短鏈氯化石蠟對人體正常肝細(xì)胞的代謝干擾

羅 云, 耿檸波, 陳雙雙, 程 琳, 張海軍, 陳吉平

(1. 臨沂大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 山東 臨沂 276005; 2. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116023)

氯化石蠟(chlorinated paraffins, CPs)是一類人工合成的氯代正構(gòu)烷烴,其分子式為CnH2n+2Clm,氯含量為30%～70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。根據(jù)碳鏈長度的不同,CPs可分為短鏈氯化石蠟(short-chain chlorinated paraffins, SCCPs, C10～C13)、中鏈氯化石蠟(medium-chain chlorinated paraffins, MCCPs, C14～C17)和長鏈氯化石蠟(long-chain chlorinated paraffins, LCCPs, C18～C30)[1]。因具有良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性,SCCPs被用作增塑劑和阻燃劑,并廣泛添加在金屬加工液、涂料、密封劑、黏合劑、皮革處理劑、塑料和橡膠中[2,3]。與MCCPs和LCCPs相比,SCCPs具有更低的相對分子質(zhì)量、更高的蒸汽壓和更高的水溶性,因此更容易釋放到環(huán)境中[4]。由于SCCPs具有生物持久性以及遠(yuǎn)距離遷移能力、能夠生物積累并帶來一定的生物毒性,2017年斯德哥爾摩公約將其列入《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》附件A的受控清單中[5]。此外,1990年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將平均碳鏈長度為12和平均氯化程度為60%的SCCPs歸類為2B類潛在致癌物[6]。由于大規(guī)模生產(chǎn)和廣泛的工業(yè)應(yīng)用,SCCPs在各種環(huán)境介質(zhì)、生物樣本以及人體血液、母乳和臍帶血中被頻繁檢出[7-12]。人體母乳和血液中SCCPs的污染水平是評估SCCPs健康風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)。據(jù)研究報(bào)道,在中國四川省收集的母乳中SCCPs含量為29.2～270.7 ng/mL[11],在中國湖北省收集到的孕婦外周血中SCCPs含量為15.9～584 ng/mL[11]。因此,SCCPs對野生動(dòng)植物和人類構(gòu)成了潛在危害,對其進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和健康風(fēng)險(xiǎn)評估迫在眉睫。

據(jù)報(bào)道,SCCPs對水生生物、兩棲動(dòng)物、鳥類、哺乳動(dòng)物、體外細(xì)胞以及土壤生物均產(chǎn)生多種毒性效應(yīng),如神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)、肝毒性、腎毒性、發(fā)育毒性、致死效應(yīng)以及致癌效應(yīng)[13,14]。研究者也廣泛研究了SCCPs的毒性作用機(jī)制,他們發(fā)現(xiàn)SCCPs的毒性作用機(jī)制主要集中在氧化損傷、生物膜損傷、能量代謝抑制以及過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)激活、雌激素受體(ERα)激活、組成型雄烷受體(CAR)激活和β2腎上腺素能受體(β2-AR)等毒性作用通路的激活上[1,15]。高劑量SCCPs的長期暴露可能誘發(fā)多器官損傷。其中,肝臟是SCCPs最主要的毒性靶點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道,暴露于SCCPs(1 000 mg/kg)16天后,SD大鼠的肝臟明顯增大,肝細(xì)胞高度脂肪變性,肝竇變窄,肝組織出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死,炎性細(xì)胞發(fā)生浸潤,纖維組織出現(xiàn)增生。大鼠經(jīng)SCCPs暴露后,誘發(fā)了肝臟過氧化物酶體增殖以及細(xì)胞質(zhì)中脂肪滴數(shù)量增加[17]。目前,研究者對SCCPs肝毒性的研究集中在動(dòng)物身上。SCCPs的致癌機(jī)制難以實(shí)現(xiàn)從嚙齒類動(dòng)物到人體的外推。如SCCPs對大鼠肝臟PPARα受體的激活作用和致肝癌有一定的關(guān)系。然而,PPARα受體在嚙齒動(dòng)物中高度表達(dá),而在人體內(nèi)是低表達(dá)的。因而,SCCPs通過PPARα受體的激活而產(chǎn)生致癌效應(yīng)的機(jī)制在人體中可能并不適用[18]。因此,SCCPs對人體的毒性效應(yīng)和機(jī)制研究有待進(jìn)一步開展。

