茶樹OSCA基因家族的鑒定及表達分析

劉丹丹 吳瓊 焦小雨 孫明慧 王文杰

關鍵詞：茶樹；OSCA基因家族；Ca2+通道；全基因組表達分析

茶樹[Camelliasinensis（L.）O.Kuntze]是一種多年生常綠木本植物[1]，喜漫射光、溫暖潮濕的氣候以及弱酸性土壤[2]。低溫、干旱、長期輻射、病蟲害等非生物脅迫和生物脅迫都會對茶樹生長產生不利影響[3-4]。其中干旱脅迫通過影響茶樹生長的土壤和水分條件，嚴重降低茶葉的產量和品質[5]。研究人員對9個不同品種13a樹齡的茶樹進行40d干旱處理，茶葉產量下降27.27%～68.53%[6]。同時，咖啡因、兒茶素、茶氨酸和游離氨基酸等代謝物也顯著較少[1]，從而降低茶葉品質。因而研究茶樹是如何特異感受干旱脅迫產生信號的分子機理，挖掘相關的抗旱基因，進而通過分子育種技術獲得抗性優(yōu)良品種具有重要的研究意義和實用價值。

鈣通透性陽離子通道蛋白（hyperosmdalitygatecalcium-permeablechannels，OSCA），是一種Ca2+機械敏感通道[7]，是目前發(fā)現(xiàn)的第一個植物高滲脅迫感受蛋白[8]。OSCA基因于2014年在擬南芥中首次報道。研究人員用山梨糖醇模擬干旱條件處理表達了水母發(fā)光蛋白的擬南芥植株后，利用Ca2+成像技術發(fā)現(xiàn)osca1突變體胞內鈣離子相比于野生型釋放量顯著減少，然而用不具有滲透脅迫的Ca2+誘導劑H2O2處理時，突變體與野生型之間并無明顯差異，表明OSCA1是特異性滲透脅迫感受器[8]。OSCA1會在擬南芥的葉、花、根以及保衛(wèi)細胞等處表達，當進行高滲處理時，突變體的氣孔開度不會減小，根系生長受到抑制，也說明了OSCA1對于滲透感受的重要性[8]。擬南芥osca1突變體中OsOSCA1.4的過表達補充了Ca2+信號傳導、根生長和氣孔運動的缺陷，以響應高滲和鹽脅迫[9]。在高滲環(huán)境下，AtOSCA1.2通過增加細胞內的Ca2+濃度，增強對Na+和K+的通透性[10]。植物感知生物和非生物脅迫后往往會引起氣孔的關閉[11]，鈣通過質膜的快速流入在這種反應中起著重要作用[12]。THOR等[13]報道了擬南芥Ca2+滲透通道AtOSCA1.3在免疫信號轉導過程中控制氣孔關閉，然而AtOSCA1.3并不調節(jié)脫落酸誘導的氣孔關閉。此外，OSCA作為一種Ca2+非選擇性陽離子通道蛋白，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。有研究指出，OSCA基因家族在植物花中特異表達[14]，參與滲透脅迫下的植物花粉的萌發(fā)和花粉管的發(fā)育[3，15-16]?？傊?，OSCA家族成員在感受高滲脅迫上是保守的，但在誘導植物產生的抗逆途徑上又有區(qū)別。

OSCA基因家族對植物生長發(fā)育和響應逆境脅迫都至關重要，并已經在擬南芥[8]、煙草[16]、水稻[14]、小麥[17]等物種中做了系統(tǒng)的鑒定與功能分析。然而，目前關于茶樹OSCA基因家族相關研究暫未見報道。因此，我們對茶樹OSCA家族成員進行了全基因組鑒定與系統(tǒng)發(fā)育關系分析，并分析了不同組織和干旱脅迫下的表達情況。本課題的開展為后續(xù)深入解析茶樹OSCA基因在干旱環(huán)境應答中生物學功能和分子機制提供重要參考，有助于進一步研究植物滲透脅迫鈣信號通路，為茶樹抗性育種提供新的思路。

1材料與方法

1.1材料

干旱脅迫材料：選取安徽省農業(yè)科學院茶葉研究所苗圃中生長良好、長勢一致的1年生茶樹品種舒茶早茶苗，于人工氣候室（24±2）℃的環(huán)境溫度下穩(wěn)定生長，轉移至PEG-6000溶液（濃度為20%）中進行干旱處理，收集0、15、30min和1、2、4、8、12、24、48h后的第二葉。

