毛白楊組培快繁研究

王 南

(寶雞市陳倉區(qū)林業(yè)工作站,陜西 寶雞 721399)

0 引言

毛白楊(PopulustomentosaCarr.),喬木,高30 cm,樹冠寬卵形。是黃河流域防護林建設(shè)、速生豐產(chǎn)林建設(shè)、平原綠化、膠合板工業(yè)、造紙工業(yè)、木材工業(yè)等森工領(lǐng)域的好品種?；ㄆ?月,果實成熟期為4月上旬～5月中旬[1]。

毛白楊有性生殖能力普遍較低[2],因為毛白楊為雌雄異株,雌株數(shù)量較雄株少,而且雌雄株花期不遇,雌性毛白楊花芽小而稀,比雄性毛白楊開花遲15～20 d[3]。不容易結(jié)實,生產(chǎn)上一般不進行有性繁殖,大多使用無性繁殖。經(jīng)常采用根繁、嫁接和扦插等繁殖方法進行育苗。比如崔振榮所著的毛白楊的無性繁殖措施中的伐根嫁接、枝接來扦插育苗[4]。這種育苗方式由于受材料、季節(jié)等因素的限制,繁殖速度慢并且容易遭受病毒的危害,而組織培養(yǎng)技術(shù)不受氣候和季節(jié)的限制,便于穩(wěn)定地進行周年生產(chǎn),苗木繁殖速度快,效率高,繁殖材料來源廣泛,可有效脫出植物所帶的病毒等優(yōu)點。植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用范圍很廣,目前主要用在離體無性系快速繁殖與無毒化、植物育種、遺傳物質(zhì)的保存、植物次生代謝物的生產(chǎn)和植物基因轉(zhuǎn)化等方面[5]。

在實際應(yīng)用中根據(jù)不同的植物或不同植物的不同部位選擇不同的培養(yǎng)基[6]。植物生長調(diào)節(jié)劑的研究及其在生產(chǎn)上的應(yīng)用是近代植物學(xué)及農(nóng)業(yè)科學(xué)的重大進展之一[7]。植物生長調(diào)節(jié)劑在促進扦插生根、提高嫁接成活率、提高組織培養(yǎng)效果等方面發(fā)揮著重要的作用[8]。植物生長調(diào)節(jié)劑NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸),IBA(吲哚丁酸)作為重要的內(nèi)源激素,參與了植物生長和發(fā)育的諸多過程,如根和莖的生長、器官的衰老、維管束組織的形成和分化發(fā)育以及植物的向地和向光反應(yīng)等[9]。要根據(jù)不同的植物對象及其部位和不同的目的選擇合適的藥劑。

毛白楊組織培養(yǎng)體系的資料較多,利用芽變毛白楊葉片作為外植體進行不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是MS+1.0 mg/L6-BA+0.1 mg/LIBA+0.1 mg/LGA[10]。利用三倍體毛白楊的休眠芽作為外植體,三倍體毛白楊快繁的適宜增值培養(yǎng)基為1/2MS+0.4 mg/LNAA+0.5 mg/LNAA,適宜壯苗、生根的培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/LNAA[11]。利用三倍體毛白楊莖段作為外植體,三倍體毛白楊在MS+0.5 mg/LBA+0.25 mg/LIBA+0.2 mg/LNAA上每周3能增值5.6～7.8倍,在1/2MS+1.0 mg/LIAA的培養(yǎng)基上生根率為72.8%～76%[12]。

毛白楊組織培養(yǎng)的資料雖然比較多,但是人們工作的注意力仍更多地集中在對不同濃度的單一生長素類或不同濃度及比例的生長素類和細胞分裂素類對根的誘導(dǎo)效率的影響。以毛白楊休眠枝作為實驗材料,在H培養(yǎng)基上附加不同濃度IBA、IAA對莖段生芽的影響進行研究,以及在1/2MS培養(yǎng)基上,探討了6-BA、NAA不同濃度組合對叢生芽增殖的影響,IAA、IBA和NAA不同濃度組合對生根的影響,篩選出有利于毛白楊叢生芽增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的生長組合,旨在為毛白楊快繁體系優(yōu)化提供資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以毛白楊一年生休眠枝條為試驗材料。

