廣西金花茶根系叢枝菌根真菌染色方法探討

許詩萍 高日芳 張金蓮 宋娟 李冬萍 何苑皞 曾詩媛 陳廷速

關(guān)鍵詞：金花茶；根系；叢枝菌根真菌；染色

金花茶（Camellianitidissima）屬于山茶科山茶屬植物，是國家一級保護(hù)植物和世界珍稀觀賞植物[1-2]，素有“植物界大熊貓”“茶族皇后”的美稱，具有較高的觀賞性以及極大的市場開發(fā)潛力[3]。金花茶植物含有黃酮類、多糖、茶多酚等多種活性成分[4-6]以及豐富的天然微量元素[7]，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗腫瘤等多種功效[8-11]。金花茶自然分布區(qū)域窄，采種困難，近年來人們過度開發(fā)，導(dǎo)致其野生資源減少[12-13]，尋找高效的人工種植方法，快速繁殖金花茶優(yōu)良種苗[14-16]，以期大幅度提高規(guī)模化種植金花茶的產(chǎn)量，精深開發(fā)金花茶新一代醫(yī)藥保健產(chǎn)品[17-18]，造福人類的健康極具重要的科研價值。

叢枝菌根（arbuscularmycorrhiza，AM）真菌廣泛分布于土壤中，是一類專性活體營養(yǎng)共生菌[19]。許多研究表明，AM真菌不僅能促進(jìn)宿主植物對水分和土壤礦質(zhì)元素（尤其是磷、鋅、銅等）的吸收和利用，還能增強(qiáng)宿主植物對貧瘠、干旱、病蟲害等不良環(huán)境的抵抗能力，以及改善土壤的理化性狀，促進(jìn)植物生長，提高植物品質(zhì)和產(chǎn)量[20-21]。探究AM真菌與金花茶根系所形成的互惠共生體，有助于金花茶菌根種苗的應(yīng)用，可以為提高金花茶存活率、解決其生長慢產(chǎn)量低的問題提供思路。目前，國內(nèi)外有關(guān)AM真菌在金花茶上的侵染狀況尚無報道，但同屬于山茶科山茶屬的茶樹根際均有AM真菌定殖，能形成典型的AM真菌結(jié)構(gòu)[22]，AM真菌能增強(qiáng)茶樹的耐鹽性[23]、抗旱性[24]、抗重金屬脅迫能力[25]。

叢枝菌根真菌通常從植物的幼嫩根系進(jìn)行侵染，多數(shù)情況下是從根系成熟區(qū)的根毛、根表皮短細(xì)胞或細(xì)胞間隙侵入，形成叢枝、泡囊、根內(nèi)菌絲等典型的菌根結(jié)構(gòu)。部分根內(nèi)菌絲頂端膨大形成圓形、橢圓形泡囊或菌絲二分叉式生長形成叢枝結(jié)構(gòu)，有些根內(nèi)菌絲在細(xì)胞內(nèi)形成螺旋狀菌絲圈。根內(nèi)菌絲、泡囊可存在于細(xì)胞中，也可存在于細(xì)胞間隙，而叢枝只存在于細(xì)胞中，后期處于消解狀態(tài)，呈海綿狀，泡囊壁薄，內(nèi)含不同形態(tài)的油滴等內(nèi)含物[26-28]。通常認(rèn)為深色有隔菌絲和微菌核是深色有隔內(nèi)生真菌（darkseptateendophytes，DSE）在植物根內(nèi)的2種典型特征結(jié)構(gòu)。深色有隔菌絲分布于根的表皮、皮層的胞間和胞內(nèi)，顏色深淺不一，常見深棕色至淺棕色，隨著菌絲的延伸，顏色可能逐漸變淺。菌絲壁較厚，具明顯的橫隔，菌絲直或曲，常伴有樹枝狀隨意隆起的分枝。微菌核由細(xì)胞壁加厚的膨大的細(xì)胞緊密堆積形成，形狀大小不一，顏色多為深棕色，同一微菌核團(tuán)塊的顏色也有深淺變化。分布于根的表皮、皮層細(xì)胞中或細(xì)胞間隙，有時可見與其相連的菌絲[29]。