組織樣本：7月份安徽省農業(yè)科學院茶葉研究所全國第五輪區(qū)試園所在的屯溪區(qū)降水量少，茶園土壤干燥，茶農98（CN98）品種已出現(xiàn)明顯的干旱脅迫癥狀，嶗山3號（LS3）和中黃1號（ZH1）未出現(xiàn)明顯的干旱脅迫癥狀，此外結合區(qū)試園中多年抗旱性觀測數據，將此次實驗樣品LS3和ZH1定義為耐旱型品種，CN98定義為干旱敏感型品種。選取上述3個茶樹品種（LS3、ZH1和CN98）的成熟葉第二葉，取樣時間為2022年8月3日上午9點。以上每種處理均設置3次重復，樣本采集后，置于液氮速凍，轉移至–80℃冰箱備用。

1.2方法

1.2.1茶樹OSCA基因家族成員鑒定與染色體定位分析從擬南芥基因組數據庫（https：//www.arabidopsis.org/tools/bulk/sequences/index.jsp）下載擬南芥OSCA基因家族蛋白序列及其功能分類信息。根據擬南芥OSCA基因家族的蛋白序列在茶樹基因組數據庫（http：//tpia.teaplant.org）在線Blast比對茶樹原變種（C.sinensisvar.sinensis）舒茶早品種的最新版基因組蛋白序列，根據比對結果下載候選序列蛋白并去冗余。為了進一步驗證所鑒定的茶樹OSCA基因家族，使用NCBI保守結構域數據庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對所有檢索到的序列進行篩選，以確定蛋白質是否含有DUF221結構域，最終得到茶樹OSCA基因家族成員12個。為了研究CsOSCA蛋白質的性質，使用在線的ExPASy-ProtParam工具（web.expasy.org/protparam/）預測分子量（MW）和等電點（pI），利用Softberry（http：//linux1.softberry.com/all.htm）中的ProtComp程序預測上述候選OSCA蛋白的亞細胞定位。從茶樹的基因注釋文件（GFF3）中檢索CsOSCAs基因的信息，利用Tbtools（v1.09867）軟件中的GeneLocationVisualizefromGTF/GFF進行染色體定位可視化繪圖。

1.2.2茶樹OSCA基因家族蛋白二級結構、保守基序、基因結構分析使用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi？id=index）在線工具分析CsOSCA蛋白二級結構和跨膜結構域。另外，使用MEME（http：//memesuite.org/tools/meme）在線分析CsOSCAs蛋白的保守基序，基序數目設置為20，其他參數設置為默認值。利用Pfam數據庫（http：//pfam.xfam.org/search#tabview=tab1）搜索CsOSCA基因家族保守Pfam得到的結果文件用TBTools軟件進行可視化繪圖。在茶樹基因注釋（GFF3）文件中檢索CsOSCAs基因的外顯子-內含子結構信息，導入在線程序GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）比較各自的全長序列結構并生成圖表。

1.2.3茶樹OSCA基因家族系統(tǒng)進化樹分析根據文獻信息下載擬南芥[8]和水稻[14]OSCA基因家族蛋白序列，使用MEGA7（https：//itol.embl.de/）在線軟件中的ClustalW方法對茶樹、擬南芥和水稻OSCA蛋白序列進行比對，使用鄰接法（neighbor-joiningmethod）構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4茶樹OSCA基因家族啟動子順式作用元件與反式作用因子預測分析為了分析OSCA基因家族啟動子序列中可能存在的順式元件，使用TBTools軟件批量提取OSCA基因家族成員ATG上游的1500bp的啟動子序列區(qū)域，將上一步獲得的啟動子序列放進PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線網站分析啟動子的順式作用元件，根據返回結果tab文件篩選統(tǒng)計與逆境脅迫相關的順式元件，使用Tbtools軟件的ImpleBioSequenceViewer功能繪圖。

CsOSCAs基因啟動子可能結合的反式作用因子預測以擬南芥為參考，在JASPAR（https：//jaspar.genereg.net/）數據庫的Plantae模塊中選擇與干旱脅迫相關的轉錄因子家族AP2/EREDP、bZIP、DOF、MYB和WRKY成員共計181個轉錄因子，添加到購物車，輸入ATG上游的1500bp的啟動子序列區(qū)域，Relativeprofilescorethreshold選擇95%，根據預測結果統(tǒng)計出相對分數大的轉錄因子。

1.2.5茶樹OSCA基因家族組織特異性分析在NCBI中下載茶樹在不同組織的RNA-seq數據（登錄號：PRJNA79643）。使用TBtools（v1.082）軟件中HeatMap對各轉錄組基因的FPKM值進行歸一化處理并進行表達模式可視化分析。

