熒光探幽：聚集誘導(dǎo)發(fā)光在體外診斷領(lǐng)域的應(yīng)用

解巧麗 李亞偉 劉勇 王志明

聚集誘導(dǎo)發(fā)光（aggregation-induced emission， AIE）材料具有良好的生物安全性、優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)、出色的光敏性能、獨特的單分子多功能性以及易于合成和功能化修飾等特點，在環(huán)境監(jiān)測、食品質(zhì)量控制、健康診斷、生物成像、光電器件、光學(xué)診療等領(lǐng)域受到青睞。基于AIE材料的體外診斷產(chǎn)品，如即時檢測產(chǎn)品、化學(xué)發(fā)光檢測產(chǎn)品、分子檢測產(chǎn)品以及免疫組織化學(xué)產(chǎn)品已被逐步開發(fā)出來。

即時檢驗產(chǎn)品

即時檢驗（point-of-care testing， POCT），其特征是檢測時間短，占用空間小，對檢測操作者的要求低。POCT應(yīng)用項目從最初的血糖檢測、妊娠檢測，擴(kuò)展到免疫快速分析檢測、分子快速分析檢測以及血氣檢測。其中，免疫快速分析檢測是一種結(jié)合了免疫學(xué)原理和層析技術(shù)的創(chuàng)新性的方法。免疫標(biāo)志物與疾病之間關(guān)系的不斷發(fā)現(xiàn)，快速推動了該方法學(xué)的發(fā)展。

免疫層析技術(shù)（immunochromatographic assay， ICA）是建立在層析技術(shù)和免疫學(xué)反應(yīng)基礎(chǔ)上的一種快速免疫分析技術(shù)。免疫層析產(chǎn)品通常以硝酸纖維膜為特異性抗體（或抗原）固化載體，以結(jié)合墊為標(biāo)記探針載體，通過毛細(xì)管作用使液體樣本在層析試紙條上移動，在載體上發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)，根據(jù)檢測線的信號情況來對樣本進(jìn)行定性、半定量或定量分析。

標(biāo)記材料的發(fā)展，決定了免疫層析技術(shù)的發(fā)展方向。第一代標(biāo)記材料以膠體金、乳膠微球為代表，免疫層析產(chǎn)品則主要用來進(jìn)行定性或半定量分析。而熒光標(biāo)記材料作為第二代標(biāo)記材料，實現(xiàn)了對待測物的定量分析，相比于耗時久的生化檢測方法及依賴大型儀器的質(zhì)譜分析技術(shù)，更能滿足日益增長的即時檢測需求，早已成為快檢產(chǎn)品開發(fā)的首選材料之一。相比于傳統(tǒng)的膠體金免疫層析檢測技術(shù)，熒光免疫層析具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度，并且便于與小型化儀器結(jié)合，實現(xiàn)精確的定量分析。

AIE熒光微球是將AIE熒光分子包裹在聚苯乙烯微球中而制備的高性能標(biāo)記材料，具有量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好、抗光漂白能力強(qiáng)等特點。利用材料性能的優(yōu)勢，并將其轉(zhuǎn)變成產(chǎn)品優(yōu)勢，AIE免疫層析產(chǎn)品具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性和高可靠性等特點。

以AIE標(biāo)記材料開發(fā)的用于新冠病毒（SARS- CoV-2）抗體的免疫層析快速診斷方法，將AIE810nm分子包入聚苯乙烯微球中制成約300納米的熒光微球，然后在表面修飾上病毒蛋白抗原，利用智能手機(jī)的攝像頭就可看到其與血液樣本反應(yīng)后在試紙條上的特定位置顯示出熒光條帶[1]。與膠體金相比，AIE標(biāo)記材料對病毒抗體IgM和IgG的檢出限（即在樣品中能檢出的被測組分的最低濃度）更低，靈敏度也更高，能更早發(fā)現(xiàn)感染。

尿液中有許多可以反映疾病的成分，如尿微量白蛋白可用于早期慢性腎臟疾病的篩查，尿白細(xì)胞則可以反映身體局部有無感染或炎癥的發(fā)生。一種基于尿液樣本檢測開發(fā)的使用AIE標(biāo)記材料的即時檢測方法[2]，利用尿微量白蛋白和白細(xì)胞疏水作用或靜電作用激活A(yù)IE探針的熒光特性，只需20分鐘左右，即可通過智能手機(jī)攝像裝置觀察到尿液中的尿微量白蛋白和白細(xì)胞。其原理是水分蒸發(fā)過程中，尿微量白蛋白擴(kuò)散形成環(huán)形印跡，而白細(xì)胞大部分集中分布在中心區(qū)域，它們的分布顯現(xiàn)出“咖啡環(huán)效應(yīng)”。該方法可結(jié)合儀器對尿微量白蛋白和白細(xì)胞進(jìn)行定量分析，實現(xiàn)早期慢性腎臟疾病的篩查。