1.2 實驗方法

1.2.1 外植體的獲取。對一年生休眠枝條進行水培,待水培芽長到3～5 cm后,剪取一段3 cm左右的帶芽莖段,每段保留2個側(cè)芽,用洗衣粉漂洗后,10%的84消毒液消毒8～12 min,蒸餾水清洗,用濾紙吸干水分,然后在超凈工作臺上置75%酒精浸泡1～2 s,用無菌水清洗3次,迅速倒入1 g/L的升汞液中,浸泡8 min,用無菌水清洗4次,最后用無菌水浸泡備用。接種時將莖段放在消毒好的濾紙上,接種到不同激素配比的H培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化。

1.2.2 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。選用H為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的IBA和IAA,IBA和IAA的濃度設(shè)置都為4個梯度,分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L。共組成16種不同激素濃度配比的培養(yǎng)基。將3 cm左右的帶芽莖段接種到含有不同激素配比的H培養(yǎng)基中(表1),蔗糖濃度2%,瓊脂濃度為0.4%。每瓶接種3～4塊外植體,每一個梯度接10瓶。

表1 不同激素配比的H培養(yǎng)基

培養(yǎng)條件:培養(yǎng)室溫度(20±5)℃,光照14 h,光強1500～2000 lx,pH5.8。

1.2.3 芽的增殖培養(yǎng)基。選用1/2 MS為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的6-BA、NAA,將在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上長出的叢生芽切割成較小的叢芽塊或待外植體腋芽萌動抽枝后再進行分割切段,接種在增殖培養(yǎng)基上進行增殖。每瓶接種3～4塊外植體,每一個梯度接10瓶。接種在以下培養(yǎng)基上,1/2MS+1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA、1/2MS+1.0 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA、1/2MS+0.5 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA。

培養(yǎng)條件:培養(yǎng)室溫度(20±5)℃,光照14 h,光強1500～2000 lx,pH5.8。

1.2.4 誘導(dǎo)生根培養(yǎng)。選用1/2MS為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的IAA、IBA和NAA,IAA和IBA的濃度設(shè)置3個梯度,分別為:0、0.2、0.5 mg/L;NAA濃度設(shè)置3個梯度,分別為:0、0.1、0.2 mg/L。每瓶接種3～4塊外植體,每一個梯度接10瓶。設(shè)置采用單芽莖段法,即將分化階段帶芽嫩枝切成小段(每個莖段帶一個腋芽)直接接種在生根培養(yǎng)基(表2)上誘導(dǎo)生根。

表2 不同激素配比1/2MS培養(yǎng)基

培養(yǎng)條件:培養(yǎng)室溫度(20±5)℃,光照14 h,光強1500～2000 lx,pH5.8。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)

為了探討不同濃度比例的生長素對芽誘導(dǎo)分化的影響,以H作為基本培養(yǎng)基,IAA、IBA均分別采用0.5、1.0、1.5和2.0 mg/L的濃度梯度;對接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的單芽莖段或頂芽經(jīng)15 d培養(yǎng)后其分化情況如表3所示。

表3 毛白楊外植體生長分化情況試驗方案和成果分析表

由表3得出,在含有1.5 mg/LIBA、1.5 mg/LIAA的培養(yǎng)基中,外植體經(jīng)過兩周后,開始發(fā)芽、展葉,且生長好,誘導(dǎo)分化率為84.2%;在含有0.5 mg/LIBA、1.5 mg/LIAA和0.5 mg/LIBA、0.5 mg/LIAA的培養(yǎng)基中,外植體經(jīng)過兩周后,開始發(fā)芽、展葉,但生長一般,誘導(dǎo)分化率低且僅為40%。在IAA的四個濃度梯度中,分化出最多芽個數(shù)的IAA濃度為1.5 mg/L;在IBA的四個濃度梯度中,分化出最多芽個數(shù)的IBA濃度也為1.5 mg/L。在實驗中,以H為基礎(chǔ)培養(yǎng)基附加4個濃度梯度的培養(yǎng)基中最佳的組合為H+1.5 mg/LIAA+1.5 mg/LIBA。

2.2 芽的增殖培養(yǎng)

以1/2MS作為基本培養(yǎng)基,分別添加兩種不同濃度的6-BA與三種濃度不同的NAA組合,將從外植體獲得的芽切成莖段分別接入以下所示培養(yǎng)基中,觀察芽的生長情況,結(jié)果如表4所示。

