CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型肝小葉內(nèi)卵圓細(xì)胞總體積與輪廓數(shù)密度變化的體視學(xué)分析

王川林，劉全明，楊 霞，楊正偉，梅小平，彭 彬

1 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科，四川 南充 637000

2 川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，四川 南充 637000

3 川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)研究所，四川 南充 637000

肝纖維化和終末期肝硬化是嚴(yán)重的全球醫(yī)療問題，但肝纖維化發(fā)生機(jī)制目前仍未完全闡釋清楚。肝星狀細(xì)胞（HSC）活化被認(rèn)為是肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1-3］。本課題組前期采用體視學(xué)方法結(jié)合電鏡技術(shù)研究了CCl4所致肝纖維化大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)的改變，發(fā)現(xiàn)肝纖維化大鼠竇周隙內(nèi)HSC 數(shù)量顯著增加［4］。同時(shí)，還在大鼠肝小葉內(nèi)（主要是竇周隙以及肝細(xì)胞間）觀察到了大量增生的幼稚細(xì)胞。通過查閱文獻(xiàn)，根據(jù)這種幼稚細(xì)胞電鏡下的形態(tài)學(xué)特征、位置，判斷這種幼稚細(xì)胞可能是肝臟干細(xì)胞中的卵圓細(xì)胞（hepatic oval cell，HOC）［5-6］。HOC 是一類具有多向分化潛能的肝臟干細(xì)胞，研究表明，HOC 也參與了肝纖維化的過程，但是HOC在肝纖維化過程中所起的作用目前尚存爭議。有研究［7］報(bào)道，HOC在HSC活化過程中通過合成結(jié)締組織生長因子，促進(jìn)HSC 的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的分泌，加重肝纖維化。但也有研究［8］發(fā)現(xiàn)體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為HOC，將其移植入CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠體內(nèi)，能有效減輕肝纖維化。HOC 在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型中扮演什么樣的角色，究竟是加重肝纖維化還是改善肝纖維化，值得進(jìn)一步思考。由于HOC在正常肝臟中數(shù)量極少，僅占正常肝細(xì)胞的1%～3%，且HOC 體積很小，光鏡下很難被辨認(rèn)。另外目前HOC 的表面標(biāo)志物如膽管上皮角蛋白CK7、CK8、CK18、CK19、OV6、c-met、HEA-125 和HepParl 等缺乏特異性，不同亞群及不同發(fā)育階段的HOC所表達(dá)的標(biāo)志物也不盡相同，HOC 的分子鑒定研究也存在一定困難［9-10］。因此電鏡研究HOC被認(rèn)為是最可靠和最有價(jià)值的方法。電鏡下HOC 形態(tài)學(xué)特征為胞體近似圓形或卵圓形，胞核大，胞漿相對(duì)較少，核質(zhì)比高，核仁較明顯，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較少，含少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體［5-6］。為明確CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠是否伴有肝小葉內(nèi)HOC 總體積與輪廓數(shù)密度的變化，進(jìn)一步探討HOC在肝纖維化進(jìn)程中的作用，本課題組采用體視學(xué)方法結(jié)合透射電鏡技術(shù)測量了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝小葉內(nèi)HOC 的總體積與輪廓數(shù)密度，以期為HOC在肝纖維化中的作用提供形態(tài)定量證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 11 只3 月齡健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量160～180 g，購買于川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為2 組：對(duì)照組（n=5）、肝纖維化組（n=6）。

1.2 動(dòng)物模型建立

1.2.1 肝纖維化組模型制備 將橄欖油（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）與CCl4（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）按體積比2∶3 配成40%橄欖油與CCl4混懸液，在大鼠背部皮下注射3 mL/kg的橄欖油與CCl4混懸液，每周注射2次，建立大鼠肝纖維化模型，造模5 周后取材。本研究模型組的6 只大鼠是從15 只建模大鼠中選取的按肝纖維化Metavir 分期標(biāo)準(zhǔn)成功達(dá)到Ⅱ～Ⅲ期肝纖維化大鼠。從造模開始的第2、3、4、5 周，分別在15 只模型大鼠中隨機(jī)選取1 只取材判斷肝組織的病理變化情況，并在第5 周觀察到肝組織出現(xiàn)了Ⅱ期肝纖維化病理改變，即對(duì)剩下的大鼠全部取材，并選取其中6 只達(dá)到肝纖維化Ⅱ～Ⅲ期病理改變的大鼠納入實(shí)驗(yàn)組［11］。

