四烯甲萘醌（MK-4）對CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型的保護(hù)作用分析

葉 露，趙 凡，黃倩倩，張佳怡，王建青，

1 安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032

2 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，合肥 230012

3 安徽省公共衛(wèi)生臨床中心，合肥 230012

急性肝損傷（acute liver injury，ALI）是由病毒感染、乙醇、毒物等原因引起的肝臟合成、代謝和排泄功能受損，嚴(yán)重時可進(jìn)展為急性肝衰竭［1］。四氯化碳（CCl4）是典型的肝毒性化合物，廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)ALI的模型研究［2］。

鐵死亡作為一種區(qū)別于其他細(xì)胞死亡形態(tài)和生化特征的新型細(xì)胞死亡形式［3］，其發(fā)生機(jī)制主要與鐵代謝紊亂、氧化系統(tǒng)功能受損和脂質(zhì)過氧化物聚集有關(guān)［4］。Lin 等［5］發(fā)現(xiàn)，CCl4誘發(fā)小鼠ALI 時會促進(jìn)肝臟鐵死亡，且早在“鐵死亡”一詞之前，就已有報道維生素K 具有抗氧化作用［6-7］，因此Mishima 等［8］通過用維生素K 處理不同種類的谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）缺失腫瘤細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，維生素K 都可阻止這些細(xì)胞死亡，提示維生素K 是一種有效的鐵死亡抑制劑，且四烯甲萘醌（menaquinone-4，MK-4）效果最佳，但MK-4是否可應(yīng)用于ALI中還未可知。因此，該研究探索MK-4保護(hù)CCl4誘導(dǎo)的ALI小鼠模型的機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療ALI提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用48 只普通雄性ICR 小鼠，8 周齡，體質(zhì)量為36～42 g，購買于北京維通利華研究動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（京）2019-0010，實驗動物使用許可證編號：SYXK（皖）2020-001。小鼠飼養(yǎng)在適宜的環(huán)境中，溫度保持在（25±1）℃，濕度保持在（55±5）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實驗操作。

1.1.2 主要試劑 MK-4 購自美國MCE 公司；CCl4購自天津歐博凱化工有限公司；玉米油購自上海阿拉丁生化有限公司；AST、ALT檢測試劑盒購自浙江伊利康生物技術(shù)有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒和谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；組織鐵測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）相關(guān)試劑購自上海元升生物科技有限公司；研究中引物均由研究室設(shè)計并交給江蘇睿捷生物有限公司合成，GPX4 抗體購于英國abcam公司。

1.1.3 主要儀器 純水儀（型號：Merck MILLIPORE QUOTATION）購于美國默克公司；多功能酶標(biāo)儀（型號：SENERGY2）購于美國伯騰儀器公司；擴(kuò)增儀（型號：ABI MiniAmp 熱循環(huán)儀）購于美國賽默飛公司；熒光定量PCR 儀（型號：ABI7500）購于美國賽默飛公司；全自動生化分析儀（型號：CS-T300）購于長春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司；高速冷凍離心機(jī)（型號：1424）購于珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，顯影儀（型號：5200-multi）購于上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 小鼠按照體質(zhì)量S 形分組分為Control組、MK-4組、CCl4模型組（6、12、24 h）、MK-4+CCl4組（6、12、24 h），使每組小鼠體質(zhì)量平均值基本一致，每組6只。Control組腹腔注射同等劑量玉米油；MK-4組腹腔注射40 mg/kg 的MK-4 溶液，1 h 后腹腔注射同等劑量玉米油；MK-4+CCl4組（6、12、24 h）先腹腔注射40 mg/kg的MK-4溶液，1 h后和CCl4模型組（6、12、24 h）同時腹腔注射0.3 mL/kg CCl4溶液，分別在6、12、24 h進(jìn)行取材。

1.2.2 血清生化檢測 使用生化分析儀檢測血清中ALT、AST含量。

1.2.3 肝臟MDA 含量測定 精密稱取30 mg 小鼠肝臟組織，放入細(xì)胞裂解液（占組織質(zhì)量10%）進(jìn)行勻漿或裂解。勻漿或裂解后，10 000～12 000×g離心10 min，取上清備用。提前配置好后續(xù)研究所需試劑，按照試劑盒中提供的說明書進(jìn)行相關(guān)操作，使用酶標(biāo)儀在532 nm測定吸光度，計算出樣品溶液中的MDA 含量后，通過組織質(zhì)量來表示最初樣品中的MDA含量。

