40%。在相同中心溫度下，腸消化后的總羰基含量高于胃消化后的，消化前的總羰基含量最低。80 ℃牦牛肉蛋白質(zhì)在腸消化后的總羰基含量是胃消化后的1.07 倍，是消化前的1.14 倍。上述結(jié)果表明，MP經(jīng)過(guò)胃腸道消化后總羰基含量顯著升高（P＜0.05），表明消化道的氧化酶和其他促氧化劑進(jìn)一步促進(jìn)了蛋白質(zhì)羰基化，這與Van Hecke等[28]的研究結(jié)果一致。不同烹飪溫度導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化程度的高低決定了其對(duì)肉類消化性的影響。在煎制加工下，肉中的蛋白暴露于油脂中，所以脂質(zhì)氧化促進(jìn)了蛋白質(zhì)氧化引起的羰基含量增加[29]。

圖1 不同中心溫度下經(jīng)消化前后牦牛肉蛋白質(zhì)總羰基含量變化Fig.1 Changes in total carbonyl content of MP from yak meat cooked to different internal temperatures before and after digestion

2.3 牦牛肉蛋白質(zhì)總巰基含量的變化

MP在氧化過(guò)程中其巰基容易轉(zhuǎn)變成二硫鍵，導(dǎo)致巰基含量降低，所以巰基含量也是表示蛋白氧化程度的重要指標(biāo)之一，巰基含量越低代表蛋白質(zhì)氧化程度越高[30]。如圖2所示，隨著中心溫度的升高，牦牛肉MP經(jīng)胃腸消化前后總巰基含量均顯著降低（P＜0.05）。與原料肉相比，80 ℃時(shí)消化前的蛋白質(zhì)總巰基含量降低至（67.79±22.95）nmol/mg，減少了40.33%，經(jīng)胃消化后蛋白質(zhì)的總巰基含量降低了30.02%，經(jīng)腸消化后的總巰基含量降低了36.43%。與消化前相比，經(jīng)胃消化后的樣品總巰基含量顯著增加（P＜0.05），而在腸消化階段總巰基含量又顯著低于消化前（P＜0.05）。

圖2 不同中心溫度下經(jīng)消化前后牦牛肉蛋白質(zhì)總巰基含量變化Fig.2 Changes in total sulfhydryl content of MP from yak meat cooked to different internal temperatures before and after digestion

隨著中心溫度的升高，牦牛肉MP中的總巰基含量不論是消化前還是經(jīng)過(guò)胃腸消化均呈下降趨勢(shì)，可能是當(dāng)溫度持續(xù)升高時(shí)，肌動(dòng)球蛋白構(gòu)象改變，巰基被氧化成二硫鍵，使巰基含量降低[31]。另外，胃消化后的總巰基含量高于消化前的總巰基含量，可能是由于胃蛋白酶作用，使部分水解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露出更多的巰基基團(tuán)并發(fā)生反應(yīng)。在胃消化階段，可能有大量二硫鍵被還原生成巰基，導(dǎo)致巰基含量增加。而腸消化階段總巰基含量降低，猜測(cè)是由于胰蛋白酶水解全部蛋白質(zhì)導(dǎo)致半胱氨酸或含半胱氨酸的短肽顯現(xiàn)。韋婕妤[19]也發(fā)現(xiàn)與消化前相比，羊肉制品在經(jīng)過(guò)模擬胃消化后巰基含量升高，腸消化后巰基含量降低，與本研究結(jié)果一致。

2.4 牦牛肉Schiff堿含量的變化

Schiff堿含量象征著脂肪和蛋白質(zhì)相互作用的程度。Schiff堿類物質(zhì)存在較強(qiáng)的熒光特性，因而可以通過(guò)熒光光譜表征其含量的變化情況[32]。如圖3所示，耗牛肉蛋白質(zhì)不論是消化前還是經(jīng)胃腸消化后，隨中心溫度的升高，代表Schiff堿含量的熒光光譜強(qiáng)度先增大后降低，70 ℃時(shí)其熒光強(qiáng)度最高，尤其是經(jīng)腸消化后其熒光強(qiáng)度達(dá)到了807.9。此外，消化前的熒光光譜在410 nm波長(zhǎng)處附近均出現(xiàn)了一個(gè)峰值，但經(jīng)過(guò)腸消化后其峰值出現(xiàn)了不同程度的紅移。在同一中心溫度下，與消化前相比，經(jīng)過(guò)胃腸消化后的Schiff堿熒光強(qiáng)度均增大，且腸消化后的熒光強(qiáng)度增幅更顯著。

圖3 不同中心溫度下經(jīng)消化前后牦牛肉蛋白質(zhì)Schiff堿含量變化Fig.3 Changes in Schiff base content of MP from yak meat cooked to different internal temperatures before and after digestion