由于幾乎所有的AM真菌接種試驗均涉及菌根發(fā)育狀況觀察與侵染率測定，因此人們十分重視其觀察與測定方法研究，相繼建立了臺酚藍(lán)染色法和酸性品紅染色法來觀察植物根系A(chǔ)M真菌的侵染狀況。如PHILLIPS等[30]和KORMANIK等[31]分別利用臺酚藍(lán)和酸性品紅染色法觀察根系A(chǔ)M真菌，但AM真菌結(jié)構(gòu)和周圍的根皮層組織均染上了相近的顏色，使二者顏色反差不大，不利于觀察拍照。吳強(qiáng)盛等[32]利用臺酚藍(lán)染柑橘的根樣可以清楚地看到AM真菌的各個結(jié)構(gòu)，但是未能拍到柑橘根清晰的叢枝結(jié)構(gòu)。VIERHEILIG等[33]將醋酸墨水染色法應(yīng)用于根系A(chǔ)M真菌染色，并指出臺酚藍(lán)和酸性品紅均為致癌疑似物。唐燕等[34]用苯胺藍(lán)染色液對腋花杜鵑的根系進(jìn)行染色，能清楚地觀察到AM真菌和內(nèi)生真菌的侵入，并能觀察到AM真菌菌絲、泡囊和深色有隔內(nèi)生真菌菌絲。不同種、屬的植物根系結(jié)構(gòu)存在差異，因此前人的染色方法并不一定適用于金花茶。

本研究以廣西防城港市原生金花茶科技有限公司金花茶資源圃的金花茶（品種名為防普金花茶）根系為樣品，比較和評價蘇丹紅Ⅳ、酸性品紅、苯胺藍(lán)、臺酚藍(lán)、醋酸墨水5種常用染色劑對其AM真菌的染色效果，以建立安全、可靠、理想的染色方法，為金花茶根系的AM真菌研究提供支持。

1材料與方法

1.1材料

選取種植多年的金花茶健康植株根系。于2021年7月29日采自廣西防城港市原生金花茶科技有限公司金花茶資源圃種植基地，清水沖洗干凈后置于50%乙醇溶液，室溫保存。

1.2方法

1.2.1染色劑配制染色劑各成分比例參考李冬萍等[35]的方法。（1）蘇丹紅Ⅳ：0.1g蘇丹紅Ⅳ+10mL95%乙醇+10mL甘油；（2）酸性品紅：0.05g酸性品紅+100mL乳酸-甘油-蒸餾水（1∶1∶1）混劑；（3）苯胺藍(lán)：0.1g苯胺藍(lán)+100mL95%乙醇；（4）臺酚藍(lán)：0.05g臺酚藍(lán)+100mL乳酸-甘油-蒸餾水（1∶1∶1）混劑；（5）醋酸墨水：95mL5%冰乙酸+5mLQuink牌純黑墨水（上海派克筆有限公司）。

1.2.2根系菌根染色參考文獻(xiàn)[19]的方法，對以上5種染色劑進(jìn)行根系菌根染色試驗，略作改進(jìn)。取保存于50%乙醇溶液的根系，清水沖洗干凈并將水分控干。（1）透明：將金花茶的3～4級根（直徑1～2mm）剪成約1cm長，加入20%KOH溶液完全浸泡根系，于90℃水浴120min，清水沖洗3次并控干水分。（2）脫色：加入堿性H2O2（30mL10%H2O2+3mL氨水+567mL蒸餾水）室溫脫色60min，用清水沖洗3次并控干水分。（3）酸化：加入5%冰乙酸，室溫酸化5min，清水沖洗3次并控干水分。（4）染色：用5種染色劑分別進(jìn)行染色處理，66℃水浴染色60min，并用清水漂洗數(shù)次。（5）褪色：用4℃清水浸泡12h以上，備用，因酸性品紅染色后極易褪色，故該染色組免去褪色步驟，需及時制片觀察。

1.2.3制片與顯微觀察將脫色處理后的根段置于載玻片上，用尖嘴鑷子挑出金花茶根的堅硬組織，剩余組織平展在載玻片上，蓋上蓋玻片，然后用鑷子輕輕敲壓使平展均勻。每個處理制片3張，3次重復(fù)。使用尼康EclipseCi-L和DS-Ri2觀察、拍照。

2結(jié)果與分析

2.1蘇丹紅Ⅳ染色

用蘇丹紅Ⅳ染色時，根內(nèi)和根外的AM真菌菌絲著色均不明顯（圖1A，圖1B）；部分泡囊主體被染成橘黃色，觀察不到內(nèi)含物（圖1C）；另一部分泡囊著色不明顯，但能觀察到內(nèi)含物（圖1D）；DSE的菌絲和微菌核著色不明顯（圖1E），可觀察到微菌核的油滴狀內(nèi)含物（圖1F）。

2.2酸性品紅染色

酸性品紅將AM真菌菌絲和部分泡囊及二者的連接處染成肉粉色，與背景反差不明顯，泡囊可觀察到內(nèi)含物（圖2A～圖2D）。DSE的菌絲和微菌核與背景反差明顯（圖2E，圖2F）。

2.3苯胺藍(lán)染色

用苯胺藍(lán)染色時，AM真菌菌絲和泡囊呈藍(lán)色，邊緣清晰，觀察不到泡囊內(nèi)含物（圖3A～圖3C）。叢枝呈淺藍(lán)色的海綿狀，邊緣模糊，但根皮層也被染上了相同或略淺的顏色（圖3D，圖3E）。深色有隔內(nèi)生真菌的菌絲與背景反差明顯，易觀察（圖3A）。還分辨出一種未知真菌結(jié)構(gòu)（圖3F）。