1.2.4 肝臟GSH 含量測定 精密稱取30 mg 小鼠肝臟組織，加入300 μL 的蛋白去除M 液（用于去除樣品中的其他蛋白）充分勻漿后，4 ℃放置10 min 后，10 000×g、4 ℃離心10 min，取上清備用。提前配置好后續(xù)研究所需試劑，按照試劑盒中提供的說明書進(jìn)行相關(guān)操作，使用酶標(biāo)儀在412 nm 處測定吸光度，計算出樣品溶液中GSH 含量后，通過組織質(zhì)量來表示最初樣品中的GSH含量。

1.2.5 組織病理學(xué)檢測 取小鼠新鮮肝大葉置于4%多聚甲醛溶液中，室溫放置搖床固定24 h。進(jìn)行脫水、包埋、切片、固定和蘇木精-伊紅（HE）染色后顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 組織鐵測定 稱取待測小鼠肝臟30 mg，加入270 μL的生理鹽水，冰水浴條件機(jī)械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液待測。按照說明書加入相關(guān)試劑混勻后，沸水浴5 min，流水冷卻，3 500 r/min，離心10 min，取上清液200 μL，0.5 cm光徑，波長520 nm，測定各管吸光度光密度值。利用說明書中提供的方法進(jìn)行計算。

1.2.7 普魯士染色 取小鼠新鮮肝大葉置于4%多聚甲醛溶液中，室溫放置搖床固定24 h。常規(guī)脫水包埋、切片、脫蠟至水、Perls 染色15～30 min，脫水、透明、封固后于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8 Western Blot蛋白表達(dá)檢測 稱取50 mg左右的小鼠肝組織，加入500 μL裂解液低溫勻漿后靜置30 min，離心獲取總蛋白，采用酶標(biāo)儀對蛋白濃度定量。總蛋白經(jīng)電泳分離再轉(zhuǎn)至PCDF 膜上，采用5%脫脂牛奶封閉1 h，室溫孵育一抗1 h（GPX4一抗?jié)舛?∶2 000；GAPDH 一抗?jié)舛?∶5 000），室溫孵育對應(yīng)二抗1 h（GPX4對應(yīng)二抗?jié)舛?∶50 000；GAPDH 對應(yīng)二抗?jié)舛?∶10 000）。配制顯影液在顯影儀上顯影，Image Pro 軟件分析蛋白條帶，計算蛋白表達(dá)量。

1.2.9 RT-PCR 檢測相關(guān)基因 采用TRlzol 法提取肝臟RNA，使用酶標(biāo)儀將所提取的RNA 樣品濃度定量到1 000 ng/μL，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行擴(kuò)增操作。選取18S核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S）為內(nèi)參基因，計算長鏈脂酰輔酶A 合成酶4（long-chain acyl-CoA synthetase，ACSL4）、前列腺素內(nèi)過氧化物酶2（prostaglandinendoperoxide synthase，PTGS2）、GPX4、鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白（hemojuvelin，HJV）、膜轉(zhuǎn)鐵蛋白（ferroportin，F(xiàn)PN）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor protein 1，TFR1）和18S 基因的相對表達(dá)水平。引物序列如表1所示。

表1 基因的引物序列Table 1 The primer sequence of the gene

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MK-4 提前干預(yù)對CCl4誘導(dǎo)的ALI 小鼠肝質(zhì)量系數(shù)的影響 與Control組比，MK-4組小鼠的肝質(zhì)量系數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，CCl4（12、24 h）組肝質(zhì)量系數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）；與CCl4（12 h）組相比，MK-4+CCl4（12 h）組的肝質(zhì)量系數(shù)下降（P＜0.05）（表2）。

表2 各組小鼠肝質(zhì)量系數(shù)比較Table 2 Liver weight coefficient of mice in each group

2.2 MK-4提前干預(yù)對CCl4誘導(dǎo)的ALI小鼠肝細(xì)胞壞死情況的影響 與Control 組相比，MK-4 組對小鼠肝臟無明顯損傷作用，且CCl4（6、12、24 h）組隨著CCl4注射時間的延長，小鼠肝組織的炎癥浸潤區(qū)域和壞死面積也隨之增加；與CCl4（12 h）組相比，MK-4+CCl4（12 h）組對小鼠肝臟組織中的炎癥浸潤和組織壞死有一定的改善作用（圖1）。

圖1 各組小鼠肝臟組織病理變化HEFigure 1 Pathological changes of liver tissue in each group

2.3 MK-4 提前干預(yù)對CCl4誘導(dǎo)的ALI 小鼠肝功能的影響 與Control 組相比，MK-4 組對小鼠的肝功能基本無影響，CCl4（6、12、24 h）組的血清ALT、AST水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.01）；與CCl4（12 h）組相比，MK-4+CCl4（12 h）組的血清ALT、AST 水平下降（P值均＜0.05）（表3）。

