IL-6、STAT3和Cyclin D1在結(jié)直腸腺癌組織中表達(dá)及臨床意義

申東洋,趙 帥,尚 靜,陶月佳,宋小萍,黃允寧

結(jié)直腸癌(CRC)是全球第三大惡性腫瘤,其癌癥死亡率居全球第二。2020年全球新增193萬結(jié)直腸癌病例,死亡病例約94萬例。針對高發(fā)病率和致死率的結(jié)直腸癌,雖然現(xiàn)有的檢查和治療可以實現(xiàn)診治,達(dá)到降低死亡率的效果,但對于發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的晚期腫瘤卻收效甚微,因此從分子學(xué)角度尋找預(yù)后標(biāo)志物迫在眉睫。惡性腫瘤是一類機體細(xì)胞不受調(diào)控而發(fā)生惡性增殖的疾病,其與細(xì)胞周期失調(diào)密切相關(guān),而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)則在多種惡性腫瘤(如胃癌)中存在異常高表達(dá)[1-3]。炎癥與腫瘤反應(yīng)密切相關(guān)[4],炎癥細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素6(IL-6)通過信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)激活靶基因的轉(zhuǎn)錄,可影響機體細(xì)胞的增殖、凋亡等多種生命活動,其中這些因子異常表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。本研究主要探討IL-6、STAT3 和Cyclin D1在結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)情況,并分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2014—2016年在寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院進(jìn)行結(jié)直腸腺癌根治術(shù)患者80例,病例及隨訪資料完整。術(shù)前均未接受放、化療且未患其他惡性腫瘤。其中男性50例,女性30例,男女比例1∶0.6;年齡32～93歲,平均年齡(66.5±11.5)歲。本研究分析結(jié)直腸腺癌組織中IL-6、STAT3 和Cyclin D1表達(dá)分別與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期的關(guān)系。預(yù)后分析,80例研究對象中死亡35例,其中男性24例,女性11例,年齡32～93歲,平均生存期為17.9個月。本研究已通過寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 方法與判讀 采用免疫組織化學(xué)法檢測癌和癌旁組織中IL-6、STAT3、Cyclin D1表達(dá)用到的抗體有兔抗人IL-6單克隆抗體(濃度1∶400,abcam公司);兔抗人STAT3 多克隆抗體和兔抗人Cyclin D1多克隆抗體(濃度1∶200,Bioss公司)。將3 μm組織切片經(jīng)枸櫞酸鈉(pH為6.0)抗原修復(fù)10 min,一抗4 ℃過夜,二抗(兔超敏二步法試劑,中杉金橋公司)室溫孵育1 h,DAB顯色1.5 min,蘇木素復(fù)染封片。IL-6、STAT3和Cyclin D1主要定位于細(xì)胞核、細(xì)胞漿,呈淺黃至棕褐色。病理醫(yī)師雙盲閱片,觀察目標(biāo)細(xì)胞染色強度并計算陽性細(xì)胞百分比。染色強度方面,不著色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;陽性細(xì)胞率<25%為1分,25%～50%為2分,51%～75%為3分,陽性細(xì)胞率>75%為4分。2項分值相乘后,結(jié)果在0～7分為低表達(dá)(-),8～12 分為高表達(dá)(+)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件,相關(guān)性采用 Spearman分析;生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗,多因素分析采用Cox比例風(fēng)險模型;以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-6、STAT3和Cyclin D1在CRC及癌旁組織中的表達(dá) CRC組織中IL-6、STAT3和Cyclin D1陽性表達(dá)率分別為53.8%(43/80)、63.8%(51/80)、62.5%(50/80),這均明顯高于癌旁組織的32.5%(26/80)、25.0%(20/80)、15.0%(12/80),兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見表1與圖1(目次后)。

表1 IL-6、STAT3和Cyclin D1在結(jié)直腸腺癌和癌旁組織的表達(dá)

2.2 CRC組織中 IL-6、STAT3和Cyclin D1表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 IL-6表達(dá)與患者的性別、年齡、腺癌部位、腫瘤大小、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期均無關(guān)(P>0.05);STAT3表達(dá)與患者的性別、年齡、腺癌部位、腫瘤大小、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05),而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)(P<0.05);Cyclin D1表達(dá)與患者的性別、年齡、腺癌部位、腫瘤大小、腫瘤分化程度無關(guān),而與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)(P<0.05),見表2。

表2 在CRC中 IL-6、STAT3和Cyclin D1表達(dá)與臨床病理的關(guān)系[n(%)]

2.3 CRC組織中IL-6、STAT3、Cyclin D1表達(dá)的關(guān)系 在CRC組織中IL-6與STAT3表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.270,P<0.05);STAT3和Cyclin D1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.300,P<0.05);IL-6和Cyclin D1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.369,P<0.05)。

2.4 CRC組織中IL-6、STAT3和Cyciln D1表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系 在CRC組織中,IL-6和STAT3表達(dá)陽性組與陰性組患者術(shù)后總生存期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖2A、B(目次后);Cyciln D1陰性組患者的術(shù)后總生存期明顯長于Cyciln D1陽性組(P<0.05),見圖2C(目次后)。

