基于ISSR標記的航天香蕉新材料的遺傳特異性

王金英 李華盛 鹿金穎 蔡長福 蔡邦平

關鍵詞：航天育種；香蕉；ISSR；遺傳特異性

根據(jù)APGⅢ分類系統(tǒng)，香蕉（MusananaLour.）是單子葉植物分支下的姜目（Zingiberales）植物，屬于芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa）。香蕉主要產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)，是世界上非常重要的一種熱帶水果和糧食作物，也是我國南部地區(qū)的重要經(jīng)濟作物之一。福建省香蕉栽培歷史悠久，但是福建地處我國香蕉栽培適區(qū)的北緣，具有一定的局限性[1]?，F(xiàn)今福建的香蕉產(chǎn)業(yè)受到病害、寒害或風害的嚴重威脅，以及外來或進口香蕉的沖擊，正面臨著規(guī)模萎縮的處境。因此，選育抗病、耐寒、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的香蕉新品種，已成為福建香蕉研究亟需解決的重要課題。

航天育種是利用太空環(huán)境中的極端條件（微重力、強輻射、高真空等因素），誘發(fā)植物的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，從中選擇優(yōu)良變異，培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗的植物新品種的育種方法[2]。將傳統(tǒng)的育種技術與航天誘變技術相結合實現(xiàn)育種目標的方法，已經(jīng)得到國內(nèi)外育種專家的廣泛認可。我國自1987年首次開展返回式衛(wèi)星航天搭載水稻等農(nóng)作物種子，距今已有30多年[3]。隨著我國航天事業(yè)的發(fā)展，通過航天育種方式已選育出一大批優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗的新品種，正服務并助推著相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。航天育種為植物新品種的選育打開了新世界的大門，也為香蕉新品種的選育開拓了新的途徑。

簡單重復序列區(qū)間（inter-simplesequencerepeat，ISSR）是由ZIEDEWIEZ等[4]提出的、基于SSR的基礎上發(fā)展起來的一種DNA擴增多態(tài)性檢測技術。因其具有DNA模板用量少、引物設計簡單、操作快速高效、多態(tài)性好、穩(wěn)定性好、可重復性高等優(yōu)勢，常在植物遺傳多樣性、種質(zhì)資源鑒定、分類及親緣關系分析等方面有廣泛的應用[5-8]。本研究以2份航天香蕉種質(zhì)和18份其他香蕉種質(zhì)為材料，通過ISSR標記技術，旨在構建航天香蕉新材料的分子指紋圖譜，以期為航天香蕉新品種的鑒定和分類提供參考。

1材料與方法

1.1材料

供試香蕉種質(zhì)共20份，包括3個基因型（AAA、ABB、AA），其中18份來自廈門市園林植物園熱帶作物品種資源庫香蕉種質(zhì)圃，2份航天誘變香蕉材料（即航蕉1號和航蕉2號）由航天神舟生物科技集團有限公司提供（表1）。2份航天誘變香蕉材料是以巴西蕉為親本，通過航天誘變、篩選而得。

以新鮮卷筒嫩葉作為提取香蕉DNA的材料。采集葉片組織時，按不同品種分別做好標識，迅速清洗擦凈，并盡快用液氮速凍處理，再轉至–80℃超低溫冰箱保存，備用。

1.2方法

1.2.1DNA的提取采用CTAB法提取DNA，主要步驟如下：（1）在液氮中將葉片組織迅速研磨至粉末狀，再迅速轉入2mL離心管中；加入1mL3%CTAB裂解液和20μLβ-巰基乙醇，搖勻，65℃水浴20～30min；（2）10000r/min離心10min，取上清液，加入500μL氯仿∶異戊醇（24∶1）溶液，混勻；（3）重復上一步驟；（4）10000r/min離心10min，吸取上清夜，加入2/3體積的異丙醇，混勻；（5）10000r/min離心5min，棄上清夜，留下絮狀沉淀，加入200～300μL70%乙醇清洗，再離心5min；（6）待乙醇揮發(fā)后，將沉淀用200μLddH2O保存于4℃下，備用（長期保存于–20℃冰箱）。

1.2.2PCR反應和電泳檢測采用反應體系：10μL2×TaqPCRmixture，2μLPrimer（10μmol/L），30ngDNAtemplate，加重蒸水補足至20μL。

PCR擴增循環(huán)體系：反應條件為94℃預變性4min；94℃變性30s，54℃退火40s，72℃延伸90s，45個循環(huán)；最后72℃延伸6min，于4℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖上進行電泳檢測，拍照記錄檢測結果。

1.3數(shù)據(jù)處理

根據(jù)電泳檢測結果，采用人工計數(shù)的方法讀取條帶并統(tǒng)計，同一條引物擴增出的相同條帶記為數(shù)值1，無相同條帶則記為0，由此構建出0-1數(shù)據(jù)矩陣。根據(jù)所得到的數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSYSpcversion2.10e統(tǒng)計軟件計算各香蕉種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)（coefficient），并采用該軟件中的非加權組平均法（unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans，UPGMA）進行聚類分析[9]。

