“黎平2號(hào)”油茶組培快繁技術(shù)

摘 要：以“黎平2號(hào)”良種油茶帶芽嫩莖作為外植體，分析在不同的消毒方式和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比下“黎平2號(hào)”油茶的誘芽、增殖、生根情況，構(gòu)建“黎平2號(hào)”油茶的組培快繁技術(shù)體系。此次實(shí)驗(yàn)中，最適合“黎平2號(hào)”油茶的消毒試劑組合為75%乙醇消毒30 s后再用0.1%氯化汞消毒10 min，這一消毒方式下的“黎平2號(hào)”外植體的存活率為63%，褐化率為3%，污染率為17%；最適合“黎平2號(hào)”油茶不定芽誘芽的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比為MS+1 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+0.06 mg/L TDZ，這一配比下的黎平2號(hào)外植體的出芽率達(dá)到98%，誘導(dǎo)率達(dá)到88%；最適合外植體增殖的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為MS+0.5 mg/L

6-BA+0.04 mg/L NAA+0.03 mg/L TDZ+0.2 mg/L IBA，增殖系數(shù)為9.2倍，玻璃化率為26%；最適合“黎平2號(hào)”外植體生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)劑組合為0.5MS+0.6 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，生根率達(dá)到86%，平均生根條數(shù)達(dá)到2.8條，平均根長(zhǎng)為2.7 cm。

關(guān)鍵詞：“黎平2號(hào)”油茶；組培快繁技術(shù)；外植體消毒

中圖分類(lèi)號(hào)：S794.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：2095–3305（2024）11–000-03

“黎平2號(hào)”良種油茶是由貴州省林業(yè)科學(xué)院黎平縣林業(yè)局共同選育的油茶品種，植株主要呈圓形灌木狀，樹(shù)葉呈橢圓狀，鮮果出油率達(dá)到10%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)國(guó)家規(guī)定的油茶果實(shí)出油指標(biāo)?！袄杵?號(hào)”良種油茶歸類(lèi)為山茶科山茶屬，屬于小喬木灌木類(lèi)。與栽培技術(shù)發(fā)展較為成熟、栽培面積更加廣泛的普通油茶相比，“黎平2號(hào)”良種油茶的果皮薄、產(chǎn)油量高、對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性更強(qiáng)，產(chǎn)量高并且產(chǎn)出穩(wěn)定，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生產(chǎn)利用價(jià)值。

組培快繁技術(shù)是一種通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)和再生植株來(lái)大規(guī)模繁殖植物的方法，其能通過(guò)體外環(huán)境控制和植物生長(zhǎng)調(diào)控，得到質(zhì)量更高的經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物，降低作物培育難度，提高作物生產(chǎn)效率。當(dāng)前，組培快繁技術(shù)在水果培育、蘭草花類(lèi)作物培植、藥用植物配置等方面的應(yīng)用廣泛，對(duì)植物的栽培和繁育具有重要作用[1]。現(xiàn)階段“黎平2號(hào)”的主要繁殖方式包括種子繁殖、扦插繁殖、嫁接繁殖、壓條繁殖、埋根繁殖等，但種子繁殖并不能保留植物的親本優(yōu)良性，其他繁殖方式則極大受氣候、溫度等外部環(huán)境的影響，植物的繁殖效率不高，嚴(yán)重影響“黎平2號(hào)”油茶種植規(guī)模的擴(kuò)大[2]。對(duì)此，通過(guò)對(duì)外植體消毒、組培育苗培養(yǎng)等相關(guān)研究和分析，旨在建立有效的“黎平2號(hào)”良種油茶組培繁育技術(shù)，為“黎平2號(hào)”良種油茶的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；N植提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料選取的是黎平縣洪州鎮(zhèn)的“黎平2號(hào)”良種油茶所引種栽培的品種“黎平2號(hào)”，于當(dāng)年3月下旬至4月中旬選取新萌發(fā)油茶樹(shù)中生長(zhǎng)健康、未見(jiàn)病蟲(chóng)害的帶芽莖段，密封保鮮帶回實(shí)驗(yàn)室[3]。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒

第一步，選取長(zhǎng)勢(shì)良好的良種“黎平2號(hào)”油茶嫩莖，將莖上枝條去葉后用清水清洗，使用軟刷輕輕清理枝條，清理后用純凈水再次清洗；第二步，在超凈工作臺(tái)上將枝條剪切為2.5 cm的小段，用3種方式進(jìn)行消毒實(shí)驗(yàn)，具體消毒方式見(jiàn)表1。在消毒過(guò)程中為了充分利用消毒液，可以不斷搖晃消毒容器；第三步，在完成滅菌后利用鑷子將外植體轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，用濾紙吸收多余水分，再用純凈水沖洗4次，順著切口再切除約0.3 cm的枝段，保留剩下2.2 cm的枝段備用；第四步，將備用外植體接種至MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理50瓶，每瓶接種2個(gè)外植體，在培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，以5 d為一周期，調(diào)查存活率、褐化率、污染率，共調(diào)查20 d。

1.2.2 不定芽誘導(dǎo)