1.2.6茶樹RNA的提取和實時熒光定量PCR用TBtools（v1.082）軟件提取已下載的茶樹基因組數據庫中茶樹OSCA基因家族的CDS序列，并通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）在線網站進行引物設計（表1）。選用茶樹β-actin（登錄號：KJ946252）作為內參基因。采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取上述處理的總RNA，電泳檢測完整性。使用PrimeScriptTMRTMasterMix（perfectrealtime）試劑盒合成cDNA用于實時熒光定量PCR。利用LightCycle?96熒光定量PCR儀[羅氏診斷產品（上海）有限公司]進行qRT-PCR，反應程序為：94℃30s；94℃5s，60℃30s，40個循環(huán)；反應體系參照SYBRGreenProTaqHSqPCRKit試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司），反應結束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線，每個樣品均設置3次技術重復。

1.3數據處理

用2?ΔΔCT算法計算基因相對表達水平，使用SPSS17.0軟件對數據進行差異顯著性分析，使用GraphPadprism5軟件繪圖。

2結果與分析

2.1茶樹OSCA基因家族成員的鑒定與染色體定位

經過與擬南芥OSCA基因家族蛋白序列比對去冗余，蛋白結構域分析驗證，最終獲得12個OSCA基因家族成員（表2）。CsOSCAs基因編碼的氨基酸序列長度為667～831bp。蛋白分子量在76630.55～93563.99kDa之間，等電點在6.15～9.33之間，含有9～12個跨膜結構域。通過與擬南芥基因家族成員進行比對，按照茶樹基因組編號順序將其分別命名為CsOSCA1～CsOSCA12。

根據茶樹基因組信息，茶樹OSCA基因家族在染色體上的分布均勻（圖1），10個CsOSCAs基因定位于茶樹7條染色體上，2個OSCA基因定位于未錨定染色體的contig上，其中8號染色體上有3個OSCA基因，數量最多。

2.2茶樹OSCA基因家族蛋白的二級結構、保守基序、基因結構分析

蛋白質二級結構的預測結果顯示，茶樹OSCA基因編碼的蛋白二級結構含有大量的跨膜結構和α-螺旋（表3），α-螺旋的比例在60%～68%之間，跨膜螺旋在32%～38%之間，另外還含有12%～23%的不規(guī)則卷曲以及少量的β-轉角。

為了進一步分析茶樹OSCA家族基因的保守性，分析其保守序列和保守基序。如圖2A所示，茶樹OSCA基因家族蛋白均含有3個保守結構域，分別是lateexocytosis（RSN1_TM，Pfam：PF13967）、cytosolicdomainof10TMputativephosphatetransporter（DUF4463，PHM7_cyt，Pfam：PF14073）和calciumdependentchannel（DUF221，RSN1_7TM，Pfam：PF02714）。保守基序結果顯示，除了CsOSCA5以外，其他CsOSCA序列均高度保守，motif1、motif4、motif9屬于PHM7_cyt結構域，motif2、motif3、motif5、motif12構成RSN1_7TM結構域，motif6、motif8、motif11、motif15、motif17構成RSN1_TM。CsOSCA2、CsOSCA3、CsOSCA4、CsOSCA7和CsOSCA11蛋白基序組成模式相似，CsOSCA9和CsOSCA12保守基序組成相似，CsOSCA1、CsOSCA8和CsOSCA10保守基序組成相似（圖2B）。

根據茶樹OSCA基因家族結構繪制的圖譜（圖3）可以看出，CsOSCA11基因的序列最長，12個CsOSCAs基因外顯子數量范圍在1～11個之間，其中CsOSCA2、CsOSCA3、CsOSCA4、CsOSCA7、CsOSCA8和CsOSCA11的外顯子數量為11個，CsOSCA6、CsOSCA10的外顯子數量為10個，CsOSCA1的外顯子數量為9個，CsOSCA9和CsOSCA12外顯子數量均為6個，CsOSCA5的外顯子數量為1個。

2.3茶樹OSCA基因家族蛋白系統(tǒng)進化樹分析

利用擬南芥（15個）、水稻（11個）與茶樹（12個）OSCA家族蛋白全長序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。根據系統(tǒng)進化關系，這38個OSCA蛋白可分為4個亞族，分別命名為Ⅰ～Ⅳ。茶樹、擬南芥和水稻在4個亞族中均有分布。茶樹OSCA基因家族中有5個明顯的垂直同源基因對，分別是：Ⅰ亞族的CsOSCA4和擬南芥OSCA1.7，Ⅱ亞族的CsOSCA8和擬南芥OSCA2.2、CsOSCA1和水稻OsOSCA2.5，Ⅳ亞族的CsOSCA6和水稻OsOSCA4.1，CsOSCA5和擬南芥OSCA4.1。

