基于煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）探討紅景天苷在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中的保護(hù)作用

李榮軍，徐春霞，張 庭，張志紅，王 縷

1 瀘州市中醫(yī)醫(yī)院脾胃病肝病科，四川 瀘州 646000

2 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646000

不良的生活方式及飲食習(xí)慣導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率迅速增長，已成為我國第一大慢性肝病和健康體檢肝臟生化指標(biāo)異常的首要原因［1］。最新的流行病學(xué)調(diào)查［2-3］結(jié)果顯示，包括中國在內(nèi)的多數(shù)亞洲國家NAFLD 患病率處于中上水平（＞25%）。紅景天苷在NAFLD 中可通過改善胰島素抵抗、抗氧化應(yīng)激、抗纖維化等途徑發(fā)揮保護(hù)作用［4-7］。同時，研究［8］表明，細(xì)胞內(nèi)煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferas，NAMPT）具有調(diào)節(jié)肝脂質(zhì)代謝的潛在作用。本研究通過建立NAFLD 模型，并以NAMPT 為切入點(diǎn)，探討紅景天苷在NAFLD 中的調(diào)控作用及其可能機(jī)制，以期為紅景天苷的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級6 周齡雄性KM 小鼠24 只，體質(zhì)量（30±5）g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（川）2015-030，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證編號：SYXK（川）2014-000。

1.1.2 藥物制備 紅景天苷（＞98%，大連美侖生物技術(shù)有限公司），批號：J1206A。用時以蒸餾水配置成濃度為10 mg/mL的藥液。

1.1.3 高脂飼料 配方：82.5%普通飼料、10%豬油、5%蔗糖、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.1.4 試劑 ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C 檢測試劑盒（Mindray 公司）；NAMPT、AMPKα、SERBP1 抗體、Sirt1（Affinity公司）；β-actin抗體（Abclonal公司）；Western及IP 細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime公司）；預(yù)染蛋白Marker（ABClone 公司）；ECL 發(fā)光試劑盒（Affinity 公司）；Immobilon-PSQ PVDF 膜（Sigmaaldrich公司）；PAGE 凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司）；Glycine（Biofroxx 公司）；Tris 緩沖液、SDS（Biofroxx公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及造模 將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常組（普通飼料喂養(yǎng)）、高脂飲食（HFD）組、HFD+空白對照組、HFD+紅景天苷組，每組6只。HFD組通過高脂飼料喂養(yǎng)14 周建立NAFLD 動物模型，14 周末以HFD 組小鼠肝臟病理切片中出現(xiàn)大小不一的脂滴和氣球樣變?yōu)樵炷３晒?biāo)準(zhǔn)。在14周末開始給予HFD+紅景天苷組小鼠100 mg·kg-1·d-1紅景天苷灌胃處理8 周，HFD+空白對照組小鼠以同等體積的生理鹽水作為對照，給藥期間各組小鼠喂養(yǎng)方式不變。

1.2.2 獲取標(biāo)本 22 周末，禁食24 h 后稱重，處死小鼠，打開腹腔，腹主動脈采血，收集血液樣品并分離血清；部分肝組織用多聚甲醛液（4%）固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE 染色在光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)、脂質(zhì)沉積等病理學(xué)變化，通過NAFLD 活動度積分（NAFLD activity score，NAS）評價各組小鼠肝組織脂肪變性、小葉炎癥和氣球樣變程度［9］，評分越高表明脂肪變性、小葉炎癥、氣球樣變程度越高（表1）。剩余肝組織置于-80 ℃保存，用于Western Blot檢測。

表1 NAS評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 NAS scoring criteria for liver tissue

1.2.3 ELISA法測定血清生化指標(biāo) 取小鼠血清樣本，按照各指標(biāo)ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C等相關(guān)生化指標(biāo)測量。