Schiff堿含量隨中心溫度的升高而增大，可能是煎制時(shí)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化產(chǎn)物醛類發(fā)生了相互作用導(dǎo)致大量含Schiff堿的物質(zhì)生成[29]，此結(jié)果與Gatellier等[21]的研究結(jié)果一致。腸消化后的Schiff堿熒光強(qiáng)度相比于胃消化更為劇烈，可能是由于胰蛋白酶在水解蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的過(guò)程中，促使游離脂肪酸與氨基酸形成并相互作用，導(dǎo)致Schiff堿含量增加。此外，峰的位移反映了不同中心溫度會(huì)產(chǎn)生眾多豐富的Schiff堿類物質(zhì)，它們的相互結(jié)合有助于蛋白質(zhì)聚集并對(duì)其消化率產(chǎn)生影響。

2.5 牦牛肉蛋白質(zhì)紫外吸收光譜的變化

紫外吸收光譜的產(chǎn)生是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中包含酪氨酸、色氨酸等具有芳香環(huán)的氨基酸，并且它們的殘基側(cè)鏈基團(tuán)能攝取紫外光，所以通過(guò)紫外吸收光譜表征蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)[33]。由圖4可知，隨著中心溫度的升高，牦牛肉蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。與原料肉相比，當(dāng)中心溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，消化前、胃消化及腸消化的紫外吸收光譜的吸光度分別增大了28.25%、23.98%和23.14%。在同一溫度下，與消化前相比，經(jīng)過(guò)胃、腸消化后其吸光度顯著增強(qiáng)，且腸消化后在274 nm波長(zhǎng)處的特征吸收峰發(fā)生輕微藍(lán)移。80 ℃時(shí)，經(jīng)腸消化后274 nm波長(zhǎng)處的特征吸收峰吸光度是胃消化后的1.03 倍，是消化前的1.10 倍。猜測(cè)是由于胰蛋白酶使MP中的部分氨基酸基團(tuán)結(jié)構(gòu)改變，這與康懷彬等[34]的研究結(jié)果一致。此外，蛋白質(zhì)紫外吸收強(qiáng)度隨中心溫度的升高逐漸增強(qiáng)，可能是由于高溫處理使MP展開(kāi)，越來(lái)越多的芳香族氨基酸如色氨酸和酪氨酸等殘基暴露于蛋白質(zhì)表面，其所處的微環(huán)境由非極性向極性轉(zhuǎn)變[35]。

圖4 不同中心溫度下經(jīng)消化前后牦牛肉蛋白質(zhì)紫外吸收光譜變化Fig.4 Changes in UV absorption spectra of MP from yak meat cooked to different internal temperatures before and after digestion

2.6 牦牛肉蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜的變化

內(nèi)源熒光光譜是監(jiān)測(cè)色氨酸殘基的環(huán)境變化、表征蛋白質(zhì)分子三級(jí)結(jié)構(gòu)的重要技術(shù)手段之一。內(nèi)源熒光光譜強(qiáng)度的變化在一定程度上反映出色氨酸的氧化程度[36]。如圖5所示，隨著中心溫度的升高，MP不論是經(jīng)胃腸消化前還是消化后，其內(nèi)源熒光光譜強(qiáng)度均逐漸降低。當(dāng)中心溫度為80 ℃時(shí)，消化前、胃消化及腸消化后的蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光強(qiáng)度與原料肉相比分別降低了72.16%、72.36%和76.23%。同一中心溫度下，與消化前相比，經(jīng)胃腸消化后的蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜強(qiáng)度降低，且經(jīng)腸消化后更為明顯，80 ℃時(shí)經(jīng)胃腸消化后在330 nm波長(zhǎng)處的最大內(nèi)源熒光光譜強(qiáng)度與消化前相比分別降低了51.59%和74.25%。經(jīng)過(guò)胃腸消化后的內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低，尤其是腸消化后熒光強(qiáng)度下降更明顯，可能是牦牛肉蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)模擬胃腸道消化后氧化加劇，蛋白質(zhì)肽鏈展開(kāi)，使活性基團(tuán)暴露，分子間相互作用力增強(qiáng)后小分子蛋白聚集，導(dǎo)致更多色氨酸殘基被包埋，從而引起內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降[37]。

圖5 不同中心溫度下經(jīng)消化前后牦牛肉蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜變化Fig.5 Changes in endogenous fluorescence spectra of MP from yak meat cooked to different internal temperatures before and after digestion