以MS作為培養(yǎng)基，將枝段消毒后接種到不同濃度培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加的植物生長(zhǎng)劑主要由萘乙酸（NAA）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、人工合成的苯基脲衍生物（TDZ）組成。

研究不同的植物生長(zhǎng)劑添加方式對(duì)“黎平2號(hào)”不定芽誘導(dǎo)的影響，添加方案分別為：（1）MS+0.8 mg/L

6-BA+0.2 mg/L NAA+0.04 mg/L TDZ；（2）MS+1 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+0.06 mg/L TDZ；（3）MS+1.2 mg/L

6-BA+0.6 mg/L NAA+0.08 mg/L TDZ，分別記作B1、B2、B3。每個(gè)培養(yǎng)基處理50瓶，每瓶接種2個(gè)外植體，在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，跟蹤觀察出芽率和誘導(dǎo)率[4-9]。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)

從MS培養(yǎng)基中取出培養(yǎng)效果較好且長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)?shù)难棵?，將其轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖培養(yǎng)。增值培養(yǎng)基的主要成分包括：NAA、6-BA、TDZ、

6-吲哚丁酸IBAIBA，添加方案分別為：（1）MS+0 mg/L

6-BA+0.02 mg/L NAA+0.01 mg/L TDZ+0 mg/L IBA；（2）MS+0.5 mg/L 6-BA+0.04 mg/L NAA+0.03 mg/L TDZ+0.2 mg/L IBA；（3）MS+1 mg/L 6-BA+0.06 mg/L NAA+0.05 mg/L TDZ+0.4 mg/L IBA，將其記作C1、C2、C3。每個(gè)培養(yǎng)基處理50瓶，每瓶接種2個(gè)外植體，在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，跟蹤觀察培養(yǎng)情況并記錄外植體在20 d內(nèi)的增殖系數(shù)和玻璃化率。

1.2.4 生根培養(yǎng)

將繼代增殖培養(yǎng)后所獲得的單芽剪下2.5 cm，并將剪下的單芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中繼續(xù)誘導(dǎo)生根。誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基主要由不同濃度的NAA和IBA組成，

具體的添加方案為：（1）0.5MS+0.4 mg/L NAA+0.3 mg/L

IBA；（2）0.5MS+0.6 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA；（3）0.5MS+0.8 mg/L NAA+0.7 mg/L IBA，記作D1、D2、D3。共處理50瓶，每瓶1個(gè)嫩梢，跟蹤嫩梢的生長(zhǎng)情況，并詳細(xì)統(tǒng)計(jì)其生長(zhǎng)情況，計(jì)算培育過(guò)程中植物體的生根率、平均生根條數(shù)、平均根長(zhǎng)。

生根率=不定根發(fā)生的莖段數(shù)/接種莖段數(shù)×100%

平均生根條數(shù)=生根條數(shù)/接種莖段

平均根長(zhǎng)=總根長(zhǎng)/接種莖段

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方式

用Excel表格統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 23.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 最佳消毒方式分析

研究不同消毒方式下“黎平2號(hào)”外植體的消毒效果，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2中，A1組、A2組、A3組不同消毒方式下存活率、褐化率、污染率均不同，這說(shuō)明了“黎平2號(hào)”外植體消毒效果的差異性較為顯著。當(dāng)直接用0.1%氯化汞消毒10 min時(shí)，外植體的污染率、褐化率明顯高于另外兩種消毒方式，存活率也僅為28%；利用乙醇和氯化汞兩種消毒方式進(jìn)行組合消毒時(shí)，外植體的存活率和污染率指標(biāo)得到明顯好轉(zhuǎn)，但植物的褐化率較高。利用75%乙醇消毒30 s后，再用0.1%氯化汞消毒

10 min時(shí)，這一消毒方式對(duì)“黎平2號(hào)”外植體的褐化率影響最小，存活率最高。隨著乙醇消毒時(shí)間延長(zhǎng)，“黎平2號(hào)”外植體的褐化率上升，存活率下降。

綜合對(duì)比后可以確定，此次實(shí)驗(yàn)最佳的消毒方式為用75%乙醇消毒30 s后，再用0.1%氯化汞消毒10 min，

這一消毒方式下，“黎平2號(hào)”外植體的存活率可以達(dá)到63%，褐化率僅為3%。

2.2 “黎平2號(hào)”的腋芽植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑選擇

通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑下，“黎平2號(hào)”的外植體腋芽生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。

表3中，不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比對(duì)“黎平2號(hào)”腋芽生長(zhǎng)的影響具有顯著的差異性。其中，處理方式B1和B2的出芽率均能達(dá)到90%以上，誘導(dǎo)率也能達(dá)到85%以上，說(shuō)明MS+6-BA+NAA+TDZ的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合能有效促進(jìn)植物分化和出芽成長(zhǎng)，但隨著植物生長(zhǎng)劑中各個(gè)生長(zhǎng)激素的持續(xù)添加，“黎平2號(hào)”外植體的誘導(dǎo)率和出芽率都有所下降。這說(shuō)明過(guò)多的植物生長(zhǎng)劑激素也會(huì)對(duì)外植體的誘導(dǎo)和出芽起到反作用。