表4 毛白楊叢芽增殖

由表4實驗結(jié)果表明:毛白楊對6-BA和NAA的濃度范圍適應(yīng)性較廣,在三種培養(yǎng)上均可形成叢生芽,有的莖段上長著不止一個芽,但以較低濃度的6-BA和NAA配合使用效果為佳。接種在1.0 mg/L6-BA、0.5 mg/LNAA培養(yǎng)基的莖尖(段)雖誘導(dǎo)率高,達到100%,但其芽長勢緩慢。而接種在1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基的莖尖(段)雖芽長勢快但誘導(dǎo)率很低。在實驗中,1/2MS+0.5 mg/L6-BA+0.05 mg/LNAA為最適合叢芽增值的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的莖尖(段)芽長勢快誘導(dǎo)率高。

2.3 芽的誘導(dǎo)生根培養(yǎng)

以1/2MS作為基本培養(yǎng)基,分別附加不同濃度的IAA、IBA、NAA進行組合,將增殖培養(yǎng)基上大于3 cm的芽剪下接種在生根培養(yǎng)基上,培養(yǎng)15 d后,基部膨大,并逐步形成發(fā)達的根系,如表5所示。

表5 毛白楊生根情況和成果分析表

由表5得知,在0、0.5 mg/L IAA濃度下,毛白楊生根最好;在0.2 mg/L IBA濃度下,毛白楊生根最好;在0 mg/LNAA下,毛白楊生根最好。由以上分析得出,理論上得出適合毛白楊生根的培養(yǎng)基有1/2MS+0.2 mg/LIBA,1/2MS+0.5 mg/LIAA+0.1 mg/LIBA。由表5可知,在1/2MS+0.2 mg/LIBA培養(yǎng)基下,生根率達到90%,達到最高生根率。

3 討論

3.1 激素配比與芽的誘導(dǎo)

楊樹組織培養(yǎng)研究表明,植物生長調(diào)節(jié)劑中的細胞分裂素與生長素是誘導(dǎo)外植體脫分化的主要因素,其種類和濃度的配比對芽的誘導(dǎo)關(guān)系重大[13]。試驗進行的IAA與IBA 配比研究表明,1.5 mg/LIAA與1.5 mg/LIBA配比對毛白楊芽誘導(dǎo)率最高,可達84.2%。與董晨波等[14]莖段培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS +0. 25 mg/LBA+ 0. 05 mg/LNAA+0. 25 mg/LIAA相比,人們工作的注意力更多地集中在對不同濃度的單一生長素類以及不同濃度的IAA與BA不同濃度之間的配比對莖段誘導(dǎo)分化的影響。而文章研究了在IAA和IBA配合使用的生長素對分化誘導(dǎo)的影響。

3.2 激素配比與芽的增殖

6-BA是啟動細胞分化的主要激素, 主要作用是促進芽的形成,也可以誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生[15]。當(dāng)BA 與NAA的濃度比例低時,有利于愈傷組織的形成和芽的生長,比例高時有利于芽的分化[11]。在本試驗中則是以較低濃度的0.5 mg/L 6-BA和低濃度的0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基對不定芽的分化誘導(dǎo)最佳,這可能與選取的基本培養(yǎng)基不同,從而對結(jié)果產(chǎn)生影響。

3.3 激素配比與芽的誘導(dǎo)生根

植物生長調(diào)節(jié)劑對植物愈傷組織的誘導(dǎo)和分化過程具有重要作用[16]。試驗發(fā)現(xiàn)比較理想的毛白楊生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/LIBA、1/2MS+0.5 mg/LIAA+0.1 mg/LIBA。但是后期實驗數(shù)據(jù)處理的時候才發(fā)現(xiàn)在實驗過程中未設(shè)計在1/2MS+0.5 mg/LIAA+0.1 mg/LIBA培養(yǎng)基下毛白楊生根培養(yǎng),需要進一步設(shè)計該培養(yǎng)基進行驗證。然而IAA的成本要高于IBA的成本,所以在實驗中1/2MS+0.2 mg/LIBA就是毛白楊生根最優(yōu)的培養(yǎng)基。實驗中以多種生長素不同濃度配比進行研究,濃度比例設(shè)置較多,并沒有把所有的濃度進行正交設(shè)計。從實驗所得數(shù)據(jù)分析得出理論值,將實驗值與理論值進行比較分析得出最優(yōu)的培養(yǎng)基。