表3 各組小鼠血清中 ALT、AST 水平Table 3 Serum ALT and AST levels of mice in each group

2.4 MK-4提前干預(yù)對CCl4誘導(dǎo)的ALI小鼠肝臟中MDA和GSH 水平的影響 ALT、AST、肝質(zhì)量系數(shù)和HE 染色結(jié)果均顯示出在12 h 時MK-4 預(yù)處理可以明顯減輕CCl4誘導(dǎo)的ALI，因此后續(xù)研究采用12 h的MK-4預(yù)處理小鼠肝組織進(jìn)行檢測。如圖2 所示，與Control 組相比，MK-4組并不影響肝臟MDA 水平，但CCl4組卻有顯著增加（P＜0.01）；與CCl4組相比，MK-4+CCl4組肝臟MDA 水平顯著下降（P＜0.01）；此外，肝臟GSH 水平在采用CCl4進(jìn)行處理后明顯下降（P＜0.01）；與CCl4組相比，MK-4+CCl4組肝臟GSH水平顯著上升（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠肝臟組織MDA及GSH水平Figure 2 MDA and GSH levels in liver tissue of mice in each group

2.5 MK-4提前干預(yù)可降低CCl4誘導(dǎo)的ALI小鼠鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá) 與Control 組相比，CCl4刺激后，小鼠肝臟組織中鐵死亡標(biāo)志基因ASCL4、PTGS2 的mRNA 水平上升，GPX4的mRNA 水平下降（P值均＜0.05）；與CCl4組相比，MK-4+CCl4組鐵死亡標(biāo)志基因ASCL4、PTGS2 的mRNA 水平顯著下降，GPX4的mRNA 表達(dá)上升（P值均＜0.05）（圖3）；CCl4組較Control組，GPX4蛋白表達(dá)量下降（P＜0.01），但MK-4+CCl4組較模型組，GPX4 蛋白表達(dá)量上升（P＜0.05）（圖4）。

圖3 各組小鼠肝臟組織鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)Figure 3 Expression of genes related to ferroptosis in liver tissue of mice in each group

圖4 Western Blot檢測各組小鼠肝臟組織中GPX4蛋白水平Figure 4 The levels of GPX4 protein in liver tissues of mice in each group were detected by Western Blot

2.6 MK-4組預(yù)處理可改善CCl4誘導(dǎo)的ALI小鼠鐵代謝紊亂 與Control組相比，CCl4刺激后，小鼠肝臟中鐵聚集顆粒明顯增多，給予MK-4干預(yù)后，與CCl4組相比，鐵聚集下降（圖5）。與Control 組相比，CCl4刺激后，小鼠肝臟中鐵濃度顯著升高（P＜0.01），給予MK-4 干預(yù)后，與CCl4組相比，鐵濃度下降（P＜0.05）；此外，與Control組相比，CCl4組小鼠肝組織中鐵代謝標(biāo)志基因FPN、HJV 的mRNA 水平均下降（P值均＜0.05），TFR1 的mRNA 水平上升（P＜0.05）；給予MK-4 預(yù)處理后，與CCl4組相比，鐵代謝標(biāo)志基因FPN、HJV的mRNA水平均顯著上升，TFR1的mRNA水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）（圖6）。

圖5 各組小鼠肝臟組織鐵聚集變化（普魯士藍(lán)染色，×40）Figure 5 Iron accumulation in liver tissue of mice in each group Prussian dyeing（×40）

圖6 各組小鼠肝臟組織鐵含量以及鐵代謝相關(guān)基因的表達(dá)Figure 6 Iron content and iron metabolism related gene expression in liver tissue of mice in each group

3 討論

鐵死亡作為一種新發(fā)現(xiàn)的非凋亡性細(xì)胞死亡形式，其特征為脂質(zhì)過氧化物的過度積累，導(dǎo)致組織的損傷［9-10］?，F(xiàn)有研究表明，CCl4誘導(dǎo)的ALI 中存在鐵死亡的發(fā)生［5］，而ALI作為肝病最突出的病因之一，與高發(fā)病率和死亡率有著密不可分的關(guān)系［11］，因此尋找有效抑制ALI中鐵死亡發(fā)生的藥物有著重要的意義。