2.4臺酚藍(lán)染色

用臺酚藍(lán)染色后，根皮層細(xì)胞為淺藍(lán)色，AM真菌菌絲和泡囊呈略深的藍(lán)色，可觀察到泡囊內(nèi)含物（圖4A～圖4C）。能輕易分辨不同形態(tài)的叢枝（圖4D，圖4E）。細(xì)胞內(nèi)的菌絲圈清晰可見（圖4F，圖4G）。DSE的菌絲和微菌核染色效果不明顯（圖4H，圖4I）。

2.5醋酸墨水染色

經(jīng)醋酸墨水染色的AM真菌結(jié)構(gòu)均清晰可見，AM真菌根內(nèi)和根外菌絲均呈紫色，走向明顯（圖5A，圖5B）。泡囊和不同形態(tài)的叢枝均染上深淺不一的藍(lán)紫色，均與淺色的背景反差大，易觀察，泡囊可觀察到內(nèi)含物（圖5B～圖5G）。DSE的菌絲和微菌核清晰（圖5H，圖5I）。以上各種典型結(jié)構(gòu)在低倍鏡下均能清晰地觀察到。

2.65種不同染色劑的染色效果比較

比較5種染色劑分別對金花茶根系A(chǔ)M真菌結(jié)構(gòu)及根組織的染色效果，結(jié)果顯示，每種染色劑均使根內(nèi)菌絲和泡囊染色，叢枝的染色情況與根組織很接近，酸性品紅染色的結(jié)構(gòu)數(shù)量最少，醋酸墨水能使金花茶根系A(chǔ)M真菌的所有典型結(jié)構(gòu)染色（表1）。

觀察5種染色劑對金花茶根系A(chǔ)M真菌結(jié)構(gòu)的染色效果，結(jié)果顯示，不同染色劑對AM真菌結(jié)構(gòu)染色的清晰度、反差效果、保存時間以及染色劑的成本、毒性等方面存在較大差別（表2）。

3討論

根系菌根的染色效果直接影響菌根定殖分析的準(zhǔn)確性，因此找到穩(wěn)定可靠、染色對象與背景反差大、安全無毒的染色方法，十分必要。

在光學(xué)顯微鏡下，觀察5種染色劑對金花茶根系A(chǔ)M真菌結(jié)構(gòu)的染色效果，結(jié)果表明，不同染色劑對AM真菌結(jié)構(gòu)染色的清晰度、穩(wěn)定性、反差效果等方面存在較大差異。當(dāng)采用蘇丹紅Ⅳ染色時，泡囊外輪廓模糊，很難觀察到完整的泡囊結(jié)構(gòu)，也不易觀察到泡囊和AM真菌菌絲的相對位置，染色不均；AM真菌菌絲染色清晰度不高，不易辨別其形態(tài)；未觀察到叢枝結(jié)構(gòu)。而在枳砧紐荷爾臍橙[39]根系A(chǔ)M真菌染色中，可觀察到叢枝在細(xì)胞內(nèi)呈淡粉色，其原因可能是取樣的根系無叢枝結(jié)構(gòu)或者叢枝染色非常淺，難以鑒別。酸性品紅染色后，泡囊和AM真菌菌絲著色淺，在脫色階段，皮層組織與AM真菌結(jié)構(gòu)同步脫色且速度極快，若不能及時觀察，需放回酸性品紅染液中常溫復(fù)染，復(fù)染時間在10h以上效果較好，操作繁瑣。汪茜等[40]和覃曉娟等[41]采用酸性品紅分別觀察生姜根系和香蕉根系，也出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象。而高秀兵等[22]采用酸性品紅觀察茶樹根系，可清楚地觀察到菌絲、泡囊、叢枝等AM真菌結(jié)構(gòu)，推測是染色劑的具體使用步驟或?qū)Σ煌?、屬植物的著色效果不同而?dǎo)致觀察結(jié)果有差異。用苯胺藍(lán)染色時，AM真菌結(jié)構(gòu)的顏色與根內(nèi)的皮層細(xì)胞相近且略深，與背景反差小，看不到泡囊內(nèi)含物，但唐燕等[34]可以清楚地觀察到腋花杜鵑的泡囊內(nèi)含物，其原因可能是苯胺藍(lán)未能使金花茶根系的泡囊內(nèi)含物染色，或者取樣根系的泡囊處于內(nèi)含物不明顯的生理階段。用臺酚藍(lán)染色，可辨別AM真菌的菌絲形態(tài)。在66℃水浴加熱1h的條件下，染色效果很強(qiáng)，根段整體呈現(xiàn)灰藍(lán)色，細(xì)胞壁顏色更深，只能觀察到染成深藍(lán)色的AM真菌菌絲和深褐色的DSE菌絲；將染色操作換成66℃水浴加熱15min后，清水浸泡下根皮層細(xì)胞褪色效果較好，能分辨不同形態(tài)的叢枝，但染色清晰度不高，這與香蕉根系A(chǔ)M真菌染色方法[41]的報道一致，猜測是根系皮層組織與AM真菌結(jié)構(gòu)同步褪色的緣故，說明臺酚藍(lán)對AM真菌結(jié)構(gòu)的染色無特異性。采用醋酸墨水染色時，金花茶根系經(jīng)清水浸泡12h后，大部分的皮層細(xì)胞已褪至淺紫色，而AM真菌各結(jié)構(gòu)仍然保持鮮亮的藍(lán)紫色。清水浸泡36h后，皮層細(xì)胞接近完全脫色，叢枝等典型的AM真菌結(jié)構(gòu)邊緣清晰，能輕易分辨海綿狀和二分叉式的叢枝，染色效果穩(wěn)定不褪色。