2結果與分析

2.1ISSR標記多態(tài)性分析

從30條ISSR引物中，篩選出清晰、穩(wěn)定性高、重復性好的2條擴增條帶，并呈多態(tài)性的引物（表2、圖1）。2條ISSR引物在20份香蕉種質(zhì)資源中，共擴增獲得17條清晰的條帶，條帶的片段長度范圍為300～2500bp，其中多態(tài)性條帶共有13條，平均多態(tài)性比率為76.47%。

在17條總條帶的17個位點中，航蕉1號（20號泳道）相比親本巴西蕉（16號泳道）有4個特異性位點，另有13個相似位點，特異性位點占23.53%；航蕉2號（19號泳道）相比親本巴西蕉有3個特異性位點，另有14個相似位點，特異性位點占17.65%。

由此可見，參試的20份香蕉種質(zhì)資源具有較高的ISSR多態(tài)位點，在DNA分子水平上的遺傳多樣性比較豐富。同時，供試的航天香蕉材料（即航蕉1號和航蕉2號）與親本巴西蕉之間存在明顯的差異性。

2.2航天香蕉材料的遺傳特異性分析

ISSR引物UBC881的擴增結果顯示：在分子量為1000bp的位置，1、3～20號泳道均有1條明亮的特異性條帶，僅2號柴蕉的條帶較弱；7號貢蕉在分子量約為1300bp的位置無特異性條帶，其他材料均有條帶擴增；在分子量分別約為2000bp和2500bp的位置，19號泳道上的航蕉2號和20號泳道上的航蕉1號均無條帶擴增（圖1A，箭頭所示位置），而其他香蕉種質(zhì)，包括親本巴西蕉（16號泳道）在此位置均有擴增產(chǎn)物。因此，ISSR引物UBC881可以將2個航天香蕉材料與親本巴西蕉，以及柴蕉、貢蕉等其他18個香蕉種質(zhì)區(qū)分開。

ISSR引物UBC847電泳結果顯示：在分子量約為1800bp位置，2號泳道存在特異性條帶缺失的現(xiàn)象；約800bp位置，7號泳道存在特異性條帶缺失的現(xiàn)象；在分子量約為750bp的位置，航蕉1號（泳道20）和3號有1條較明顯的亮色條帶（圖1B，箭頭所示位置），而其他香蕉種質(zhì)，包括親本巴西蕉（16號泳道）在該位置無擴增條帶。由此可見，ISSR引物UBC847可以將航天香蕉材料航蕉1號與航蕉2號，以及其他18種香蕉種質(zhì)進行區(qū)分。

2.3香蕉種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)

根據(jù)0-1數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSYSpcversion2.10e統(tǒng)計軟件計算各香種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)（表3）。20個供試香蕉種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)介于0.545～1.000之間，平均遺傳相似性系數(shù)為0.905。

其中華南甜蕉、漳州選、河口高把、天寶矮蕉、龍州中把、廣東2號、齊尾、安定高芽、菲律賓之間，以及高腳遁地雷、威廉斯8188、索馬里強、北大矮、巴西蕉之間的遺傳相似性系數(shù)最大，為1.000，顯示各個種質(zhì)間具有較近的親緣關系。柴蕉與貢蕉之間的遺傳相似性系數(shù)最小，為0.545，說明它們彼此之間存在較大的遺傳差異。

航天香蕉材料航蕉1號與航蕉2號之間的遺傳相似性系數(shù)為0.952，航蕉2號與其他18個香蕉品種間的遺傳相似性系數(shù)為0.667～0.909，航蕉1號與其他18個香蕉種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)為0.636～0.870。其中航蕉1號（20號材料）與親本巴西蕉（16號材料）的遺傳相似性系數(shù)為0.833；航蕉2號（19號材料）與親本巴西蕉的遺傳相似性系數(shù)為0.870。

綜上，2種航天香蕉材料之間、2種航天香蕉材料與親本巴西蕉之間、以及2種航天香蕉材料與其他17個香蕉種質(zhì)間均具有一定的遺傳差異，從數(shù)值上來看，在DNA分子水平上，航蕉1號與其他18個香蕉種質(zhì)的遺傳差異大于航蕉2號。