在過去的十幾年中,組學(xué)技術(shù)(如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué))的重大進(jìn)步使得研究者對各種生物過程的生物分子的高通量監(jiān)測成為可能。組學(xué)技術(shù)在揭示外界因素作用于生物體的機(jī)制方面顯現(xiàn)出了極其重要的作用,是毒性機(jī)制機(jī)理研究可以依賴的技術(shù)手段[19,20]。為評估SCCPs暴露對人體的潛在健康風(fēng)險(xiǎn),本研究以人體正常肝細(xì)胞L02為模式細(xì)胞,以代謝組學(xué)技術(shù)為研究手段,從分子水平上探究了SCCPs肝毒性的代謝干擾機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Q-TOF 6540超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國Agilent公司);Q-Trap 5500超高效液相色譜(美國Waters公司)-四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司);氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司);臺式高速低溫離心機(jī)(Biofuge?Stratos,德國Heraeus公司);倒置顯微鏡(南京江南光電股份有限公司);真空冷凍干燥儀(美國LABCONCO公司);渦旋振蕩儀(G-560E,美國Scientific Industries公司)。

L02細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。SCCPs(C10～C13, 56.5%Cl)標(biāo)樣為C10-、C11-、C12-、C13-CP的1∶1∶1∶1(物質(zhì)的量比)的混合標(biāo)樣,平均氯含量(以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì))為56.5%,按照Tomyet等[21]報(bào)道的正烷烴氯化的方法在實(shí)驗(yàn)室合成。細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑均購自美國Gibco公司,包括:細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI 1640)、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶以及PBS緩沖溶液。甲醇和乙腈均為質(zhì)譜純級別,均購自Fisher Scientific公司(美國)。色譜級甲酸與色譜級碳酸氫銨購自百靈威公司(中國);細(xì)胞培養(yǎng)級別二甲基亞砜(DMSO)和D5-L-苯丙氨酸與辛酰基(8,8,8-D3)-L-肉堿購自Sigma-Aldrich公司(美國);十一烷酸(FFA C11∶0)與十九烷酸(FFA C19∶0)購自阿拉丁公司(中國); 1-十二烷基溶血磷脂酰膽堿(LysoPC 12∶0)與磷脂酰乙醇胺(PE 17∶0/17∶0)購自AVANTI公司(美國)。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 細(xì)胞暴露實(shí)驗(yàn)

將L02細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),將細(xì)胞培養(yǎng)箱的溫度與二氧化碳體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為37 ℃與5%; L02細(xì)胞培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基。待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí),將L02細(xì)胞接種在六孔板中,細(xì)胞接種密度為5×105細(xì)胞/孔,并設(shè)置一個(gè)對照組與3個(gè)暴露組,每組設(shè)置6個(gè)平行。待細(xì)胞鋪滿六孔板面積的80%～90%,將細(xì)胞培養(yǎng)基棄去,向?qū)φ战M加入含有0.05%(v/v) DMSO的培養(yǎng)液;將SCCPs(C10～C13, 56.5%Cl)通過DMSO引入培養(yǎng)基中,向3個(gè)暴露組分別加入含1 μg/L(低劑量)、10 μg/L(中劑量)、100 μg/L(高劑量)SCCPs的培養(yǎng)基,使DMSO在培養(yǎng)液中的最終體積分?jǐn)?shù)為0.05%。3個(gè)暴露劑量均低于SCCPs在人體血液中的最高含量(584 ng/mL)[11]。

1.3 細(xì)胞代謝物提取

暴露24 h后,棄去六孔板中剩余細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔加入2 mL超純水快速洗滌細(xì)胞,洗滌3次后,加入液氮淬滅,使細(xì)胞的代謝活動(dòng)終止,并放置于-80 ℃冰箱中保存,待進(jìn)一步提取。

向六孔板的每孔中加入1 mL超純水,冰水浴中超聲3 min,使細(xì)胞破碎并從培養(yǎng)皿壁上脫落。隨后將細(xì)胞碎片懸液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中。將細(xì)胞破碎懸液冷凍干燥,然后加入0.5 mL 80%甲醇水溶液(其中含有6個(gè)內(nèi)標(biāo),分別為0.5 μg/L D5-L-苯丙氨酸、0.5 μg/L辛酰基(8,8,8-D3)-L-肉堿、0.5 μg/L FFA C11∶0、0.5 μg/L FFA C19∶0、0.5 μg/L LysoPC 12∶0與1 μg/L PE 17∶0),室溫渦旋20 min,離心(14 000 g, 4 ℃)20 min。最后,取上清液過有機(jī)相濾膜并轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣小瓶中保存,待進(jìn)行小分子代謝物分析。