本研究為了確定MK-4 對CCl4誘導(dǎo)的ALI 是否有保護(hù)作用，分別在6、12、24 h 采用CCl4誘導(dǎo)ALI 的前1 h，使用MK-4 進(jìn)行保護(hù)，觀察在各自時間點(diǎn)內(nèi)，MK-4 保護(hù)組和單純CCl4組相比，其ALT、AST、肝質(zhì)量系數(shù)和HE染色結(jié)果均顯示出在12 h，而非24 h，MK-4 干預(yù)后明顯減輕CCl4誘導(dǎo)的ALI。有文獻(xiàn)［12］表明，MK-4在給藥后在血漿中存在時間不超過24 h，MK-4+CCl4組（24 h）的MK-4 可能在體內(nèi)已代謝完全，保護(hù)失效。此外，CCl4給藥24 h后，與Control 組相比ALT、AST 水平上升近600 倍，肝損傷過于嚴(yán)重，這可能也是導(dǎo)致MK-4 對急性ALI 24 h 保護(hù)作用不明顯的另一重要原因。

已有研究［13-16］表明，ACSL4、PTGS2 和GPX4 可作為鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵標(biāo)志物，ACSL4 和PTGS2 可促進(jìn)脂質(zhì)過氧化物的積累，而GPX4 可將有毒的脂質(zhì)過氧化物轉(zhuǎn)化成無毒的脂質(zhì)醇，其中GPX4 作為抗氧化系統(tǒng)中的最關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，是驗證鐵死亡發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)。在使用12 h 的小鼠各組織樣本進(jìn)行RT-PCR 檢測時，CCl4組的ACSL4、PTGS2 的mRNA 表達(dá)上調(diào)，GPX4 的mRNA 表達(dá)下調(diào)，而使用MK-4 進(jìn)行保護(hù)后，ACSL4、PTGS2 和GPX4三者的表達(dá)水平與CCl4組相比結(jié)果均相反，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，Western Blot 檢測GPX4蛋白時，CCl4組的GPX4 蛋白表達(dá)水平明顯下降，而CCl4+MK-4 組GPX4蛋白表達(dá)水平比CCl4組顯著上升。此外，MDA作為脂質(zhì)過氧化的常用指標(biāo)［17］，其在CCl4組有明顯升高，而經(jīng)MK-4干預(yù)后呈下降趨勢，GSH作為抗氧化系統(tǒng)中的核心成員［18］，其結(jié)果與MDA相反。這些結(jié)果都表明ALI中確實存在鐵死亡的發(fā)生，MK-4 預(yù)處理后ASCL4、PTGS2 的mRNA 水平下降和GPX4 的mRNA 水平上升以及GPX4蛋白水平的變化都提示MK-4 有抑制脂質(zhì)過氧化的作用，而MDA 水平的下降和GSH 水平的上升再一次驗證MK-4 可通過抑制脂質(zhì)過氧化物的積累來抑制鐵死亡的發(fā)生，從而對CCl4誘導(dǎo)的ALI產(chǎn)生一定的保護(hù)效果。

肝臟鐵代謝紊亂會導(dǎo)致鐵過載，從而加劇鐵死亡的發(fā)生［13］。有研究［14］表明，F(xiàn)PN 負(fù)責(zé)將鐵從鐵儲存細(xì)胞運(yùn)輸至血液中，以優(yōu)化全身鐵穩(wěn)態(tài)，TFR1 則是將鐵從細(xì)胞外環(huán)境導(dǎo)入細(xì)胞，HJV 作為鐵調(diào)素的上游分子，與其共同維持細(xì)胞內(nèi)的鐵含量來防止鐵代謝紊亂。三者都與鐵死亡存在著密不可分的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，小鼠在給予CCl4刺激后，F(xiàn)PN 和HJV 的mRNA 水平均不同程度地下降，TFR1 的mRNA 水平上升，MK-4 進(jìn)行保護(hù)后，F(xiàn)PN 和HJV 的mRNA 水平均上升，TFR1 的mRNA 水平下降。同時，在給予MK-4 保護(hù)CCl4誘導(dǎo)ALI 的小鼠肝臟中，鐵含量也明顯下降。這些結(jié)果再次提示，MK-4不僅通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)來抑制鐵死亡的發(fā)生，同時也可改善肝臟中鐵代謝紊亂來保護(hù)CCl4誘導(dǎo)的ALI。

綜上所述，本研究得出結(jié)論，CCl4誘導(dǎo)的ALI中發(fā)生鐵死亡事件，而MK-4 可通過降低脂質(zhì)過氧化物，抑制鐵死亡以及調(diào)節(jié)鐵代謝來改善CCl4誘導(dǎo)的ALI，使得MK-4及其類似物在未來可能用于預(yù)防和治療ALI。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2022 年5 月23 日經(jīng)由安徽醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審批，批號：202200523，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：葉露、趙凡、張佳怡負(fù)責(zé)實驗；葉露負(fù)責(zé)查閱文章，撰寫論文；黃倩倩、王建青負(fù)責(zé)修改文章并最后定稿。