mRNA核苷堿基修飾開啟疫苗新時代

郭曉強(qiáng)

疫苗接種是大多數(shù)傳染病和部分慢性?。ㄈ鐚m頸癌等）預(yù)防的首選方法，成敗關(guān)鍵依賴于高效疫苗的研制和應(yīng)用。1980年代前，滅活疫苗和減毒疫苗是主要的應(yīng)用類型。隨著生物技術(shù)的出現(xiàn)和快速發(fā)展，亞單位疫苗、病毒載體疫苗和病毒顆粒樣疫苗等先后出現(xiàn)，種類繁多的疫苗為人類健康的保駕護(hù)航發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。新型冠狀病毒感染（COVID-19）暴發(fā)后，疫苗應(yīng)用更是在緩解疫情、減少傷亡中體現(xiàn)出難以估量的價值，其中新出現(xiàn)的mRNA疫苗尤為突出。

明星分子

1953年，雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出確立了DNA遺傳分子的中心地位；1957年底，克里克提出描述遺傳信息傳遞的中心法則，認(rèn)定某種RNA在將DNA信息傳遞給蛋白質(zhì)過程中發(fā)揮著中介作用，這種RNA被命名為信使RNA（messenger RNA， mRNA）；1961年，布雷內(nèi)（S. Brenner）等利用細(xì)菌脈沖標(biāo)記實驗發(fā)現(xiàn)了mRNA，開啟了對它的研究歷程[1]。mRNA在體內(nèi)為蛋白質(zhì)編碼、遺傳密碼解析的成果獲得1968年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎；遺傳信息從DNA傳遞到RNA（重點在mRNA）稱為轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄過程的結(jié)構(gòu)解析成果獲得2006年諾貝爾化學(xué)獎；遺傳信息從mRNA到蛋白質(zhì)稱為翻譯，該過程的結(jié)構(gòu)解析成果獲得2009年諾貝爾化學(xué)獎。所以，mRNA可謂名副其實的明星分子。

1980年代，mRNA開始被應(yīng)用于體外研究并探索其醫(yī)學(xué)應(yīng)用。1984年，梅爾頓（D. Melton）等在實驗室里完成RNA體外轉(zhuǎn)錄（in vitro transcribed， IVT），為將來的應(yīng)用打開了第一扇成功之門。1987年，馬龍（R. Malone）采用脂質(zhì)體包裹策略，將體外轉(zhuǎn)錄的mRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞并成功翻譯出蛋白質(zhì)。1990年，沃爾夫（J. A.Wolff）等首次將體外轉(zhuǎn)錄mRNA注射到小鼠肌肉并表達(dá)出蛋白質(zhì)。1992年，吉里科夫斯基（G. Jirikowski）等在小鼠模型上證明體外轉(zhuǎn)錄mRNA可有效治療糖尿病。這一系列成果說明了mRNA應(yīng)用的理論可行性。

然而，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，體外轉(zhuǎn)錄的mRNA存在激發(fā)機(jī)體先天免疫（導(dǎo)致不良反應(yīng)）、易降解（穩(wěn)定性差）、體內(nèi)表達(dá)效率低（效果不佳）等諸多缺陷，從而限制了mRNA的實用性。許多科學(xué)家和藥物公司多次嘗試無果后，紛紛放棄而轉(zhuǎn)向其他方向，直到2023年兩位諾貝爾獎獲得者的突破性發(fā)現(xiàn)，mRNA的應(yīng)用才出現(xiàn)了巨大轉(zhuǎn)機(jī)。

艱難探索

考里科（K. Karikó）是一位出生于匈牙利的生物化學(xué)家，1982年從匈牙利科學(xué)院塞格德生物中心獲得博士學(xué)位，1985年來到美國天普大學(xué)開展博士后研究，1990年加入賓夕法尼亞大學(xué)開啟獨立科研生涯?？祭锟埔恢睂RNA情有獨鐘，并對其應(yīng)用前景充滿信心，積極嘗試申請科研基金以支持自己的進(jìn)一步研究。遺憾的是屢戰(zhàn)屢敗，但從未氣餒的她仍堅持年年申請，中間經(jīng)歷了身體狀況不佳、實驗進(jìn)展不順、學(xué)校待遇下降等諸多困難，不屈的性格使她從未放棄，直到1998年才獲得第一筆科研經(jīng)費，為自己建立mRNA研究平臺提供了資金保證。