2.7 牦牛肉蛋白質(zhì)SDS-PAGE的變化

由圖6可知，牦牛肉烹飪至不同中心溫度后其MP結(jié)構(gòu)發(fā)生降解與聚集。隨著中心溫度的升高，會(huì)造成長(zhǎng)鏈蛋白發(fā)生不同程度的斷裂，短鏈蛋白相對(duì)含量進(jìn)一步增加[38]。通過(guò)對(duì)圖6分析可知，出現(xiàn)分子質(zhì)量由大到小的肌球蛋白（100 kDa）、肌動(dòng)蛋白（43 kDa）、原肌球蛋白（35 kDa）、肌球蛋白輕鏈（10～30 kDa）條帶。

圖6 不同中心溫度下經(jīng)胃腸消化前后MP的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE patterns of MP from yak meat cooked to different central temperatures before and after gastrointestinal digestion

消化前，隨著中心溫度的升高，在245～100 kDa范圍內(nèi)的電泳條帶均逐漸模糊至消失，α-肌動(dòng)蛋白（100 kDa）條帶隨著溫度的升高逐漸變淺，由此可推測(cè)蛋白質(zhì)在較低烹飪溫度下發(fā)生適當(dāng)氧化，其結(jié)構(gòu)得以適當(dāng)修飾。43 kDa處的肌動(dòng)蛋白條帶略有降解，但沒(méi)有明顯的變化趨勢(shì)，說(shuō)明肌動(dòng)蛋白具有熱穩(wěn)定性，且其熱穩(wěn)定性明顯高于肌球蛋白，Tornberg[39]研究發(fā)現(xiàn)，在雞肉加熱過(guò)程中，肌動(dòng)蛋白電泳條帶比肌球蛋白消失得更慢，與本研究結(jié)果一致。此外，35～48 kDa范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)條帶數(shù)量增加，說(shuō)明此時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生了降解，陳春梅等[40]研究發(fā)現(xiàn)在不同蒸煮溫度下的羊肉MP在36～55 kDa之間也出現(xiàn)降解情況。20 kDa的條帶幾乎消失，這表明在氧化過(guò)程中羥自由基對(duì)肽鏈的進(jìn)攻能夠使其某些部位發(fā)生斷裂，從而產(chǎn)生蛋白亞基，這也說(shuō)明了氧化一定程度對(duì)蛋白質(zhì)具有降解作用。

經(jīng)胃消化后，原料肉蛋白質(zhì)在分子質(zhì)量75 kDa處的條帶還清晰可見(jiàn)。隨著中心溫度的升高，在135 kDa處所對(duì)應(yīng)的條帶比較模糊甚至消失。表明煎制誘導(dǎo)肌球蛋白重鏈?zhǔn)軣嵫趸?，使蛋白質(zhì)部分結(jié)構(gòu)展開(kāi)，被胃蛋白酶水解成小分子蛋白，易于被消化吸收。經(jīng)腸消化后，原料肉蛋白質(zhì)在分子質(zhì)量25～75 kDa范圍內(nèi)的條帶可見(jiàn)。隨著中心溫度的升高，除50 ℃和80 ℃處理組在25 kDa處出現(xiàn)條帶外，各處理組均無(wú)可見(jiàn)條帶。由于蛋白質(zhì)在胰蛋白酶的作用下被大量水解，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被徹底破壞，所以不可能出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集，阻止蛋白酶與酶切點(diǎn)結(jié)合的現(xiàn)象，從而造成腸消化后電泳圖無(wú)條帶的現(xiàn)象。在25 kDa或更低的分子質(zhì)量處看到模糊的泳道，有可能是蛋白質(zhì)被胰蛋白酶充分水解成小段的肽，導(dǎo)致短肽無(wú)法繼續(xù)被水解。SDS-PAGE結(jié)果顯示了MP的交聯(lián)與聚集，表明經(jīng)過(guò)胃腸消化后的蛋白質(zhì)再次氧化后其降解作用更強(qiáng)。

3 結(jié)論

經(jīng)烹飪后的牦牛肉蛋白質(zhì)消化率隨溫度的升高呈總體下降趨勢(shì)，主要與蛋白質(zhì)的氧化及結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。在模擬胃腸道消化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，隨著烹飪溫度的升高，蛋白質(zhì)氧化程度逐漸加劇，蛋白質(zhì)肽鏈展開(kāi)，導(dǎo)致表征蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的芳香族氨基酸及活性基團(tuán)暴露，且在腸消化階段更明顯。其次，烹飪后的蛋白質(zhì)在胃腸道消化過(guò)程中的水解導(dǎo)致大量游離氨基酸顯現(xiàn)，間接催化了蛋白質(zhì)的氧化。后續(xù)可以通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等方法開(kāi)展牦牛肉在消化過(guò)程中蛋白質(zhì)、脂肪動(dòng)態(tài)變化及其消化規(guī)律的深入研究。此外，可以在烹飪牦牛肉過(guò)程中添加一些天然抗氧化劑，增添牦牛肉產(chǎn)品的風(fēng)味，保證產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。