1.2.2 對(duì)照組模型制備 在大鼠背部皮下注射3 mL/kg的生理鹽水，每周2次，造模5周后取材。

1.3 肝臟密度與體積測量方法 采用電子天平（精度0.1 mg）稱量大鼠肝臟質(zhì)量，并用已知密度的不同濃度的蔗糖或乙醇溶液測量肝臟密度，用大鼠肝臟質(zhì)量除以肝臟密度，即可得到大鼠肝臟體積。

1.4 肝組織處理與切片制備

予以大鼠3%戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔注射進(jìn)行麻醉。隨機(jī)剪取一小塊肝組織切成1 mm3放入2.5%戊二醛固定，用于制作電鏡超薄切片。剩余肝組織放入4%的多聚甲醛（成都市科龍化工試劑廠）浸潤固定48 h 后用于制備石蠟包埋切片。

1.4.1 石蠟切片制備 從每只大鼠肝臟按照等距隨機(jī)抽樣抽選4個(gè)2 mm厚的組織塊行石蠟包埋，每個(gè)肝組織塊用半自動(dòng)石蠟切片機(jī)切取2 張14 μm 厚的石蠟切片，按照Masson 三色染色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司）說明書上的Masson染色方法染色肝組織切片，以顯示膠原纖維。光鏡下觀察大鼠肝纖維化造模效果。

1.4.2 電鏡超薄切片制備 肝組織塊經(jīng)2.5%戊二醛固定4 h后，從每只大鼠中隨機(jī)抽選5個(gè)肝組織塊制作電鏡超薄切片，具體方法如下：首先在4 ℃溫度下1% OSO4中固定2 h，乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂812（SPICHEM，美國）滲透、包埋。利用超薄切片機(jī)（德國LEICA EM UC7）從每個(gè)組織塊切取70 nm 厚的連續(xù)超薄切片放置在銅網(wǎng)上。用乙酸雙氧鈾（SPI-CHEM，美國）和檸檬酸鉛（中國成都科龍化學(xué)試劑廠）染色后在透射電子顯微鏡下觀察。

1.5 體視學(xué)分析

1.5.1 計(jì)算肝HOC總體積 在透射電子顯微鏡（HT7700）下觀察肝組織超薄切片，發(fā)現(xiàn)放大倍數(shù)為1 200 倍時(shí)剛好能對(duì)一個(gè)圓形銅網(wǎng)內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)隨機(jī)抽選視野拍照，當(dāng)在放大1 200 倍下分辨不清組織結(jié)構(gòu)時(shí)，將放大倍數(shù)放大更高后拍照以準(zhǔn)確地辨認(rèn)結(jié)構(gòu)，平均每只大鼠約獲得25 張照片。在Adobe Photoshop CS6 軟件里將每張電鏡照片（1 200倍）上隨機(jī)疊加7×7個(gè)測點(diǎn)，分別計(jì)數(shù)落在HOC 上的測點(diǎn)數(shù)以及落在肝組織上的總測點(diǎn)數(shù)。HOC的體積分?jǐn)?shù)為該大鼠肝臟所有照片落在HOC 的測點(diǎn)數(shù)之和除以該大鼠肝臟所有照片肝組織上的總測點(diǎn)數(shù)之和，將HOC 體積分?jǐn)?shù)乘以肝臟的總體積，即可得到HOC總體積。

1.5.2 計(jì)算肝HOC 的輪廓數(shù)密度 用Photoshop 軟件在已獲得的電鏡照片（×1 200 倍）上，疊加無偏計(jì)數(shù)框（圖1），體視框面積為2 354.45 μm2，按照禁線法則抽選并計(jì)數(shù)位于計(jì)數(shù)框內(nèi)或與計(jì)數(shù)線相交，且不與禁線相交的HOC 的數(shù)量。單位面積內(nèi)HOC 輪廓的數(shù)量（輪廓數(shù)密度，NA）為組內(nèi)所有體視框所計(jì)數(shù)HOC 的總數(shù)除以每個(gè)體視框面積與體視框數(shù)量的乘積。

圖1 體視框計(jì)數(shù)肝卵圓細(xì)胞數(shù)密度Figure 1 Contour number density of hepatic oval cells counted by stereoscopic frame