2.4茶樹OSCA基因家族組織特異性表達

通過分析芽（bud）、花（flower）、果實（fruit）、嫩葉（youngleaf）、成熟葉（matureleaf）、老葉（oldleaf）、根（root）和莖（stem）8個茶樹組織轉錄組數據[18]，繪制茶樹OSCA家族在茶樹不同組織中的表達模式熱圖（圖5）。CsOSCA3、CsOSCA6和CsOSCA7在芽中表達量較高；CsOSCA1、CsOSCA4、CsOSCA9在花中表達量較高，在其他組織中含量很低或不表達；CsOSCA2、CsOSCA6、CsOSCA7在根中的表達量較高；CsOSCA8在老葉中表達量較高；CsOSCA10在成熟葉、老葉和莖中表達量較高；CsOSCA11在莖中表達量較高，在其他組織中表達量較低；CsOSCA12在嫩葉中表達量最高。

2.5CsOSCAs基因在不同抗旱品種間的表達分析

為了研究CsOSCA基因家族成員在不同抗旱品種間的表達情況，選擇抗旱較好的LS3、ZH1品種和抗旱較差的CN98品種為實驗材料，對茶樹OSCA基因家族進行實時熒光定量檢測。結果顯示，CsOSCA2、CsOSCA3、CsOSCA11、CsOSCA12基因在干旱敏感的品種CN98中的含量顯著高于其他2個品種（圖6）。

2.6CsOSCAs基因在干旱脅迫下的表達分析

為了明確茶樹OSCA基因家族成員對干旱脅迫的響應規(guī)律，使用20%PEG-6000模擬干旱脅迫處理1年生舒茶早茶苗，利用qRT-PCR分析CsOSCAs基因的表達情況。如圖7所示，20%PEG-6000處理下，1h內CsOSCA3、CsOSCA5、CsOSCA8、CsOSCA10、CsOSCA11、CsOSCA12表達量明顯上調，其中CsOSCA3、CsOSCA5、CsOSCA8、CsOSCA10、CsOSCA12基因在處理15min時表達量顯著增加，此時CsOSCA10基因相對表達量是對照的3.43倍。CsOSCA2在24h表達量最高，是對照的3.92倍。CsOSCA3和CsOSCA12表達模式相似，在12h表達量較高，是對照的2.68倍和4.82倍，而后表達量降低。CsOSCA5、CsOSCA8和CsOSCA10在PEG-6000處理后一直維持比較高的表達量。

2.7茶樹OSCA基因家族啟動子順式元件分析與上游調控轉錄因子預測

為了研究CsOSCAs基因對各種信號因子的應答作用，對CsOSCAs基因啟動子上游1500bp序列進行在線分析，發(fā)現(xiàn)CsOSCAs上游啟動子存在光周期調控（photoperiodcregulation）、植物激素（hormones）、生物脅迫（bioticstress）和非生物脅迫（abioticstress）相關的元件（圖8）。光周期調控相關元件包括3-AF1bindingsite、ACE、AE-box、GA-motif、G-box等19種。響應植物激素相關的元件主要有ABRE、ARE響應脫落酸；CGTCA-motif、TGACG-motif響應茉莉酸甲酯；GARE-motif、P-box、TATC-box響應赤霉素；TCA-element響應水楊酸；TGA-element響應生長素。與生物脅迫相關的元件有：GC-motif參與缺氧特異性誘導；LTR響應低溫；MBS干旱誘導；STRE、TCA響應脅迫誘導。與非生物脅迫相關的元件有AT-richelement、AT-richsequence、TC-richrepeats響應防御與脅迫；Wbox、WRE3、WUN-motif響應傷害。在CsOSCAs中含有最多的順式作用元件是ARE脫落酸響應元件，大部分的基因都存在Box4、G-box、GT1-motif等光響應元件，6個CsOSCA含有干旱誘導響應元件。

啟動子區(qū)域一般富含豐富的順式作用元件，通過與反式作用因子結合來調控下游基因的表達。根據干旱脅迫下CsOSCA基因家族成員的響應規(guī)律，對干旱脅迫響應強烈的CsOSCA2、CsOSCA3、CsOSCA5、CsOSCA8、CsOSCA10、CsOSCA11、CsOSCA12基因上游啟動子序列可能結合的轉錄因子進行預測，并統(tǒng)計出共同的上游調控轉錄因子（relativescore>0.95）（表4）。結果顯示，DOF家族成員AtDOF2.4、AtDOF5.3、AtDOF5.6和AtWRKY40能同時與這7個基因的啟動子結合。