由于經(jīng)費有限，年近半百的考里科不得不親自做實驗?？祭锟葡到y(tǒng)研究了體外轉(zhuǎn)錄出的多種mRNA一級結(jié)構(gòu)，以確定它們在細(xì)胞和組織內(nèi)的最佳表達(dá)條件：她將特定mRNA（如編碼尿激酶型纖溶酶原激活物受體）遞送到體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)可立即實現(xiàn)蛋白質(zhì)的大量表達(dá)；她將編碼熒光素酶的mRNA借助脂質(zhì)體輸送到大鼠腦中也得到高效表達(dá)，且在mRNA的3末端添加多聚腺嘌呤可顯著提升蛋白質(zhì)表達(dá)量。這些成果使考里科更堅信mRNA的應(yīng)用前景是光明的，但對真正阻礙mRNA應(yīng)用的瓶頸問題（如免疫原性），一直無法解決。

科研摯友

1997年，考里科在一次復(fù)印論文時偶遇剛到賓夕法尼亞大學(xué)不久的免疫學(xué)家韋斯曼（D. Weissman），交談中雙方都對彼此的研究內(nèi)容很感興趣，并開始合作研究。

韋斯曼是一位美國本土的免疫學(xué)家，1987年從波士頓大學(xué)獲得免疫學(xué)和微生物學(xué)博士學(xué)位，隨后進(jìn)入美國國立衛(wèi)生研究院開展博士后研究，重點關(guān)注人類免疫缺陷病毒（HIV）感染免疫細(xì)胞的機(jī)制，希望開發(fā)出有效疫苗。1997年，韋斯曼在賓夕法尼亞大學(xué)成立研究小組，最初準(zhǔn)備研發(fā)預(yù)防HIV和流感的DNA疫苗，了解到考里科在mRNA方面的工作后，他果斷轉(zhuǎn)向mRNA疫苗研究。

考里科和韋斯曼的合作堪稱集天時、地利、人和于一體，他們的成功有點水到渠成的感覺。

天時方面，從1990年代開始，斯坦曼（R. Steinman）發(fā)現(xiàn)樹突細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的重要性，并得到科學(xué)界普遍認(rèn)可，斯坦曼因此分享了2011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎的一半獎金，樹突細(xì)胞成為韋斯曼等開展免疫學(xué)研究的重要實驗材料；1996年，霍夫曼（J. Hoffmann）在果蠅中首先鑒定出天然免疫中能識別不同病原體的Toll樣受體（Toll-like receptor， TLR），兩年后巴特勒（B. Beutler）克隆出第一個哺乳動物的TLR，兩人因此分享2011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎另外的一半獎金，TLR識別是mRNA產(chǎn)生免疫原性的重要原因，這兩項成果為后續(xù)的突破奠定了重要基礎(chǔ)。

地利方面，兩人在同一學(xué)校，可隨時溝通實驗進(jìn)展和遇到的問題，保證實驗順利進(jìn)行。人和方面，兩人性格都非常隨和，關(guān)鍵是專業(yè)上互補(bǔ)性強(qiáng)，考里科有生物化學(xué)專業(yè)背景，熟悉mRNA的制備和改造，韋斯曼有免疫學(xué)背景，精于免疫機(jī)制研究，他們面臨的首要問題是消除mRNA的免疫原性。

考里科首先合成了一系列mRNA，韋斯曼將這些mRNA轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞，結(jié)果樹突細(xì)胞腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor， TNF-α）等炎癥因子的合成和釋放量顯著增加，說明樹突細(xì)胞被高度激活了。這一結(jié)果的重要性還在于，它提供一個非常理想的操作系統(tǒng)，相比動物實驗，樹突細(xì)胞測試mRNA的免疫原性既快速又價廉，這大大加快了研究步伐。