1.4 代謝物檢測

采用擬靶向代謝組學(xué)方法對細(xì)胞內(nèi)小分子代謝物進(jìn)行檢測分析[22]。首先用Q-TOF 6540超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對細(xì)胞樣品進(jìn)行非靶向分析,分為正、負(fù)離子兩種掃描模式。通過高分辨Q-TOF-MS的AutoMS/MS功能對小分子代謝物實(shí)行全掃和二級質(zhì)譜掃描,獲得離子對信息。然后,采用Q-Trap 5500超高效液相色譜-四極桿線性離子阱質(zhì)譜對獲得的離子對進(jìn)行靶向(Schedule MRM)分析,色譜分離條件與非靶向分析完全一致。

色譜條件 正離子模式:色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C8(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters, USA);流動(dòng)相由0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)組成;梯度洗脫程序:0～1.0 min, 5%B; 1.0～23.0 min, 5%B～100%B; 23.0～27.0 min, 100%B; 27.0～27.1 min, 100%B～5%B; 27.1～30.0 min, 5%B。負(fù)離子模式:色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm, Waters, USA);流動(dòng)相由5 mmol/L NH4HCO3水溶液(A)與含5 mmol/L NH4HCO3的甲醇溶液(B)組成;梯度洗脫程序:0～1.0 min, 2%B; 1.0～3.0 min, 2%B～42%B; 3.0～12.0 min, 42%B～100%B; 12.0～16.0 min, 100%B; 16.0～17.0 min, 100%B～2%B; 17.0～20.0 min, 2%B。正、負(fù)離子模式下柱溫均為50 ℃,流速均為0.35 mL/min。

Q-TOF 6540質(zhì)譜參數(shù) 干燥氣溫度:350 ℃;干燥氣流速:9 L/min;霧化器(N2氣)壓力:310.275 kPa (45 psi);毛細(xì)管電壓:3500 V;碎裂電壓:175 V;錐孔電壓:65 V;MS采集范圍:m/z50～1000;MS/MS采集范圍:m/z30～1 000;MS采集速率:4 spectra/s;MS/MS毛細(xì)管電壓:2 spectra/s;碰撞能采用公式CE=5×m/z(母離子)/100+3計(jì)算;每個(gè)循環(huán)(0.25 s)允許分析的最大母離子個(gè)數(shù)設(shè)置為5,絕對閾值為5000 Count,相對閾值為1%。

Q-Trap質(zhì)譜條件的正、負(fù)離子模式參數(shù) 電噴霧離子源(ESI),溫度為550 ℃,噴霧電壓分別為5 500 V(正離子模式)與4 500 V(負(fù)離子模式),氣簾氣壓力為0.241 MPa,霧化氣(ion source gas 1, GS1)壓力為0.276 MPa,輔助氣(ion source gas 2, GS2)壓力為0.276 MPa。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

使用MultiQuant軟件(AB SCIEX)進(jìn)行數(shù)據(jù)批量處理,導(dǎo)出經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正過的峰面積數(shù)據(jù)(某個(gè)樣品中的原始峰面積除以該樣品中內(nèi)標(biāo)峰面積再乘以所有樣品內(nèi)標(biāo)峰面積的平均值),并進(jìn)行歸一化處理,用于后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析。MetaboAnalyst 5.0(http://www.metaboanalyst.ca/)網(wǎng)站用于單因素方差分析(ANOVA)、t-test以及主成分分析(PCA); RStudio(version 4.1.2)用于熱圖繪制;InCroMAP軟件(version 1.7.0)用于通路富集分析。

此外,本研究還根據(jù)文獻(xiàn)[23],進(jìn)行了代謝擾亂水平指數(shù)(MELI)計(jì)算,來反映污染物暴露對代謝的整體干擾。首先計(jì)算單個(gè)樣本中每個(gè)代謝物的代謝變化,然后將單個(gè)樣本中所有代謝物的代謝變化進(jìn)行求和,再除以樣本中代謝物的總個(gè)數(shù),從而得到該樣本的MELI值。

1.6 質(zhì)量控制與質(zhì)量保證

在所有暴露組與對照組的樣品中移取等量樣品混合作為質(zhì)控樣品(QC)。將QC插入分析序列,每分析6個(gè)樣品后分析一個(gè)質(zhì)控樣品。正、負(fù)離子模式下,各插入7個(gè)QC樣品。計(jì)算QC樣品中每個(gè)代謝物濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果表明,在正、負(fù)離子模式下,一共檢測到565個(gè)代謝物。其中,在正離子模式下檢測到355個(gè)代謝物,93.2%的代謝物RSD<30%; RSD<10%、10%30%。在負(fù)離子模式下檢測到210個(gè)代謝物,94.3%的代謝物RSD<30%。其中,RSD<10%、10%30%。該結(jié)果表明:代謝物靶標(biāo)分析序列具有滿意的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 代謝輪廓分析

