骨髓巨噬細(xì)胞M2亞型共培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝硬化大鼠模型的效果分析

鄭欣瑞，許燕楠，王丹陽，邢飛飛，宗夢(mèng)瑤，張士豪，戰(zhàn)俊邑，劉 偉，陳高峰，陳佳美，劉 平，慕永平

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海市中醫(yī)藥研究院肝病研究所，肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203

肝移植是國(guó)際公認(rèn)的終末期肝硬化的最佳治療手段［1］，但受制于供體缺乏、費(fèi)用昂貴以及移植相關(guān)并發(fā)癥等限制，使部分患者在等待供肝期間死亡［2-4］。近年來，干細(xì)胞移植成為肝硬化治療研究的新熱點(diǎn)，尤其自體骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC）具有易獲取、無排異反應(yīng)及倫理問題等優(yōu)勢(shì)，已在乙型肝炎肝硬化、酒精性肝硬化等治療中初顯成效［5-8］，但也有研究［9］發(fā)現(xiàn)BMSC 移植后具有向肌成纖維細(xì)胞分化的潛能。因此，如何提高BMSC 治療終末期肝硬化的效果顯得尤為重要。課題組前期研究［10］表明，骨髓來源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）M2 亞型（M2-BMDM）可有效抑制四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)大鼠肝纖維化進(jìn)展，BMSC 移植可有效抑制膽汁性肝纖維化進(jìn)展［11］。但來源于M2-BMDM生長(zhǎng)微環(huán)境的BMSC（命名為BMSCM2）移植是否能夠進(jìn)一步提高其對(duì)肝硬化的治療效應(yīng)尚不清楚。本研究觀察了BMSCM2移植對(duì)CCl4/2-乙酰氨基芴（CCl4/2-acetylaminofluorene，CCl4/2-AAF）誘導(dǎo)大鼠肝硬化進(jìn)展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠肌成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。DMEM/F12（Dulbecco’s Modified Eagle Media：Nutrient Mixture F-12）細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于GIBICO 公司。BMSC 成脂誘導(dǎo)試劑盒（RAXMX-90031）、BMSC 成骨誘導(dǎo)試劑盒（RAXMX-90021）購(gòu)于Cyagen公司，BMSC細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（C543）購(gòu)于DOJINDO公司。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體（α-smooth muscle actin，α-SMA，ab124964）、CD68 抗體（ab125212）、肝細(xì)胞核因子4α 抗體（hepatocyte nuclear factor 4 alpha，HNF-4α，ab41898）、Sox9（sex determining region Y-box 9）抗體（ab185230）、上皮細(xì)胞黏附分子抗體（epithelial cell adhesion molecule，EpCam，ab71916）均購(gòu)于Abcam 公司；3-磷酸甘油醛脫氫酶抗體（GAPDH，60004-1-Ig）、細(xì)胞角蛋白7 抗體（cytokeratin7，CK7：15539-1-AP）、CK19 抗 體（10712-1-AP）均購(gòu)于Proteintech 公司；白蛋白抗體（Alb，sc271605）購(gòu)于Stan cruz Biotechnology 公司。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）引物序列由Takara 公司設(shè)計(jì)合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takara 公司，Synergy Brands（SYBR）熒光染料購(gòu)自TOYOBO 公司。肝組織羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 大鼠BMDM分離、極化及鑒定 參照課題組已經(jīng)建立的方法［10］。分離得到的BMDM 使用DMEM/F12+20%L929+10% FBS培養(yǎng)7 d后，即可獲得成熟的M2-BMDM。

1.3 大鼠BMSC 的分離與鑒定 參照課題組已經(jīng)建立的方法［11］分離大鼠BMSC，誘導(dǎo)成脂、成骨分化，并鑒定細(xì)胞周期。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar 雄性大鼠24 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（滬）2022-0004，于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)、造模和觀察，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（滬）2014-0008。

1.5 模型制備與分組干預(yù) 采用30% CCl4-橄欖油溶液2 mL/kg 皮下注射，每周2 次，共計(jì)6 周制備大鼠肝硬化模型。第7周開始，模型大鼠隨機(jī)分為模型組（M 組）、BMSC 組、BMSCM2組，每組6 只。在繼續(xù)30% CCl4-橄欖油溶液造模的同時(shí)，予以2-AAF 10 mg·kg-1·d-1灌胃以抑制肝細(xì)胞增殖，制備CCl4/2-AAF 大鼠肝硬化模型。于第7 周開始，將BMSC 和BMSCM2經(jīng)尾靜脈以單次注射的方式移植至大鼠體內(nèi)，注射劑量為1×106cells/只。同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組（N 組，n=6）。10 周末取材，留取血清及肝組織標(biāo)本。

1.6 血清生化學(xué)檢測(cè) 血清ALT 和AST 活性檢測(cè)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。