化學(xué)發(fā)光產(chǎn)品

化學(xué)發(fā)光技術(shù)具有全自動化、高靈敏度、無須外界激發(fā)光源等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于生物檢測領(lǐng)域。由于化學(xué)發(fā)光是超微弱發(fā)光，所以一般通過化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（chemiluminescence resonance energy transfer， CRET）來增強(qiáng)發(fā)光的強(qiáng)度，改變發(fā)射波長或者發(fā)光時間。熒光分子在吸收能量后，會躍遷到激發(fā)態(tài)，而被用作能量接受體。但傳統(tǒng)有機(jī)熒光分子都具有聚集誘導(dǎo)猝滅效應(yīng)，在高濃度下發(fā)光效率受到一定限制。

AIE材料被發(fā)現(xiàn)后，其在聚集狀態(tài)的優(yōu)異發(fā)光特點受到了廣泛關(guān)注和研究。例如，研究人員通過將AIE熒光分子作為CRET受體，以化學(xué)發(fā)光體系“過氧草酸酯-過氧化氫”為能量供體，構(gòu)建了高效的CRET體系[3]，并提出了一種陽離子AIE表面活性劑介導(dǎo)魯米諾發(fā)光體系的策略[4]，構(gòu)建了高強(qiáng)度、長壽命的輝光型化學(xué)發(fā)光體系。該體系通過制備具有AIE性質(zhì)的陽離子表面活性劑分子C8-TPE-C4TAB，誘導(dǎo)魯米諾發(fā)光體系產(chǎn)生高強(qiáng)度、長壽命的輝光（持續(xù)時間超過1小時）。其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增敏主要源自兩方面：一是膠束表面靜電作用誘導(dǎo)反應(yīng)物富集，提高反應(yīng)效率；二是AIE熒光受體與激發(fā)態(tài)魯米諾距離短，具有超高的CRET效率。而長壽命化學(xué)發(fā)光特性則主要是因為中性環(huán)境下極低的過氧化陰離子摩爾分?jǐn)?shù)延長了化學(xué)反應(yīng)時間，且AIE膠束增加了溶液黏度，有助于減慢擴(kuò)散速度。

AIE材料的獨特性質(zhì)給化學(xué)發(fā)光產(chǎn)品帶來了新的突破，給更高效、更穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)而為未來的科技應(yīng)用提供更多可能性。

分子檢測產(chǎn)品

分子檢測實驗主要用于檢測基因、蛋白質(zhì)和其他生物分子的表達(dá)和功能，在生物醫(yī)學(xué)研究中有重要作用。實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR， RT-qPCR）是指在PCR（polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對模板進(jìn)行定量分析的方法。常用的定量PCR方法有染料法和探針法。

染料法（常用熒光染料SYBR GreenⅠ，這是一種具有綠色激發(fā)波長的染料） 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，該染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后發(fā)射熒光信號，而沒有摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

探針法（常用TaqMan探針，這是一種熒光標(biāo)記的水解探針） TaqMan探針具有“啞鈴”型結(jié)構(gòu)，其報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號會被猝滅基團(tuán)吸收；當(dāng)發(fā)生PCR擴(kuò)增時，Taq酶會將TaqMan探針酶切降解，使熒光報告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分離，熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成基本同步。

商業(yè)雙鏈DNA（double stranded DNA， dsDNA）結(jié)合染料（如SYBR GreenⅠ）在自由狀態(tài)下發(fā)光較弱，但插入dsDNA序列后發(fā)光增強(qiáng)。它們的發(fā)光強(qiáng)度隨著DNA的指數(shù)擴(kuò)增而定量增加。然而，短斯托克斯位移（<30納米，斯托克斯位移是指熒光光譜較相應(yīng)的吸收光譜紅移的現(xiàn)象）使得吸收和發(fā)射光譜之間有很大的重疊，從而導(dǎo)致自吸收或內(nèi)濾效應(yīng)，降低了信噪比和檢測靈敏度。與SYBR Green熒光染料相比，AIE熒光材料具有更大的斯托克斯位移（>100納米），從而防止了光譜重疊或內(nèi)濾效應(yīng)以及聚集引起的猝滅，提高了靈敏度。