采用擬靶向代謝組學(xué)分析方法研究SCCPs暴露對L02細(xì)胞中小分子代謝物的擾亂,共檢測到565個(gè)代謝物。為評估SCCPs引起的L02細(xì)胞中的代謝紊亂,對檢測到的所有代謝物進(jìn)行PCA分析(圖1a),建立了包含第一主成分和第二主成分的二維空間模型。在PCA因子得分圖中(圖1a), 3個(gè)暴露劑量組在第一主成分上均能夠與對照組明顯分開。對照組分布在第二象限,低劑量組(1 μg/L)和中劑量組(10 μg/L)主要分布在第一象限,高劑量組(100 μg/L)主要分布在第三象限。表明3個(gè)劑量組的SCCPs均能夠引起L02細(xì)胞代謝活動(dòng)的紊亂;同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn),1 μg/L的SCCPs暴露組與10 μg/L的SCCPs暴露組部分重疊,表明1 μg/L和10 μg/L的SCCPs對L02細(xì)胞的代謝擾亂存在相似之處。為比較3個(gè)劑量組的SCCPs暴露對L02細(xì)胞總代謝的干擾強(qiáng)度,我們還計(jì)算了MELI。如圖1b所示,3個(gè)暴露組的MELI值均顯著(P<0.05)高于對照組。結(jié)果表明,3個(gè)劑量的SCCPs暴露均能引起L02細(xì)胞代謝紊亂。

通過MetaboAnalyst 5.0對所有暴露組與對照組的565個(gè)代謝物進(jìn)行了ANOVA分析來篩選差異代謝物,篩選標(biāo)準(zhǔn)為False discovery rate (FDR)<0.05且Variable importance in the projection (VIP)值>1,共篩選出220個(gè)差異代謝物。其中,72個(gè)差異代謝物經(jīng)化合物二級質(zhì)譜圖信息定性或標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證。韋恩圖(圖1c)顯示,1 μg/L SCCPs暴露組與10 μg/L SCCPs暴露組和100 μg/L SCCPs暴露組分別有33個(gè)和36個(gè)相同的差異代謝物。10 μg/L SCCPs暴露組與100 μg/L SCCPs暴露組有46個(gè)相同的差異代謝物。3個(gè)暴露組有33個(gè)相同的差異代謝物。

圖 1 SCCPs暴露L02細(xì)胞24 h后引起的代謝擾動(dòng)Fig. 1 Effects of 24 h of exposure to short-chain chlorinated paraffins (SCCPs) on the metabolomic profiles of L02 cells a. Principal component analysis (PCA) score plot of metabolite levels in L02 cells; b. metabolic effect level index (MELI) values of different treatment groups; c. Venn diagram showing the number of shared differential metabolites (DMs) among groups. Significant differences (in comparison with the control) were determined using t-test (n=6). * P<0.05; ** P<0.01.

為了進(jìn)一步分析SCCPs暴露引起的細(xì)胞內(nèi)代謝變化,基于各自的代謝通路類別,對所有定性的差異代謝物進(jìn)行熱圖分析(圖2)。在72個(gè)經(jīng)二級質(zhì)譜圖信息定性或標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證的差異代謝物中,參與氨基酸代謝、核苷酸代謝和脂質(zhì)代謝通路的差異代謝物分別為9、9以及45個(gè)。如圖2所示,3個(gè)劑量的SCCPs暴露均引起參與氨基酸、核苷酸以及脂質(zhì)代謝通路的代謝物的紊亂。

2.2 代謝通路分析

為了準(zhǔn)確描述SCCPs暴露后L02細(xì)胞中代謝通路的改變,基于差異代謝物的倍率變化(FC)數(shù)據(jù)集對所有暴露組進(jìn)行通路富集分析。保留與代謝相關(guān)且P<0.01的代謝通路作為顯著影響的通路。-log10Q的數(shù)值代表SCCPs對代謝通路的干擾程度。如圖3所示,低、中、高劑量的SCCPs暴露干擾了相似的代謝通路,包括甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞油酸代謝、花生四烯酸代謝、不飽和脂肪酸合成通路、鞘脂類代謝以及嘌呤代謝通路。此外,隨著暴露劑量的增加,SCCPs擾亂的代謝通路也同步增加,中、高劑量的SCCPs暴露還干擾氧化磷酸化(OXPHOS)以及脂肪酸合成通路。中劑量的SCCPs暴露單獨(dú)干擾嘧啶代謝通路,高劑量的SCCPs暴露單獨(dú)干擾苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路?？傊?中、高劑量的SCCPs暴露引起了更廣泛的代謝通路紊亂。