1.7 肝組織Hyp含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)［12］中的方法使用試劑盒檢測(cè)。

1.8 肝組織病理和免疫組化染色方法 石蠟固定組織切片，厚4 μm，以進(jìn)行HE、天狼星紅、免疫組化染色。參考文獻(xiàn)［13］中的方法進(jìn)行免疫組化。組織切片脫蠟修復(fù)封閉后，α-SMA（1∶2 000）、CD68（1∶1 000）、EpCam（1∶500）、Sox9（1∶1 000）、CK7（1∶400）、CK19（1∶1 000）、HNF-4α（1∶400）、Alb（1∶50）等一抗孵育1 h，HRP 標(biāo)記的二抗（1∶1 000）孵育30 min，洗滌，DAB 顯色，蘇木精對(duì)比染色，Leica SCN 400掃描儀掃描。

1.9 RT-PCR TNF-α、TGF-β1、CD68、α-SMA、EpCam、Sox9、CK7、CK19、HNF-4α、Alb mRNA 表達(dá)采用定量RTPCR 方法檢測(cè)?？俁NA 提取采用RNA 純化試劑盒（Lot.250800，Toyobo 公司），mRNA 表達(dá)檢測(cè)采用SYBR Green real-time PCR Master Mix（SYBR）（Lot.411900）（Toyobo 公司，Osaka，Japan），以及ViiA? 7 real-time PCR System（ABI，American）。引物由Takara 公司設(shè)計(jì)合成（Takara Chemical）。SYBR 一步法RT-PCR 反應(yīng)條件如下：42 ℃ 15 min、95 ℃ 2 min、95 ℃變性15 s，40 個(gè)循環(huán)，60 ℃延伸退火1 min。

1.10 免疫印跡 肝組織采用RIPA 緩沖液裂解，4 ℃17 000×g離心10 min，測(cè)定上清液蛋白濃度，10%凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% BSA 混合溶液封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，α-SMA（1∶2 000）、CD68（1∶2 000）、GAPDH（1∶10 000）；二抗（1∶1 000）室溫下孵育1 h，ECL法顯影，使用image J分析計(jì)算灰度值積分。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMDM 及BMSC的分離、培養(yǎng)與鑒定 本實(shí)驗(yàn)所分離的BMSC 符合漩渦狀生長(zhǎng)的細(xì)胞形態(tài)（圖1a），成骨誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)BMSC周圍有明顯茜素紅染色的鈣結(jié)節(jié)樣沉淀物（圖1b）。成脂誘導(dǎo)顯示BMSC 周圍出現(xiàn)空泡樣的脂滴，油紅O 染色脂滴呈橘紅色（圖1c）。流式細(xì)胞儀分析顯示，M2-BMDM 細(xì)胞CD206＋95.5%（圖1d）；BMSC 細(xì)胞CD45－99.9%，CD90＋99.9%，CD29＋99.9%，且G1 期細(xì)胞占比為78.2%（圖1e～f）。

2.2 抑制肝臟炎癥反應(yīng)的作用比較 HE 染色顯示，M組大鼠肝組織可見大量肝細(xì)胞脂肪變性，纖維間隔可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組大鼠肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脂肪變性明顯減少，尤以BMSCM2組改善更為明顯（圖2a）。

血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與N 組比較，M 組大鼠血清ALT、AST 活性顯著升高（P值均＜0.01）；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組ALT、AST 活性顯著降低（P值均＜0.01），且BMSCM2組ALT、AST 活性顯著低于BMSC 組（P值均＜0.05）（圖2c）。

此外，與N 組比較，M 組肝組織TNF-α、TGF-β1、CD68 mRNA 表達(dá)水平顯著增加（P值均＜0.01）；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組TNF-α、TGF-β1mRNA 水平均顯著降低（P值均＜0.05），且BMSCM2組TNF-α、TGF-β1 mRNA 水平顯著低于BMSC 組（P值均＜0.05）（圖2d）。CD68的免疫組化及蛋白印跡顯示相同的趨勢(shì)（圖2e～f）。

2.3 抑制肝硬化進(jìn)展的作用比較 天狼星紅膠原染色顯示，M 組大鼠肝組織膠原沉積明顯增加，已形成完整假小葉結(jié)構(gòu)；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組膠原沉積明顯減輕，尤以BMSCM2組改善更為明顯（圖3）。

圖3 天狼星紅染色和α-SMA免疫組化染色結(jié)果（×200）Figure 3 Sirius red staining and α-SMA immunohistochemical staining results（×200）