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 27.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下定性觀察CCl4所致肝纖維化大鼠肝組織的主要病理改變 對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)偶可見1～3個(gè)脂滴，肝組織內(nèi)膠原纖維主要分布在門管區(qū)與竇周隙，中央靜脈周圍可見極少量膠原纖維。與對(duì)照組比較，肝纖維化組大鼠肝細(xì)胞體積明顯增大，肝細(xì)胞出現(xiàn)了大量氣球樣變性、脂肪變性甚至壞死，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴明顯增多。匯管區(qū)膠原纖維大量增生，增生的纖維間隔向鄰近肝小葉延伸，部分大鼠少數(shù)纖維間隔形成，部分大鼠多數(shù)纖維間隔形成，所有大鼠按照肝纖維化分期Metavir 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)達(dá)到Ⅱ～Ⅲ期。肝組織內(nèi)竇周隙和中央靜脈周圍可見明顯增厚的膠原纖維束，肝血竇變窄（圖2）。

圖2 Masson染色的肝組織結(jié)構(gòu)Figure 2 Histological structure of liver by Masson staining

2.2 電鏡下觀察CCl4所致肝纖維化大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)的主要病理改變 在對(duì)照組，大鼠肝細(xì)胞呈不規(guī)則六邊形，肝竇周隙內(nèi)可見少量膠原纖維，竇周隙內(nèi)偶可見極個(gè)別HSC與HOC。HOC的胞體近似圓形或卵圓形，其胞核較大，胞質(zhì)極少，部分HOC整個(gè)胞體幾乎為細(xì)胞核，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較少，主要為線粒體與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。與對(duì)照組比較，肝纖維化組大鼠肝細(xì)胞部分脂肪變，部分細(xì)胞器溶解壞死，竇周隙顯著增寬，其內(nèi)膠原纖維明顯增生，血竇腔明顯變窄甚至塌陷。竇周隙內(nèi)HSC 大量增生，HSC 胞體增大，胞質(zhì)內(nèi)脂滴明顯增多。竇周隙內(nèi)與肝細(xì)胞間HOC 大量增生，竇周隙內(nèi)增生的HOC 主要位于HSC的附近（圖3、4）。

圖3 電鏡下肝組織超微結(jié)構(gòu)Figure 3 Ultrastructure of liver tissue under electron microscope

圖4 電鏡下HOC超微結(jié)構(gòu)（×7 000）Figure 4 Ultrastructure of hepatic oval cell under electron microscope（×7 000）

2.3 體視學(xué)形態(tài)定量研究結(jié)果 與對(duì)照組比較，肝纖維化組大鼠肝小葉內(nèi)HOC 總體積顯著增加了8.53 倍，其輪廓數(shù)密度顯著增加了9.08倍（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠肝小葉內(nèi)肝HOC總體積與輪廓數(shù)密度（每mm2細(xì)胞數(shù)量）變化Table 1 Changes in total volume（mm3）and contour number density（number of cells per mm2）of hepatic oval cells in hepatic lobules of rats in each group

3 討論

HOC 是肝臟中一種多潛能干細(xì)胞，在肝組織受到嚴(yán)重或慢性損傷時(shí)，能分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，修復(fù)組織損傷［12］。肝纖維化是一種以ECM過度積聚的創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)［13-14］。HOC參與了肝纖維化過程，但HOC的激活究竟是加重肝纖維化還是改善纖維化，各學(xué)者的觀點(diǎn)并不一致。目前關(guān)于HOC在肝纖維化中活化增殖的研究主要是采用定性或半定量研究方法，對(duì)HOC增殖的定量研究缺乏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本研究電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，HOC 的胞體近似圓形或卵圓形，其胞核較大，胞質(zhì)極少，部分HOC整個(gè)胞體幾乎為細(xì)胞核，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較少，主要為線粒體與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。這與Lotowska 等［5］與de Vos［6］等報(bào)道的HOC形態(tài)學(xué)特征近似，體視學(xué)定量研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，肝纖維化組大鼠肝小葉內(nèi)HOC總體積顯著增加了8.53倍，其輪廓數(shù)密度顯著增加了9.08倍。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，單個(gè)HOC 細(xì)胞的體積并未顯著增加，因此肝小葉內(nèi)HOC 總體積的增加主要與HOC 數(shù)量的增加有關(guān)。該研究結(jié)果從形態(tài)學(xué)定量角度證實(shí)了CCl4所致肝纖維化過程中伴隨著大鼠HOC 的大量增生。本研究結(jié)果為HOC 在肝纖維化過程中的增生提供了可靠的形態(tài)學(xué)定量證據(jù)。