樹突細(xì)胞存在多種TLR，它們可感知不同外源物進(jìn)而激活下游信號，如TLR3可由雙鏈RNA激活，TLR9由DNA觸發(fā)。他們進(jìn)一步證實了體外轉(zhuǎn)錄mRNA通過識別TLR3等激活樹突細(xì)胞[2]，下一關(guān)鍵問題是如何規(guī)避這種激活效應(yīng)。

重大突破

2004年，考里科和韋斯曼測試了不同來源的RNA對樹突細(xì)胞的激活作用，結(jié)果迥異。體外轉(zhuǎn)錄的RNA和細(xì)菌RNA可激活樹突細(xì)胞，而作為對照的哺乳動物tRNA則幾乎對樹突細(xì)胞沒有任何影響。 tRNA和其他類型RNA的最大區(qū)別在于其存在廣泛的核苷修飾（修飾核苷數(shù)量可達(dá)總核苷數(shù)量25%），因此他們推測通過修飾核苷可能會消除對樹突細(xì)胞的激活。為驗證這一假說，他們將多種修飾核苷，如假尿苷（Ψ）、5-甲基胞苷（m5C）、5-甲基尿苷（m5U）、N6-甲基腺苷（m6A）和2-硫尿苷（s2U）等摻入體外轉(zhuǎn)錄合成的mRNA，然后測試這些修飾后的mRNA對樹突細(xì)胞的激活效應(yīng)，結(jié)果出現(xiàn)明顯差異。相比較于未修飾mRNA，摻入m5C和m6A對樹突細(xì)胞釋放TNF-α無顯著影響，而摻入m5U、s2U或Ψ則幾乎完全消除了TNF-α的生成，這意味著對尿苷的修飾可能是最佳選擇。這一重要結(jié)果表明體外轉(zhuǎn)錄mRNA經(jīng)過對其特定核苷的修飾，竟然能起到對樹突細(xì)胞的隱身效果，尤其用Ψ替代體外轉(zhuǎn)錄mRNA中相應(yīng)的尿苷（uridine，U）可實現(xiàn)在不影響編碼序列的前提下，消除免疫原性。

2005年，考里科和韋斯曼將實驗結(jié)果發(fā)表在《免疫》（Immunity）雜志上[3]，為mRNA的應(yīng)用掃清了一個重要障礙，成為具有里程碑意義的成果。

砥礪前行

然而，這一重大突破在當(dāng)時并未引起過多的關(guān)注，但考里科和韋斯曼繼續(xù)在該領(lǐng)域深入探索，以解決更多實際問題。

考里科研究發(fā)現(xiàn)，核苷修飾（Ψ替代U）后的體外mRNA不再與TLR結(jié)合，即使結(jié)合也無法激活下游炎癥信號，從而無法啟動對mRNA的降解，這樣可增加mRNA在細(xì)胞內(nèi)的存留時間，進(jìn)而增加翻譯效率[4]。因此，核苷修飾的mRNA一方面可以消除先天免疫，另一方面還增加了體內(nèi)表達(dá)效率，可謂“一箭雙雕”。他們還將核苷修飾的mRNA遞送到小鼠脾臟，發(fā)現(xiàn)確實可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加和免疫激活降低的雙重效果，這一發(fā)現(xiàn)為未來的治療應(yīng)用提供了重要佐證。

體外合成的單鏈mRNA通常無法避免一定量的雙鏈RNA污染，而雙鏈RNA可被細(xì)胞TLR識別引發(fā)免疫應(yīng)答?？祭锟茷榇瞬捎酶咝б合嗌V法（HPLC）去除雙鏈RNA并獲得高純凈度的單鏈mRNA[5]。這種操作既減少炎癥因子生成，又增加蛋白質(zhì)翻譯效率（10～1000倍），為mRNA的應(yīng)用進(jìn)一步掃清了障礙。

2012年，考里科將編碼促紅細(xì)胞生成素（EPO）的人工合成修飾mRNA注射到小鼠體內(nèi)，6小時后小鼠血清中EPO含量開始迅速升高，一段時間后網(wǎng)織紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞數(shù)量也顯著增加。隨后，在非人靈長類動物實驗上也獲得類似結(jié)果。這說明mRNA具有用作蛋白藥物臨床治療的可行性。