3討論

本研究利用茶樹全基因組測序數據信息全面分析OSCA基因家族，共挖掘12個CsOSCAs基因。根據系統(tǒng)進化關系，茶樹OSCA基因家族可劃分為4個亞族，與小麥[17]、玉米[19]、煙草[16]、綠豆[20]和梨[3]等物種研究結果一致。擬南芥中脫水早期反應蛋白4（early-responsivetodehydration，ERD4；即AtOSCA3.1）在受到干旱脅迫時會特異性啟動轉錄[21]。本研究中，CsOSCA9和CsOSCA12與AtOSCA3.1同屬III亞族，它們是否參與茶樹的干旱脅迫響應機制，還需進一步研究。

亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，茶樹OSCA基因家族成員均定位在質膜上，與大豆[22]OSCA基因家族成員相一致。研究表明，OSCAs蛋白序列中存在11個TMs[7，23-25]，然而本研究中CsOSCA1和CsOSCA5分別包含9個和12個TMs，推測他們在進化過程中可能具有更大的遺傳變異。CsOSCA基因家族同一亞族成員外顯子數量相近，而CsOSCA5外顯子數量只有一個，在水稻[14]和番茄[26]中也存在這種單個外顯子的情況。DUF221結構域在CsOSCA基因家族中高度保守，含有7個鈣通道跨膜結構域，命名為RSN1_7TM[10]。在分析CsOSCA基因家族成員蛋白結構時發(fā)現(xiàn)，茶樹OSCA基因家族成員均包含DUF221結構域，但是CsOSCA5有2段DUF221結構域，保守基序分析也發(fā)現(xiàn)CsOSCA5包含的保守基序比其他基因更少。本研究中，CsOSCA5與AtOSCA4.1為垂直同源基因對，且CsOSCA5基因對PEG脅迫響應明顯，可能CsOSCA5中的抗逆功能在進化過程中被保留了下來。

本研究中，CsOSCAs基因對PEG-6000誘導的干旱脅迫有響應，這與擬南芥[8]、水稻[14]、玉米[19]、小麥[17]和綠豆[20]等植物中的研究結果一致。在滲透脅迫下，CsOSCA2、CsOSCA3、CsOSCA5、CsOSCA8、CsOSCA10和CsOSCA12基因顯著上調，除了CsOSCA2以外，其他5個基因在15min內均顯著上調，推測與Ca2+響應速度快有關，其他植物如水稻[14]、番茄[26]、玉米[27]和大豆[22]OSCA基因家族對干旱脅迫的響應也出現(xiàn)在早期。此外，本研究分析了不同耐旱品種間CsOSCA基因家族成員在夏季干旱脅迫下的表達差異，發(fā)現(xiàn)CsOSCA2、CsOSCA3、CsOSCA11、CsOSCA12基因在干旱敏感型的茶農98中的表達量顯著高于其他2個抗旱品種，推測這些基因可能在茶農98茶樹中被誘導表達參與茶樹的抗旱反應。CsOSCA2、CsOSCA3、CsOSCA12不僅在PEG處理下誘導表達，在不同品種間表達也存在顯著差異，因此CsOSCA2、CsOSCA3、CsOSCA12可能是茶樹響應干旱脅迫的關鍵候選基因。

前人研究結果[14，26]指出OSCA基因對ABA脅迫反應強烈。本研究對12個CsOSCA基因啟動子分析顯示，其中11個基因啟動子含有ARE脫落酸響應元件，這些基因是否響應ABA脅迫以及干旱脅迫中的ABA信號轉導值得進一步研究。CsOSCA6、CsOSCA7、CsOSCA9、CsOSCA10、CsOSCA11和CsOSCA12啟動子包含干旱誘導響應元件，然而在PEG脅迫下只有CsOSCA10、CsOSCA11和CsOSCA12顯著上調。推測CsOSCA10、CsOSCA11和CsOSCA12在茶樹響應干旱脅迫過程中發(fā)揮著主要作用。轉錄因子預測結果顯示DOF家族成員AtDOF2.4、AtDOF5.3、AtDOF5.6和AtWRKY40可以多數CsOSCAs基因的啟動子結合。有研究指出大部分茶樹DOFs轉錄因子家族對干旱脅迫有響應[28-29]，推測CsDOFs轉錄因子可能參與調控CsOSCA基因家族響應干旱脅迫產生的信號感受與傳導，目前本課題組正在對其互作關系進行驗證。