HOC在肝纖維化中的作用尚存在爭議，Awan等［15］通過將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的HOC移植入肝纖維化小鼠中，發(fā)現(xiàn)其能有效減輕肝纖維化。Yang等［16］將TGF-β1處理WB-F344 HOC 12 h后發(fā)現(xiàn)，可通過上調(diào)人纖溶酶原激活抑制劑的表達(dá)抑制HSC 活化，從而減輕肝纖維化。也有報(bào)道［17］稱，在肝纖維化動(dòng)物模型和人肝纖維化組織中，HOC數(shù)量與肝纖維化程度呈正相關(guān)。邱德凱等［18］通過對(duì)慢性肝病患者肝組織病理分析發(fā)現(xiàn)，HOC 數(shù)量隨著肝纖維化程度的加重而顯著增高。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，肝纖維化組竇周隙內(nèi)膠原纖維大量增生，同時(shí)竇周隙內(nèi)增生的膠原周圍伴隨著HSC 與HOC 大量增生。由此推測HOC可能與肝纖維化形成有關(guān)，其原因可能與HOC促進(jìn)HSC增殖與活化有關(guān)。

本課題組前期研究［4］證實(shí)CCl4致肝纖維化大鼠竇周隙中膠原纖維總體積、HSC 的總體積與數(shù)量顯著增加。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化大鼠竇周隙內(nèi)HSC 增生的部位周圍伴隨著大量HOC 增生。HSC 活化轉(zhuǎn)變成肌成纖維細(xì)胞分泌大量ECM 是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)［19］。研究［20-21］表明，在HSC 激活的過程中，HOC 能夠通過合成IL-6、血小板衍生因子、結(jié)締組織生長因子、血管內(nèi)皮生長因子與TGF-β1 等，促進(jìn)HSC 的活化與增殖，分泌ECM，加重肝纖維化。HOC 除了能分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞外，還可以分化為HSC 或肌纖維母細(xì)胞，直接參與ECM 的沉積。Wang 等［22］用TGF-β1 處理肝纖維化小鼠模型中分離的HOC，能使其表達(dá)HSC標(biāo)志物肌間線蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白，分化為HSC，并上調(diào)ECM 相關(guān)基因的表達(dá)。由此推測，在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化過程中，CCl4可能通過促進(jìn)HOC 增殖，激活HSC 分泌大量ECM，從而參與肝纖維化形成。本研究認(rèn)為HOC的大量增生可能與肝纖維形成有關(guān)。

不同學(xué)者對(duì)HOC在肝臟分布的位置有不同的觀點(diǎn)。Faktor 等［23］認(rèn)為，HOC 來源于Hering 管（又被稱為微膽管或終末膽管）和肝門周小膽管；而Burke 等［24］研究認(rèn)為，HOC 存在于肝門周區(qū)和肝實(shí)質(zhì)內(nèi)。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠肝組織竇周隙內(nèi)偶可見HOC，在肝纖維化組大鼠，HOC 主要位于充滿膠原纖維的竇周隙內(nèi)與肝細(xì)胞間，本研究支持HOC位于肝實(shí)質(zhì)即肝小葉內(nèi)的觀點(diǎn)。本課題組前期通過體視學(xué)方法結(jié)合光鏡研究結(jié)果表明，大鼠小葉間（包括匯管區(qū)）占肝臟總體積的比例僅有0.4%（正常組）和2.7%（肝纖維化組）［3］，由此說明，無論是在大鼠正常肝組織還是纖維化肝組織匯管區(qū)占整個(gè)肝臟的比例非常低，加之盡管透射電鏡的高放大倍數(shù)能準(zhǔn)確分辨出HOC，但由于其視野很小，本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)取得的電鏡標(biāo)本制作觀察到匯管區(qū)的概率極低，而體視學(xué)定量研究需要的樣本量較大，因此本實(shí)驗(yàn)未分析匯管區(qū)HOC的增生情況。本實(shí)驗(yàn)的另外一個(gè)局限性在于未做新生幼稚細(xì)胞的免疫組化染色進(jìn)一步確定其為HOC。在下一步實(shí)驗(yàn)中本課題組將在光鏡下采用免疫組化標(biāo)記HOC，并對(duì)肝小葉間（包括匯管區(qū)）和小葉內(nèi)的HOC 進(jìn)行定量研究。

肝纖維化的治療仍是醫(yī)學(xué)界難題，本研究結(jié)果顯示肝纖維化過程中HOC 大量增生，隨著對(duì)HOC 生物學(xué)特性以及在肝纖維化進(jìn)展中作用的深入研究，相信在未來針對(duì)HOC 的靶向干預(yù)有望成為肝纖維化防治的有效措施。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021 年12 月24 日經(jīng)由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：2021119。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：彭彬、楊正偉、梅小平負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)研究方案并提供指導(dǎo)性支持；王川林、劉全明、楊霞負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、整理與分析；王川林、彭彬負(fù)責(zé)論文撰寫與修改。