圖 2 對照組和SCCPs暴露組中72個(gè)差異代謝物的熱圖Fig. 2 Heatmaps of 72 DMs in control and SCCP exposure groups False discovery rate (FDR)<0.05; variable importance in the projection (VIP)>1; P<0.05. FFAs: free fatty acids; PC: phosphatidylcholine; PE: phosphatidylethanolamine; SM: sphingomyelin; Lyso PC: lysophosphatidylcholine; Lyso PE: lysophosphatidylethanolamine; ADP: adenosine 5′-diphosphate; CDP: cytidine diphosphate; dAMP: deoxyadenosine monophosphate; dGDP: 2′-deoxyguanosine 5′-diphosphate; IMP: inosine monophosphate; NAD: nicotinamide adenine dinucleotide; UDP: uridine 5′-diphosphate; CoA: coenzyme A; MG: monoacylglyceride.

2.2.1脂質(zhì)代謝通路干擾

脂質(zhì)代謝是3個(gè)劑量SCCPs暴露組共同干擾的代謝通路,如圖3所示,低、中、高劑量的SCCPs暴露均干擾甘油磷脂代謝以及鞘脂類代謝通路。SCCPs暴露后,脂類豐度發(fā)生了明顯變化,包括磷脂酰膽(PCs)、磷脂酰乙醇胺(PEs)、溶血磷脂酰乙醇胺(lyso PEs)、溶血磷脂酰膽堿(lyso PCs)以及鞘磷脂(SMs)(圖4)。PCs、PEs和SMs是細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的主要結(jié)構(gòu)成分[24],其豐度的顯著變化表明SCCPs暴露對細(xì)胞膜有一定的損傷作用。已有研究表明:SCCPs可通過磷脂水平紊亂、結(jié)構(gòu)親脂性以及脂質(zhì)過氧化破壞生物膜[15]。磷脂是細(xì)胞膜的重要組成部分,SCCPs暴露后磷脂水平的紊亂將會對細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和膜結(jié)合蛋白質(zhì)的能力產(chǎn)生負(fù)面影響[25]。另外,磷脂的異常代謝還可以影響許多生物學(xué)過程,包括炎癥效應(yīng)[26]。

圖 3 通路富集分析顯示的SCCPs暴露后顯著干擾的代謝通路Fig. 3 Metabolic pathways significantly perturbed by SCCP exposures based on pathway enrichment analysis

圖 4 SCCPs誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝通路的紊亂Fig. 4 Perturbations of lipid metabolism induced by SCCPs Significant differences were determined using t-test (n=6). * P<0.05.

低、中、高劑量的SCCPs均干擾了L02細(xì)胞中脂肪酸代謝,尤其是脂肪酸β氧化(圖4)。如圖5所示,短鏈(C3)、中鏈(C6)?；鈮A的含量在中、高劑量的SCCPs暴露組中顯著降低。同時(shí),脂肪酸水平在3個(gè)劑量的SCCPs暴露組中均顯著下降。在脂肪酸β氧化過程中,脂肪酸首先被活化成脂酰CoA,而活化的脂酰CoA需進(jìn)入線粒體才能被氧化。游離肉堿作為載體將脂肪酸運(yùn)輸?shù)骄€粒體,并將其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的?；鈮A,進(jìn)而才能實(shí)現(xiàn)脂肪酸β氧化并產(chǎn)生能量[27]。因此,?；鈮A的減少提示脂肪酸β氧化過程被抑制。在本研究中,SCCPs暴露降低了短鏈和中鏈?；鈮A的含量,表明SCCPs暴露抑制了L02細(xì)胞中脂肪酸β氧化。值得注意的是,高劑量SCCPs對脂肪酸β氧化抑制作用更加明顯。相關(guān)研究表明SCCPs對脂肪酸β-氧化通路的干擾可能與PPARα受體有關(guān)。SCCPs可通過激活大鼠肝臟PPARα受體,調(diào)控PPARα下游編碼與脂肪酸代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)的靶基因的表達(dá)水平,進(jìn)而影響線粒體脂肪酸β-氧化[28]。然而,PPARα激活效應(yīng)存在物種差異,人PPARα的激活效應(yīng)與嚙齒類動(dòng)物比相對較弱[18,29]。需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討本研究中脂肪酸β氧化抑制作用與人PPARα的激活效應(yīng)之間的關(guān)系。