韋斯曼和考里科對mRNA核苷修飾技術(shù)進(jìn)行了多方面改進(jìn)，大大提升其實用性[6]：利用脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticle， LNP）遞送mRNA；采用1-甲基假尿苷（m1Ψ）代替尿苷（這是新冠病毒疫苗研發(fā)的基礎(chǔ)）；對mRNA在疫苗應(yīng)用中的潛力也做了進(jìn)一步探索。

2017年，韋斯曼開發(fā)出針對寨卡病毒（Zika virus）包膜糖蛋白的mRNA疫苗，該疫苗在人體內(nèi)可產(chǎn)生強(qiáng)大而持久的中和抗體反應(yīng)[7]。由于寨卡病毒疫情暴發(fā)在2013年，當(dāng)時只有零星病例，因此無法開展有價值的臨床試驗。2018年，韋斯曼和考里科等進(jìn)一步聯(lián)合開發(fā)HIV和流感的mRNA疫苗，動物實驗顯示這類疫苗表現(xiàn)出強(qiáng)烈且持久的保護(hù)作用。這一系列重要進(jìn)展確立了mRNA作為疫苗的可行性，但鑒于是新興疫苗，因此尚待嚴(yán)格臨床實驗以確定其安全性和有效性。

為加快mRNA應(yīng)用，一些生物技術(shù)公司先后成立。2006年，韋斯曼和考里科親自創(chuàng)立mRNA應(yīng)用公司RNARx，申請了多項mRNA核苷修飾方面的專利，雖然后續(xù)發(fā)展并不順利，但卻鼓舞了越來越多的研究人員進(jìn)入該領(lǐng)域。2008年，德國生物制藥新技術(shù)公司（BioNTech）成立，目標(biāo)是開發(fā)癌癥個體化mRNA疫苗。2010年，美國莫德納公司（Moderna）成立，公司名字本身就是修飾mRNA（modified mRNA）兩個單詞的縮寫。遺憾的是，mRNA的實際應(yīng)用卻遲遲沒有到來，許多公司都放棄了研發(fā)，這種情況下仍能苦苦支撐下來的公司無疑承擔(dān)著巨大的壓力。

大顯身手

2020年初，新型冠狀病毒感染的突然暴發(fā)打破了mRNA應(yīng)用的平靜。為應(yīng)對日趨嚴(yán)重的流行病形勢，亟需高效疫苗的出現(xiàn)，此時，mRNA修飾技術(shù)的價值開始顯現(xiàn)。

2020年1月，中國科學(xué)家公布了新冠肺炎病毒（SARS-CoV-2）基因組序列，莫德納公司、生物制藥新技術(shù)公司和美國輝瑞公司立即啟動mRNA疫苗研制計劃。首先設(shè)計出基于SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA序列（用m1Ψ代替相應(yīng)的U）；進(jìn)一步體外轉(zhuǎn)錄出攜帶修飾核苷的mRNA并包裝入LNP，轉(zhuǎn)入體內(nèi)后可檢測到大量針對刺突蛋白的中和抗體，初步證明有效性；最后采用嚴(yán)格生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)制備出疫苗（莫德納公司生產(chǎn)的疫苗名為mRNA-1273，生物制藥新技術(shù)公司和輝瑞公司生產(chǎn)的疫苗名為BNT162b2），隨后開啟一系列臨床試驗，Ⅲ期臨床結(jié)果顯示，這兩種疫苗保護(hù)效率均達(dá)到90%以上[8]。隨后在美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）緊急使用授權(quán)的前提下，這兩種修飾mRNA疫苗迅速在2020年底投入使用。

新型冠狀病毒mRNA疫苗通常在上臂通過肌肉注射，攜帶修飾mRNA的LNP進(jìn)入人體后，通過淋巴引流到達(dá)淋巴結(jié)，被樹突細(xì)胞吸收并翻譯出刺突蛋白，刺突蛋白被進(jìn)一步遞呈給B細(xì)胞和T細(xì)胞，隨后啟動免疫應(yīng)答。免疫細(xì)胞擁有記憶功能，待真正的新冠病毒感染時，可及早啟動保護(hù)作用，將病毒危害降到最低，同時也避免了病毒傳播。由于新冠病毒是一種全新病毒，首次產(chǎn)生免疫應(yīng)答較弱，因此需間隔兩周后再次注射疫苗，方可真正體現(xiàn)保護(hù)作用。