肝組織Hyp含量檢測(cè)顯示，與N組比較，M 組Hyp含量顯著增加（P＜0.01）；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組Hyp 含量顯著降低（P＜0.05）（圖4a）。免疫組化染色顯示，與N 組比較，M 組肝組織α-SMA 陽性表達(dá)明顯增加；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組α-SMA 陽性表達(dá)均明顯減少，且BMSCM2組更優(yōu)（圖3）。α-SMA mRNA 表達(dá)水平及蛋白印跡結(jié)果與免疫組化染色結(jié)果相吻合，且BMSCM2組均顯著低于BMSC組（P＜0.01）（圖4b～d）。

圖4 BMSCM2抑制肝硬化進(jìn)展Figure 4 BMSCM2 inhibits the progression of liver cirrhosis

2.4 抑制肝祖細(xì)胞增殖的作用比較 免疫組化染色顯示，與N組比較，M組大鼠肝組織EpCam、Sox9陽性表達(dá)明顯增加；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組EpCam、Sox9陽性表達(dá)明顯減少，尤以BMSCM2組改善最佳（圖5）。EpCam 及Sox9 mRNA 表達(dá)水平與免疫組化染色相吻合，且BMSCM2組EpCam mRNA 水平顯著低于BMSC 組（P＜0.05）（圖6）。

圖5 EpCam和Sox9免疫組化染色結(jié)果（×200）Figure 5 Immunohistochemical staining results of EpCam and Sox9（×200）

圖6 BMSCM2抑制肝祖細(xì)胞增殖Figure 6 BMSCM2 inhibits hepatic progenitor cell proliferation

2.5 抑制膽管反應(yīng)的作用比較 免疫組化染色顯示，與N 組比較，M 組大鼠肝組織CK7 和CK19 陽性表達(dá)明顯增加；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組大鼠肝組織CK7 和CK19 表達(dá)明顯減少，尤以BMSCM2組改善更佳（圖7）。肝組織CK7 和CK19 mRNA 表達(dá)水平顯示相同趨勢(shì)，且BMSCM2組CK19 mRNA 水平顯著低于BMSC 組（P＜0.05）（圖8）。

圖7 CK7和CK19免疫組化染色結(jié)果（×200）Figure 7 Immunohistochemical staining results of CK7 and CK19（×200）

圖8 BMSCM2抑制膽管反應(yīng)Figure 8 BMSCM2 inhibits bile duct reactions

2.6 促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的作用比較 免疫組化染色顯示，與N 組比較，M 組大鼠肝組織HNF-4α 和Alb 陽性表達(dá)明顯減少；與M組比較，BMSC組和BMSCM2組HNF-4α和Alb表達(dá)明顯增加，尤以BMSCM2組更為明顯（圖9）。HNF-4α及Alb mRNA 表達(dá)與免疫組化染色結(jié)果相吻合，且BMSCM2組HNF-4α顯著高于BMSC組（P＜0.05）（圖10）。

圖9 HNF-4α和Alb免疫組化染色結(jié)果（×200）Figure 9 Immunohistochemical staining results of HNF-4α and Alb（×200）

圖10 BMSCM2 促進(jìn)肝細(xì)胞增殖Figure 10 BMSCM2 promotes hepatocyte proliferation

3 討論

巨噬細(xì)胞起源于單核細(xì)胞前體，具有吞噬、抗原提呈等多種功能，在組織穩(wěn)態(tài)和宿主防御中發(fā)揮重要作用［14］。肝臟中的巨噬細(xì)胞主要由肝臟Kupffer細(xì)胞和浸潤(rùn)的單核巨噬細(xì)胞構(gòu)成。在慢性肝損傷時(shí)，巨噬細(xì)胞可通過釋放促炎細(xì)胞因子或趨化因子等激活肝星狀細(xì)胞（HSC），使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展［15］。同時(shí)，巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性，其可根據(jù)環(huán)境信號(hào)快速地在促炎（M1）和抗炎（M2）之間進(jìn)行表型轉(zhuǎn)換，稱之為巨噬細(xì)胞極化［16］。M1 和M2 巨噬細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜、細(xì)胞表面標(biāo)志、細(xì)胞因子等方面均具有高度異質(zhì)性，對(duì)纖維化肝臟ECM沉積和組織重建發(fā)揮雙重調(diào)節(jié)作用［17］。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）來源于骨髓、脂肪、臍帶、皮膚、骨骼肌等多種組織［18］，具有良好的自我增殖與多向分化潛能，獲取容易，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，免疫原性低［19］。近年來，MSC在肝硬化的治療領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景［20］，其中BMSC 被認(rèn)為是最具有肝細(xì)胞再生能力的干細(xì)胞群體［5］。MSC治療肝硬化的機(jī)制十分復(fù)雜，如移植的MSC 可分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞［21］；促進(jìn)肝臟巨噬細(xì)胞由M1向M2轉(zhuǎn)化，抑制HSC活化，促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞分泌MMP13，促進(jìn)膠原降解［22-23］；通過旁分泌功能表達(dá)各種細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子以及外泌體等，間接和遠(yuǎn)程促進(jìn)受損肝組織修復(fù)等［24］。