1.2.4 Western Blot 法檢測肝組織內(nèi)NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1表達(dá) 取小鼠肝臟樣本，向每管加入RIPA裂解液，用滅菌剪刀將組織剪碎，置碎冰上裂解10 min；收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min；離心后取上清液，用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。BCA 定量后將蛋白濃度調(diào)至10 μg/μL，上樣40 μg，經(jīng)凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5% BSA 室溫下封閉2 h，分別加入兔抗NAMPT 抗體（1∶1 000）；AMPKα 抗體（1∶1 000）；SERBP1抗體（1∶1 000）；Sirt1抗體（1∶1 000）；鼠抗β-actin抗體（1∶100 000），4 ℃過夜，第二天經(jīng)過TBST 充分漂洗后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體（1∶5 000），室溫孵育2 h，經(jīng)TBST充分漂洗后，ECL發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NAFLD小鼠模型建立 正常組小鼠肝組織中央靜脈周圍肝細(xì)胞呈放射狀分布，單行排列，形態(tài)一致，細(xì)胞核圓且居中，胞漿均勻分布；HFD 組小鼠肝索排列紊亂，肝細(xì)胞體積明顯增大且胞質(zhì)染色變淺（部分呈現(xiàn)透明），出現(xiàn)“氣球樣”變，部分細(xì)胞核被擠壓于一側(cè)，匯管區(qū)周圍有炎癥細(xì)胞浸潤，提示NAFLD模型建立成功（圖1）。

圖1 各組小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE染色，×100）Figure 1 Pathological changes of liver tissue in mice of each group（HE staining，×100）

2.2 紅景天苷對KM 小鼠血清生化指標(biāo)的影響 與正常組比較，HFD 組及HFD+空白對照組的血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C 水平明顯升高（P值均＜0.05），而HDL-C 明顯降低（P＜0.05）；HFD+紅景天苷組血清AST、TC 水平明顯高于正常組（P值均＜0.05）。與HFD組及HFD+空白對照組相比，HFD+紅景天苷組小鼠血清ALT、AST、TG、LDL-C 水平明顯降低（P值均＜0.05），而HDL-C 明顯升高（P＜0.05）（表2）。

表2 紅景天苷對KM小鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 2 The effect of Salidroside on serum biochemical indicators in KM mice

2.3 各組小鼠肝組織病理變化比較 正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈周圍的肝細(xì)胞形態(tài)一致、呈有序單行條索狀排列、放射狀分布，胞核圓且居中，胞漿分布均勻；與正常組比較，HFD 組及HFD+空白對照組小鼠肝組織可觀察到明顯的脂肪變性、小葉炎癥、氣球樣變等病理變化，NAS 評分明顯升高（P值均＜0.01）；與HFD 組及HFD+空白對照組比較，HFD+紅景天苷組小鼠肝組織損傷程度明顯減輕，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列較為完整有序，肝組織脂肪蓄積及細(xì)胞空泡化得到明顯改善，脂肪空泡數(shù)量明顯減少，NAS 評分降低（P值均＜0.01）（圖2，表3）。

圖2 各組小鼠肝臟組織HE染色Figure 2 Pathological changes of liver tissue in mice of each group

表3 各組小鼠肝組織NAS評分Table 3 The NAS score of liver tissue in mice of each group

2.4 各組小鼠肝組織NAMPT、AMPKα、Sirt1、SREBP1 蛋白表達(dá)比較 與正常組相比，HDF組及HDF+空白對照組小鼠肝組織中NAMPT、AMPKα、Sirt1蛋白表達(dá)顯著降低（P值均＜0.05），而經(jīng)過紅景天苷處理的小鼠肝臟NAMPT、AMPKα、Sirt1 蛋白表達(dá)明顯高于HDF 組、HDF+空白對照組（P值均＜0.05），同時HDF+紅景天苷組AMPKα 低于正常組（P＜0.05）。HDF 組以及HDF+空白對照組可明顯上調(diào)SREBP1 的表達(dá)，與正常組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.01），經(jīng)過紅景天苷處理的小鼠肝臟SREBP1 表達(dá)較HDF 組以及HDF+空白對照組明顯減少（P＜0.01）（圖3、4）。