基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子（AIEgen）的探針在核酸檢測中有重要應(yīng)用[5]。探針由兩部分組成，產(chǎn)生熒光信號的AIE活性基團(tuán)和與DNA結(jié)合的靶向基團(tuán)。與SYBR Green類似，基于AIEgen的DNA探針在自由狀態(tài)下發(fā)光較弱，但與dsDNA結(jié)合后發(fā)光增強(qiáng)。研究人員基于AIE原理，利用銥配合物開發(fā)了一種簡單的單步熒光檢測SARS-CoV-2 RNA的方法：巧妙設(shè)計的銥探針在有SARS-CoV-2 RNA的情況下“開啟”熒光，并在室溫下10分鐘內(nèi)給出準(zhǔn)確結(jié)果，檢測限低至1.84個基因拷貝[6]。研究人員還測試了20例臨床樣本，該方法的敏感度和特異度分別為90%和80%。

利用AIE材料的性能，分子檢測可以實現(xiàn)更高的靈敏度，推動了技術(shù)水平的提升，也將為醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域提供更加創(chuàng)新和可靠的解決方案。

免疫組織化學(xué)產(chǎn)品

免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry， IHC）是利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體（或抗原）的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色以確定組織、細(xì)胞內(nèi)抗原（或抗體）的所在位置及其性質(zhì)，并可利用熒光定量技術(shù)計算其含量，以此對組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的該抗原（或抗體）組分進(jìn)行定位、定性或定量的一種原位檢測技術(shù)。IHC能為研究人員提供目標(biāo)物質(zhì)在細(xì)胞和組織中的功能及分布，以及腫瘤等其他疾病的進(jìn)行程度、藥物療效等信息。

研究人員[7]將具有AIE特性的分子作為發(fā)光基元與疏水基團(tuán)和生物相容性好的親水基團(tuán)偶聯(lián)，制成具有AIE特性的新型納米粒子NDSA@SALL4，并在表面修飾上SALL4（一種調(diào)控胚胎腹部運動神經(jīng)元發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子）蛋白抗體。該納米粒子在水中發(fā)射較強(qiáng)的橙色熒光，當(dāng)利用它對癌組織及匹配的癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行免疫熒光染色，它可以特異性地靶向肝癌細(xì)胞及肝癌組織，并富集在細(xì)胞核中，發(fā)出明亮的橙黃色熒光。該方法對原發(fā)性肝癌組織免疫熒光染色的靈敏度和特異度優(yōu)于IHC染色，為早期檢測肝癌細(xì)胞提供了一種新方式。

聚集誘導(dǎo)發(fā)光材料由于熒光信號強(qiáng)度高且不易猝滅，還可以應(yīng)用于多重免疫組織化學(xué)/免疫熒光（multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence， mIHC/IF），在檢測低豐度樣品時，可大幅提高檢測靈敏度。mIHC在一張組織切片上最多可以對7個生物標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒光染色，對組織內(nèi)細(xì)胞的組成、定位、功能等信息進(jìn)行定量評估，并對細(xì)胞間原位空間等信息進(jìn)行全景式描繪。AIE材料助力mIHC技術(shù)，對患者腫瘤標(biāo)志物的檢測分析、腫瘤免疫分型、精準(zhǔn)篩查等具有重要應(yīng)用價值。

醫(yī)藥及光學(xué)診療領(lǐng)域中的應(yīng)用

近年來，AIE材料亦在生物領(lǐng)域大放光彩，并取得了突破性進(jìn)展。同時，AIE聚合物也有著優(yōu)異的表現(xiàn)，如結(jié)構(gòu)多樣性、功能可調(diào)及優(yōu)異的光動力/光熱性能，使其在藥物/基因遞送、疾病治療等應(yīng)用中擁有良好的發(fā)展前景。

利用聚集誘導(dǎo)發(fā)光效應(yīng)可以跟蹤細(xì)胞內(nèi)藥物載體的動態(tài)軌跡。而熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer， FRET）可用于監(jiān)測成像系統(tǒng)可視化動態(tài)過程，利用藥物載體與藥物之間的FRET效應(yīng)可以研究載體在細(xì)胞內(nèi)的釋放過程[8]。研究人員研制出一種同時具有AIE效應(yīng)和FRET效應(yīng)的超分子藥物載體HG/CD（負(fù)載抗癌藥物阿霉素），進(jìn)行藥物載體的動態(tài)軌跡和藥物釋放過程的監(jiān)測，研究結(jié)果表明該體系對癌癥有良好的治療作用[9]。