2.4香蕉種質(zhì)資源聚類分析

基于ISSR擴增結果，根據(jù)20份香蕉種質(zhì)的遺傳相似性系數(shù)，按照UPGMA法進行聚類分析得到親緣關系樹狀圖（圖2）。從圖2可以看出，設定遺傳相似性系數(shù)為0.850時，供試的20份香蕉種質(zhì)群體可簡單地分為2個類群（Ⅰ、Ⅱ），其中類群Ⅰ僅有柴蕉1種，其他19種香蕉種質(zhì)均歸為類群Ⅱ，說明柴蕉與其他19種香蕉之間的親緣關系較遠。在類群Ⅱ中，當設定遺傳相似性系數(shù)為0.880時，即可判斷供試的目標材料航蕉1號、航蕉2號與親本巴西蕉，以及其他16種香蕉材料的親緣關系有較大差異。當設定遺傳相似性系數(shù)為0.900時，類群Ⅱ又分為4個亞類，即航蕉1號和航蕉2號為1個亞類（Ⅱa），貢蕉為1個亞類（Ⅱb），那龍高把和那坡高把為1個亞類（Ⅱd），其他14種香蕉品種為1個亞類（Ⅱc），4個亞類之間聚類差異明顯。當遺傳相似性系數(shù)為0.960時，可分為8類，可看出航天香蕉材料航蕉1號和航蕉2號之間有明顯的聚類差異，存在遺傳多樣性。而華南甜蕉、漳州選、河口高把、天寶矮蕉、龍州中把、廣東2號、齊尾、安定高芽、菲律賓之間，以及高腳遁地雷、威廉斯8188、索馬里強、北大矮、巴西蕉之間無明顯的聚類差異，說明這些種質(zhì)間親緣關系相對較近。

3討論

目前，ISSR分子標記技術在植物遺傳育種以及種質(zhì)資源研究中已得到廣泛應用，范圍涉及糧、油、果、蔬作物以及觀賞、藥用植物等。張超等[10]應用ISSR標記技術對103份裸大麥進行分析，得出裸大麥的地理分布與遺傳多樣性的關系。丁燦等[11]通過ISSR標記對油棕新品種進行了遺傳多樣性分析。趙依杰等[12]利用ISSR標記技術，鑒定了枇杷的新品種東湖早。周成城等[13]采用ISSR標記對18份櫻屬材料進行了有效區(qū)分和鑒定，并進一步分析了材料之間的親緣關系。ISSR標記技術在香蕉方面的研究也有報道，包括香蕉種質(zhì)資源[14-15]、遺傳多樣性[16-18]、親緣關系[19-20]、品種選育[21-22]、抗病性研究[23-24]等。這些研究充分說明了ISSR分子標記技術在香蕉研究應用上的可行性。

浩瀚無際的太空已然成為人類探索研究農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物育種的新基地。本課題組所選育的2份航天香蕉材料（航蕉1號和航蕉2號）是以巴西蕉為母本，在航天空間誘變的基礎上，經(jīng)過連續(xù)栽培選育出來的。本研究在ISSR分子標記的層面上，從30條引物中，篩選出2條引物構建DNA數(shù)字化指紋圖譜進行遺傳特異性分析，得出供試的目標材料航蕉1號與航蕉2號存在特異性位點可區(qū)別于其他18份香蕉種質(zhì)，航蕉1號相比親本巴西蕉特異性位點占23.53%，航蕉2號相比親本巴西蕉特異性位點占17.65%。航蕉1號與巴西蕉的遺傳相似性系數(shù)為0.833，航蕉2號與巴西蕉的遺傳相似性系數(shù)為0.870，2種航天材料與其他18份香蕉種質(zhì)存在明顯的聚類差異。結合田間觀察，航蕉1號、航蕉2號與親本巴西蕉在表型性狀上也存在一定的差異，如植株大小、果穗果實形態(tài)、果實產(chǎn)量等性狀。根據(jù)試驗結果分析得出，航蕉1號、航蕉2號與母本巴西蕉（基因型均為AAA）三者之間，以及與其他17份香蕉種質(zhì)之間存在明顯的遺傳特異性，研究結果為新品種的分類鑒定和保護提供了科學依據(jù)，也為香蕉種質(zhì)資源的創(chuàng)新和新品種選育提供參考。

根據(jù)聚類分析結果，結合各香蕉種質(zhì)的基因型特點，可以得出柴蕉（基因型為ABB）和貢蕉（基因型為AA）之間存在差異，同時與其他香蕉種質(zhì)（基因型為AAA）之間也有明顯不同的表現(xiàn)，可以初步說明基因型不同的香蕉種質(zhì)之間親緣關系相對較遠，表現(xiàn)出明顯的遺傳差異，這與前人的研究結果[16-17]基本一致。雖然巴西蕉是2種航天香蕉材料的親本，但是從聚類圖可以看出，航蕉1號、航蕉2號與巴西蕉之間的遺傳距離相對較遠，說明航天搭載可使巴西蕉的遺傳物質(zhì)在某些特定的位點發(fā)生較大的改變，充分證明了航天搭載是一種非常行之有效的誘變育種技術，故而可從變異后代中選育出新品種[24]。但是，航蕉1號、航蕉2號與巴西蕉之間的遺傳距離相對較遠，以及基因型AA的貢蕉與基因型為AAA的香蕉材料未被簡單地分成2類，這并不排除由于本研究為了區(qū)分2份航天香蕉目標材料與其他材料之間的遺傳差異，而篩選所用的引物數(shù)量較少的原因。