課題組前期研究［10］表明體外誘導(dǎo)分化的M1-BMDM和M2-BMDM 對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化均具有良好的干預(yù)效應(yīng)，兩者均可通過抑制肝臟炎癥反應(yīng)和HSC活化，或促進(jìn)肝臟巨噬細(xì)胞活化并釋放MMP9、MMP13，促進(jìn)ECM的降解，且M2-BMDM 的綜合干預(yù)作用優(yōu)于M1-BMDM。此外，課題組前期研究［11］表明BMSC 移植可有效抑制大鼠膽汁性肝纖維化進(jìn)展。但目前尚不清楚M2-BMDM 是否可影響B(tài)MSC對(duì)肝硬化的治療效應(yīng)。本研究將來源于M2-BMDM 微環(huán)境的BMSC（BMSCM2）經(jīng)尾靜脈注入CCl4/2-AAF 誘導(dǎo)的大鼠肝硬化模型體內(nèi)，結(jié)果表明BMSC 和BMSCM2均可顯著抑制肝臟炎癥反應(yīng)和肝硬化進(jìn)展，且BMSCM2顯示出比BMSC更優(yōu)的治療作用。

HSC 活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)［25］，TNF-α 和TGF-β1 主要來源于活化的肝臟巨噬細(xì)胞，是促進(jìn)HSC活化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，參與HSC的活化并促進(jìn)其產(chǎn)生大量ECM［26-27］。本研究結(jié)果顯示BMSCM2注射可顯著降低肝組織α-SMA 的蛋白表達(dá)以及α-SMA、TNF-α和TGF-β1的mRNA表達(dá)，其作用顯著優(yōu)于BMSC，提示與M2-BMDM 共培養(yǎng)后的BMSC 可進(jìn)一步提高對(duì)HSC 活化的抑制作用，這可能與M2-BMDM 影響B(tài)MSC對(duì)肝臟巨噬細(xì)胞極化功能，或影響B(tài)MSC 的旁分泌功能等有關(guān)。

EpCam 和Sox9 是公認(rèn)的肝祖細(xì)胞增殖的標(biāo)志物［28-29］。膽管反應(yīng)是各種慢性肝病常見病理改變，在肝硬化的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，CK7和CK19是公認(rèn)的膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志物［30］。課題組前期研究［31］結(jié)果表明，在CCl4/2-AAF誘導(dǎo)的大鼠肝硬化模型中，2-AAF可劑量依賴性地促進(jìn)肝祖細(xì)胞活化并向肌成纖維細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化，促進(jìn)肝硬化進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，BMSC和BMSCM2注射后均能顯著抑制肝組織EpCam、Sox9、CK7和CK19的表達(dá)水平，顯著增加肝細(xì)胞標(biāo)志物HNF-4α 和Alb 的表達(dá)水平，且BMSCM2優(yōu)于BMSC。提示BMSC 和BMSCM2治療肝硬化的機(jī)制可能與抑制肝祖細(xì)胞增殖及其向膽管細(xì)胞分化，促進(jìn)肝再生有關(guān)，且BMSCM2的治療作用更為突出，這可能與M2-BMDM 影響B(tài)MSC 在肝硬化肝臟內(nèi)的分化方向有關(guān)，也有可能通過促進(jìn)BMSC 分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等刺激肝細(xì)胞再生有關(guān)［32］。

綜上所述，BMSC 在肝硬化治療領(lǐng)域已經(jīng)取得長(zhǎng)足發(fā)展，但M2-BMDM 是否可提高BMSC 的治療效應(yīng)尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果證實(shí)來源于M2-BMDM 微環(huán)境的BMSC 經(jīng)外周注射能夠進(jìn)一步提高BMSC 治療肝硬化的效應(yīng)，其機(jī)制與抑制肝臟炎癥反應(yīng)及HSC 活化，抑制肝祖細(xì)胞增殖及膽管反應(yīng)，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖等有關(guān)，為進(jìn)一步提高BMSC的肝硬化治療作用提供了新思路。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021年11月15日經(jīng)由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：PZSHUTCM211115023，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：鄭欣瑞、許燕楠負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施，收集數(shù)據(jù)，資料分析，論文撰寫；王丹陽、邢飛飛、張士豪、宗夢(mèng)瑤、戰(zhàn)俊邑參與實(shí)驗(yàn)研究；陳高峰負(fù)責(zé)病理；劉偉、陳佳美、劉平參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；慕永平負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，提供寫作思路，指導(dǎo)論文撰寫并最后定稿。鄭欣瑞、許燕楠對(duì)本文貢獻(xiàn)等同，同為第一作者。