光動力治療（photodynamic therapy， PDT）是利用特定波長的光激發(fā)光敏劑產(chǎn)生強(qiáng)氧化性的活性氧（reactive oxygen species， ROS），從而氧化破壞組織和細(xì)胞中的各類生物大分子，使病變部位的細(xì)胞發(fā)生不可逆損傷甚至死亡的一種新技術(shù)。光敏劑是PDT的關(guān)鍵，其ROS產(chǎn)生效率的高低直接影響PDT效果。不同于傳統(tǒng)光敏劑，AIE聚合物不僅具有良好的光照敏化產(chǎn)生ROS的能力，并且光敏性能會隨著聚集體的生成而不斷增強(qiáng)，目前已經(jīng)應(yīng)用于診療一體化中。研究人員基于不同微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異，設(shè)計制備了一系列AIE聚合物。經(jīng)細(xì)菌實驗表明，該AIE聚合物具有良好的光敏化產(chǎn)生ROS的能力，并能高效殺滅所結(jié)合的微生物，且沒有產(chǎn)生耐藥性[10]。

AIE作為發(fā)光領(lǐng)域的“奇兵”，其自生的發(fā)光行為在很大程度上可以滿足體外診斷領(lǐng)域的信號輸出需求。不論是市場普遍需求的免疫層析產(chǎn)品，還是具有前沿創(chuàng)新的新型POCT產(chǎn)品、開拓性的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑、分子診斷探針，用于病理檢測的免疫組化產(chǎn)品，以及可診療一體化的多功能產(chǎn)品，AIE都已凸顯出了應(yīng)用潛質(zhì)，證明了其作為新材料發(fā)展核心驅(qū)動力的價值。當(dāng)然，AIE材料作為底層技術(shù)的創(chuàng)新及發(fā)展，雖然獲得了諸多實驗室研究的認(rèn)可，并且在商品化方面邁出了第一步，但是想要引領(lǐng)未來產(chǎn)業(yè)發(fā)展，還須克服許多市場化的困難。作為真正的“中國原創(chuàng)”科學(xué)理論和體系，AIE材料及技術(shù)未來的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化道路將持續(xù)創(chuàng)新，實現(xiàn)原創(chuàng)技術(shù)的高質(zhì)量發(fā)展。

[1]Chen R， Ren C， Liu M， et al. Early detection of SARS-CoV-2 seroconversion in humans with aggregation-induced near-infrared emission nano-particle-labeled lateral flow immunoassay. ACS Nano， 2021， 15（5）： 8996-9004.

[2]Guan S， Fu Q， Wang D， et al. Point-of-care urinalysis with one drop of sample using an aggregation-induced emission luminogen under the coffee-ring effect. ACS Sensors， 2022， 7（11）： 3481-3490.

[3]呂超. 聚集誘導(dǎo)發(fā)光在化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用. 中國化學(xué)會第十三屆全國分析化學(xué)年會論文集（二），2018.

[4]Yu Y， Yuan Z， Lu C. Long-lasting chemiluminescence by aggregation-induced emission surfactant with ultralow critical micelle concentration. Aggregate， 2023： e349.

[5]Liu Z， Meng T， Tang X， et al. The promise of aggregation-induced emission luminogens for detecting COVID-19. Frontiers in Immunology， 2021， 12： 635558.

[6]Gupta A， Adarsh T， Manchanda V， et al. COVID-19 detection using AIE-active iridium complexes. Dalton Transactions， 2023， 52（5）： 1188-1192.

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[8]Yuan Y， Liu B. Visualization of drug delivery processes using AIEgens. Chemical Science， 2017， 8（4）： 2537-2546.

[9]Dong Z， Bi Y， Cui H， et al. AIE supramolecular assembly with FRET effect for visualizing drug delivery. ACS Applied Materials& Interfaces， 2019， 11（27）： 23840-23847.

[10]Qi G， Hu F， Kenry， et al. Bacterium-templated polymer for self‐selective ablation of multidrug-resistant bacteria. Advanced Functional Materials， 2020， 30（31）： 2001338.

關(guān)鍵詞：聚集誘導(dǎo)發(fā)光 即時檢測產(chǎn)品 化學(xué)發(fā)光檢測產(chǎn)品分子檢測產(chǎn)品 免疫組織化學(xué)產(chǎn)品 ■