當(dāng)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比為MS+1 mg/L 6-BA+

0.4 mg/L NAA+0.06 mg/L TDZ時(shí)，“黎平2號(hào)”外植體的出芽率達(dá)到98%，誘導(dǎo)率達(dá)到88%，并且腋芽長(zhǎng)勢(shì)較好。這說(shuō)明“黎平2號(hào)”的腋芽植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑最優(yōu)配比為MS+1 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+0.06 mg/L TDZ。

2.3 “黎平2號(hào)”的增殖植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑選擇

通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑下，“黎平2號(hào)”的外植體增殖情況見(jiàn)表4。

表4中，在使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑后，“黎平2號(hào)”的植物增殖系數(shù)最高可以達(dá)到9.3倍，當(dāng)僅使用NAA和TDZ作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)，植物的增殖系數(shù)較低，但添加了6-BA和IBA后，植物的增殖系數(shù)達(dá)到9倍以上；對(duì)比C2和C3可知，C3組合的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑下，“黎平2號(hào)”外植體的增殖系數(shù)稍高，但相應(yīng)的玻璃化率也較高，甚至超出控制范圍，而C2組合的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合下的“黎平2號(hào)”外植體增殖情況與C3差異并不明顯，但玻璃化率明顯偏低。

這說(shuō)明此次實(shí)驗(yàn)中，最適合外植體增殖的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.04 mg/L NAA+0.03 mg/L TDZ+0.2 mg/L IBA，增殖系數(shù)為9.2倍，玻璃化率為26%。

2.4 “黎平2號(hào)”的生根植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑選擇

通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑下，“黎平2號(hào)”的外植體生根情況見(jiàn)表5。

表5中，在使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑后，“黎平2號(hào)”的植物生根率最高可以達(dá)到86%，最低為64%，平均生根條數(shù)最高可以達(dá)到2.8條，最低可以達(dá)到2.2條，平均根長(zhǎng)最高為3.1 cm，最低為2.4 cm。這說(shuō)明使用MS+NAA+

IBA作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑具有良好的使用效果。

對(duì)比D1和D2，發(fā)現(xiàn)兩者的生根率差異性并不顯著，但D2的平均生根條數(shù)和平均根長(zhǎng)較D1組數(shù)據(jù)更好，說(shuō)明D2組的外植體長(zhǎng)勢(shì)更加健康；對(duì)比D2和D3，發(fā)現(xiàn)D3的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比下，外植體的平均根長(zhǎng)較高，說(shuō)明D3方案更有利于植物生長(zhǎng)，但該方案下外植體的生根率和平均生根條數(shù)遠(yuǎn)低于D2方案，說(shuō)明盡管D3方案下植物能快速生長(zhǎng)，但這一配比方案并不利于植物的生根和發(fā)育，因此D2方案相對(duì)更具明顯的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

綜上，最適合“黎平2號(hào)”外植體生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)劑組合為0.5 MS+0.6 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，生根率達(dá)到86%，平均生根條數(shù)達(dá)到2.8條，平均根長(zhǎng)為2.7 cm。

3 結(jié)論

（1）此次實(shí)驗(yàn)主要采用氯化汞與乙醇作為實(shí)驗(yàn)消毒藥劑，分別分析乙醇和氯化汞消毒在規(guī)定時(shí)間下的消毒效果。最適合“黎平2號(hào)”油茶的消毒試劑組合為用75%乙醇消毒30 s后，再用0.1%氯化汞消毒

10 min，這一消毒方式下外植體的存活率為63%，褐化率為3%，污染率為17%，消毒效果良好。同時(shí)，在此次實(shí)驗(yàn)中，為了保證試劑的利用充分性，在實(shí)驗(yàn)中不斷搖晃容器，有效降低了外植體的污染率。

（2）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)外植體腋芽誘導(dǎo)、增殖及生長(zhǎng)具有良好的應(yīng)用效果。此次實(shí)驗(yàn)選取的植物生長(zhǎng)激素主要有6-BA、NAA、TDZ、IBA等，其中，6-BA能加速植物細(xì)胞的分裂及擴(kuò)大，誘導(dǎo)腋芽生長(zhǎng)分化；NAA主要用于提高植株生長(zhǎng)高度；TDZ主要用于促進(jìn)植物細(xì)胞伸長(zhǎng)，誘導(dǎo)腋芽?jī)?nèi)的增殖，是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)組織細(xì)胞促使植物平穩(wěn)生長(zhǎng)[10-14]；IBA主要用于提高植物的發(fā)芽率和成活率，誘導(dǎo)形成外植體的不定芽、愈傷組織及胚狀體等。

（3）此次實(shí)驗(yàn)中，最適合“黎平2號(hào)”油茶的消毒試劑組合為用75%乙醇消毒30 s后，再用0.1%氯化汞消毒10 min；不定芽誘芽的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比為MS+1 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+0.06 mg/L TDZ；外植體增殖的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為MS+0.5 mg/L 6-BA+

0.04 mg/L NAA+0.03 mg/L TDZ+0.2 mg/L IBA；外植體生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)劑組合為0.5 MS+0.6 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA。

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