從5種染色劑的染色效果來看，每種染色劑均能使根內(nèi)菌絲和泡囊染色，說明這2個結(jié)構(gòu)比較常見，也較容易染上色，具體的染色機(jī)理需要進(jìn)一步探討。蘇丹紅Ⅳ和酸性品紅均未能使叢枝和根組織染上明顯的顏色，結(jié)合這2種染色劑對其他結(jié)構(gòu)的染色情況，可以初步得出這2種染色劑均不是理想的染色劑的結(jié)論。醋酸墨水能使金花茶根系A(chǔ)M真菌的所有典型結(jié)構(gòu)染色，也能使根組織染上顏色，表明醋酸墨水的染色能力強(qiáng)。在染色能力方面，苯胺藍(lán)和臺酚藍(lán)并不比醋酸墨水遜色，但是醋酸墨水對根組織的染色在清水中就能迅速褪色，并且可以使AM真菌結(jié)構(gòu)染上的顏色保持鮮亮，在淺色的背景上很容易進(jìn)行進(jìn)一步觀察。

5種染色劑均能分辨出AM真菌與DSE的主要原因：一是本次樣品中DSE侵染的范圍廣，未出現(xiàn)取樣的根系無特征結(jié)構(gòu)的情況；二是作為背景的根組織，在染色的透明和脫色步驟成功脫去本色，而DSE的2種典型結(jié)構(gòu)（即深色有隔菌絲和微菌核）顏色深，未受到20%KOH溶液和堿性H2O2溶液的明顯影響，后期也不易被染色，與背景反差明顯；三是DSE的菌絲具明顯的橫隔特征。有文獻(xiàn)報道，在顯微鏡下觀察經(jīng)蘇丹紅Ⅳ染色的DSE，能看到DSE透明菌絲中的油滴體[29]。本研究中能觀察到淺色微菌核的油滴體，在DSE菌絲里卻未觀察到。其原因可能是DSE菌絲顏色太深，掩蓋了油滴體的顏色，或者油滴體只出現(xiàn)在DSE結(jié)構(gòu)的特定階段，而能在微菌核里看到油滴體，可能原因是DSE的菌絲和微菌核成分相近，結(jié)構(gòu)相似，文獻(xiàn)報道有時可見與微菌核相連的菌絲[29]也可印證這個猜測。DSE菌絲分布于根的表皮、皮層的胞間和胞內(nèi)[29]，而本研究中的DSE菌絲在視覺上相對完整緊湊地出現(xiàn)在根組織的上方，且沿根的縱軸方向延伸，形成菌絲網(wǎng)絡(luò)，可能原因是在制片時過于用力，壓碎了根組織，影響了后續(xù)的觀察和拍照，同時能判斷出此根段中的DSE菌絲均為胞間菌絲。在苯胺藍(lán)染色時，還分辨出第三種真菌的未知真菌結(jié)構(gòu)，疑似鏈格孢屬（Alternaria）真菌的分生孢子[42]，因該種真菌侵染程度不深，未留下更多可供觀察和分析判斷的結(jié)構(gòu)。

此外，Quink牌墨水由淡黃色的喹啉黃（CI47005，CIFoodyellow13）、橙色的日落黃（CI15985，CIFoodyellow3）和藍(lán)色的陰丹士林藍(lán)（CI69800，CIFoodBlue4，又名藍(lán)蒽酮）3種染料組成，安全無毒[38]。從保存時間、成本、毒性、操作復(fù)雜程度等方面考慮，醋酸墨水染色法均更優(yōu)于其他4種染色方法，因此醋酸墨水較其他幾種染色劑更適用于金花茶根系A(chǔ)M真菌的染色觀察。