相較傳統(tǒng)疫苗，mRNA疫苗具有自己獨特的優(yōu)勢：工藝簡單、耗時短；安全性高；適應(yīng)性好（對于易突變病毒，新疫苗研制較快，且可以多種亞型疫苗同時應(yīng)用）[9]。

與此同時，其他幾種類型的SARS-CoV-2疫苗也迅速推出，全球共接種130多億劑疫苗，挽救了數(shù)百萬人的生命，同時也避免了更多感染者發(fā)展為重癥，為社會的逐步開放恢復(fù)正常發(fā)揮了重要作用。

功成名就

隨著新型冠狀病毒mRNA疫苗的推廣應(yīng)用及其價值體現(xiàn)，考里科和韋斯曼在mRNA核苷修飾發(fā)現(xiàn)方面的貢獻(xiàn)逐漸得到科學(xué)界的認(rèn)可。他們在短短3年時間內(nèi)共同分享了幾十項重大科學(xué)獎勵，比較著名的有阿爾巴尼醫(yī)學(xué)中心獎（Albany Medical Center Prize）、拉斯克臨床醫(yī)學(xué)研究獎（Lasker Clinical Medical Research Award）、路易莎·格羅斯·霍維茨獎（Louisa Gross Horwitz Prize）、生命科學(xué)突破獎（Breakthrough Prize in Life Sciences）、蓋爾德納國際獎（Gairdner International Award）和唐獎（Tang Prize）等，可謂能獲得的獎項基本拿遍，直到分享2023年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎[10]。此外，他們在2022年共同入選美國國家發(fā)明家名人堂。

mRNA修飾技術(shù)在新型冠狀病毒疫苗方面的成功算是牛刀小試，其更大的意義在于它廣泛的應(yīng)用潛力，如可以部分替代傳統(tǒng)的蛋白治療、開發(fā)針對癌癥預(yù)防或治療的疫苗等。包括考里科在內(nèi)的多位科學(xué)家都對修飾mRNA技術(shù)的應(yīng)用前景充滿信心，現(xiàn)在的成果只是起點而非終點，它的未來不可限量。

[1]Dolgin E. The tangled history of mRNA vaccines. Nature， 2021， 597（7876）： 318-324.

[2]Karikó K， Ni H， Capodici J， Lamphier M， et al. mRNA is an endogenous ligand for Toll-like receptor 3. J Biol Chem， 2004， 279（13）： 12542-12550.

[3]Karikó K， Buckstein M， Ni H， et al. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors： The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity，2005， 23（2）： 165-175.

[4]Karikó K， Muramatsu H， Welsh F A， et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther， 2008， 6（11）： 1833-1840.

[5]Karikó K， Muramatsu H， Ludwig J， et al. Generating the optimal mRNA for therapy： HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified， proteinencoding mRNA. Nucleic Acids Res， 2011， 39（21）： e142.

[6]Ruffell D. The future in an RNA molecule： from mRNA vaccines to therapeutics - An interview with Drew Weissman. FEBS Lett， 2021， 595（18）： 2305-2309.

[7]Pardi N， Hogan M J， Pelc R S， et al. Zika virus protection by a single low-dose nucleoside-modified mRNA vaccination. Nature， 2017， 543（7644）： 248-251.

[8]Sahin U， Muik A， Derhovanessian E， et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and TH1 T cell responses. Nature， 2020， 586（7830）： 594-599.

[9]Shapiro L， Losick R. Delivering the message： How a novel technology enabled the rapid development of effective vaccines. Cell， 2021， 184（21）： 5271-5274.

[10]Callaway E， Naddaf M. Pioneers of mRNA COVID vaccines win medicine Nobel. Nature， 2023， 622（7982）： 228-229.

關(guān)鍵詞：mRNA 核苷修飾 疫苗 諾貝爾獎 ■