2.5 影響CRC患者預(yù)后的相關(guān)因素分析 80例CRC患者的單因素分析表明,腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、Cyclin D1表達(dá)是影響結(jié)直腸腺癌預(yù)后的危險因素(P<0.05),而患者的性別、年齡、腫瘤部位及其大小、IL-6、STAT3均不是影響結(jié)直腸腺癌預(yù)后的危險因素(P>0.05)。多因素分析表明,腫瘤的分化程度、Cyclin D1表達(dá)是影響結(jié)直腸腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05);腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期則不是影響結(jié)直腸腺癌預(yù)后的獨立危險因素(P>0.05),見表3。

表3 80例CRC患者的單因素及多因素預(yù)后分析[n(%)]

2.6 生物學(xué)數(shù)據(jù)庫中Cyclin D1表達(dá)分析 本研究評估來自GEPIA及UALCAN數(shù)據(jù)庫的結(jié)腸癌(COAD)和直腸癌(READ)研究中Cyclin D1轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)COAD和READ中的Cyclin D1轉(zhuǎn)錄水平顯著高于正常組織(P<0.05),見圖3(目次后)。

2.7 生物學(xué)數(shù)據(jù)庫中IL-6、STAT3、Cyclin D1表達(dá)的關(guān)系 本研究評估來自GEPIA及UALCAN數(shù)據(jù)庫中IL-6、STAT3、Cyclin D1表達(dá)的關(guān)系顯示,在CRC中IL-6和STAT3表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05);STAT3和Cyclin D1表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。

3 討論

結(jié)直腸癌起源于腸黏膜上皮的消化道腫瘤,它也是全球癌癥相關(guān)死亡的元兇之一。IL-6在腫瘤微環(huán)境中通過激活GP130/JAK/STAT3信號通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和免疫逃逸[6],阻斷其通路可實現(xiàn)抗癌特性[7-9]。IL-6過表達(dá)常見于胃癌、食管癌等[10-11]。關(guān)于IL-6表達(dá)的部分預(yù)后研究相互矛盾,如有研究稱IL-6過表達(dá)患者預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高,而低表達(dá)患者則預(yù)后更好[12];另有報道IL-6與腫瘤臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān),但與預(yù)后無關(guān)[13];還有認(rèn)為IL-6與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān),但與分期及預(yù)后無關(guān)[14]。這些矛盾結(jié)果可解釋為：①檢測IL-6表達(dá)的方法及閾值不同;②腫瘤的進(jìn)展是復(fù)雜的動態(tài)過程,IL-6表達(dá)受多種因素影響。本研究表明,IL-6在CRC中高表達(dá),但與患者臨床病理特征及預(yù)后無關(guān)。即使CRC組織中IL-6水平升高,其促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用也仍需進(jìn)一步研究。

STAT3是STAT家族中兼具信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及激活轉(zhuǎn)錄雙重功能的關(guān)鍵成員,其負(fù)責(zé)向細(xì)胞核傳遞信號,調(diào)節(jié)基因表達(dá),如細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)等[15]。在胰腺癌、胃癌中,STAT3促進(jìn)腫瘤進(jìn)展、致使預(yù)后不良[16-18],因此STAT3成為抗癌藥物研究靶點[19]。本研究發(fā)現(xiàn),STAT3在癌組織中過表達(dá),且與腫瘤的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),表明STAT3與腫瘤進(jìn)展有關(guān)。在結(jié)直腸癌模型中,升高IL-6水平可構(gòu)成性激活STAT3,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和體積增大[5],而降低IL-6水平可抑制STAT3激活,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[20]。本研究相關(guān)性分析顯示IL-6與STAT3在CRC中表達(dá)呈正相關(guān)。這些研究結(jié)果表明,IL-6和STAT3共同參與CRC的進(jìn)展過程。

細(xì)胞周期蛋白與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān),且在多種實體瘤中過表達(dá),如乳腺癌、甲狀腺癌等[21-22]。有研究發(fā)現(xiàn),靶向Cyclin D1可有效治療CRC[23]。Cyclin D1在CRC中高表達(dá),且與腫瘤臨床特征密切相關(guān)[24]。UALCAN數(shù)據(jù)庫顯示,CRC中的Cyclin D1水平顯著高于正常組織,且在基于疾病分期、體重、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的亞組分析中,也顯著高于健康人群。本研究中,Cyclin D1在CRC中過表達(dá),且與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)。生存分析顯示,腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期只是影響患者預(yù)后的主要因素,而腫瘤分化程度和Cyclin D1則是影響患者預(yù)后的獨立危險因素,即腫瘤低分化患者的死亡風(fēng)險升高2.133倍;Cyclin D1過表達(dá)患者死亡風(fēng)險升高2.353倍。本研究相關(guān)性分析顯示,STAT3與Cyclin D1的表達(dá)呈正相關(guān),這與數(shù)據(jù)庫驗證結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn),激活STAT3信號可過表達(dá)Cyclin D1并增強細(xì)胞活力[25],分析其原因可能是活化的STAT3促進(jìn)Cyclin D1表達(dá),共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的過程。

綜上所述,IL-6、STAT3和Cyclin D1在結(jié)直腸腺癌中過表達(dá)。IL-6與STAT3的表達(dá)呈正相關(guān),STAT3與Cyclin D1的表達(dá)呈正相關(guān)。Cyclin D1是影響結(jié)直腸腺癌預(yù)后的獨立危險因素。因此,Cyclin D1可以作為判斷結(jié)直腸腺癌臨床進(jìn)展及預(yù)后的指標(biāo),具有研究價值。