2.2.2核苷酸代謝通路干擾

如圖6所示,SCCPs暴露誘導(dǎo)了核苷酸代謝通路的紊亂。SCCPs暴露降低了L02細(xì)胞中二磷酸核酸(胞嘧啶核苷二磷酸(CDP)、尿苷二磷酸(UDP)、腺嘌呤核苷二磷酸(ADP)、脫氧鳥苷5′-二磷酸(dGDP))的含量。相反,SCCPs暴露誘導(dǎo)了單磷酸核苷(單磷酸肌苷(IMP)與脫氧腺苷單磷酸(dAMP))、鳥嘌呤(guanine)、胞嘧啶(cytosine)以及次黃嘌呤(hypoxanthine)的累積。核苷酸代謝失調(diào)會導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和進(jìn)一步的致癌作用[30]。據(jù)報(bào)道,次黃嘌呤水平的升高在許多器官系統(tǒng)中表現(xiàn)出有害的影響[31,32]。作為嘌呤降解通路中的反應(yīng)中間體,次黃嘌呤經(jīng)黃嘌呤氧化酶分解代謝成黃嘌呤和尿酸。在缺氧狀態(tài)下,腺嘌呤核苷酸降解為次黃嘌呤的速度加快,黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)化次黃嘌呤為黃嘌呤和尿酸的速度減慢。因此,次黃嘌呤升高已被證明是幾種疾病狀態(tài)下缺氧的標(biāo)志,比如圍產(chǎn)期窒息、急性呼吸窘迫綜合征、缺血性腦水腫[33,34]。另外,黃嘌呤氧化酶氧化次黃嘌呤也會產(chǎn)生活性氧(ROS)并引發(fā)細(xì)胞毒性。比如,次黃嘌呤已被證實(shí)通過ROS的產(chǎn)生上調(diào)膽固醇水平誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化[35]。次黃嘌呤還可以在慢性炎癥過程中通過腺嘌呤脫氨產(chǎn)生,能夠啟動(dòng)炎癥驅(qū)動(dòng)效應(yīng)并產(chǎn)生致癌作用[36]。在本研究中,低、中與高劑量的SCCPs暴露均導(dǎo)致了次黃嘌呤的累積,這與文獻(xiàn)報(bào)道SCCPs對細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷的結(jié)果一致[15]。

圖 5 SCCPs誘導(dǎo)的脂肪酸代謝通路的紊亂Fig. 5 Perturbations of fatty acid metabolism induced by SCCPs Significant differences were determined using t-test (n=6). * P<0.05.

圖 6 SCCPs暴露后核苷酸代謝通路相關(guān)代謝物的相對峰面積Fig. 6 Relative peak areas of metabolites participating in the nucleotide metabolism pathway perturbed by SCCPs Significant differences were determined using t-test (n=6). * 0.01

3 結(jié)論

本研究以代謝組學(xué)為手段探討了SCCPs暴露對人正常肝細(xì)胞L02的代謝干擾。研究表明:SCCPs對L02細(xì)胞的代謝干擾主要表現(xiàn)在脂質(zhì)代謝、脂肪酸β氧化以及核苷酸代謝通路上。SCCPs暴露可能對細(xì)胞膜產(chǎn)生明顯的損傷作用,抑制L02細(xì)胞中脂肪酸β氧化以及誘導(dǎo)L02細(xì)胞氧化損傷等相關(guān)不良效應(yīng)。另外,在本研究中,與中、低劑量SCCPs暴露相比,高劑量SCCPs暴露引起更廣泛的代謝通路的紊亂。同時(shí),高劑量SCCPs暴露對脂質(zhì)代謝、脂肪酸β氧化以及核苷酸代謝通路的干擾作用更強(qiáng)。然而,本研究僅僅在一個(gè)組學(xué)層面上來探索SCCPs對人體肝細(xì)胞的毒性機(jī)制顯然是不夠的,需要結(jié)合其他組學(xué)手段以及分子學(xué)技術(shù)手段深入探究其毒性作用機(jī)制,找到SCCPs對人體肝細(xì)胞的毒性作用靶點(diǎn)。