圖3 各組小鼠肝組織NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1蛋白表達(dá)Figure 3 The hepatic protein expression of NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1 in mice of each group

圖4 紅景天苷對NAFLD小鼠肝臟NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1表達(dá)的影響Figure 4 The effect of salidroside on the hepatic protein expression of NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1 in mice of each group

3 討論

紅景天苷為紅景天提取物，是景天科紅景天屬的多年生草本植物，分子式：C14H20O7，在《四部醫(yī)典》和《本草綱目》均有記載。研究［10-14］證明紅景天苷有提高機(jī)體免疫力、增強(qiáng)體質(zhì)、改善人體造血機(jī)能、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖、抗病毒、抗輻射、預(yù)防高原反應(yīng)等多種功能。此外，戴寧等［15］研究顯示紅景天苷對高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的NASH 有較好的抑制效果，其機(jī)制可能與紅景天苷的抗氧化作用有關(guān)；陳少東等［4］研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能明顯降低NAFLD 血清TG 水平及AST 活性，改善肝組織脂肪變性的病理狀態(tài)，具有顯著減輕NASH病理損傷的藥理效應(yīng)。張新茹［16］研究報道，紅景天苷能顯著降低高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠的血脂、減少肝臟中的脂質(zhì)沉積。本研究結(jié)果顯示，高脂飼料誘導(dǎo)的NAFLD 模型組血生化指標(biāo)中ALT、AST、TG、TC、LDL-C 均明顯升高，且AST、TG 升高明顯，同時導(dǎo)致肝組織明顯脂肪變性，提示存在明顯的NASH表現(xiàn)，而經(jīng)過紅景天苷治療后，ALT、AST、TG、LDL-C 均明顯下降，肝脂肪變程度明顯改善，提示紅景天苷具有改善NAFLD 小鼠的脂代謝、肝功能、肝脂肪變性的作用，存在改善NAFLD 的潛力，進(jìn)一步證實(shí)了紅景天苷防治NAFLD、高血脂等方面的療效。

國內(nèi)研究［17］顯示人群的NAFLD 患病率為13%～43%，且NAFLD 患病率呈逐年上升趨勢，每年新發(fā)NAFLD的人數(shù)比例約為4%。其中非肥胖NAFLD也有一定的患病率，其主要的危險因素包括甘油三酯的蓄積、遺傳因素、不良的生活方式、糖尿病、高尿酸血癥、高雄激素血癥、藥物性脂肪肝等［18］，不僅最終可能進(jìn)展為晚期肝?。òㄊТ鷥斝愿斡不透渭?xì)胞癌），其與代謝綜合征、2型糖尿病、動脈粥樣硬化性心血管疾病以及結(jié)直腸腫瘤等的高發(fā)密切相關(guān)［19］。NAFLD 最顯著的特征是甘油三酯在肝臟中的積累。據(jù)報道［15］，脂質(zhì)合成異常是肝臟異常脂質(zhì)沉積的主要原因之一。NAMPT 是一種高度保守的52 kD 蛋白質(zhì)，在哺乳動物中具有細(xì)胞內(nèi)（iNAMPT）和細(xì)胞外形式（eNAMPT）。NAMPT是細(xì)胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的重要調(diào)節(jié)因子，是調(diào)節(jié)來自哺乳動物NAM 轉(zhuǎn)變?yōu)镹AD+補(bǔ)救途徑中的限速步驟［20］。研究［8］表明，NAMPT在體內(nèi)和體外肝脂肪變性模型中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，NAMPT通過激活NAD+補(bǔ)救途徑促進(jìn)NAD+的產(chǎn)生，增加的NAD+作為底物激活Sirt1信號通路，一方面Sirt1的活化直接促進(jìn)SREBP1的脫乙酰化，導(dǎo)致SREBP1活性抑制；另一方面，Sirt1 通過激活A(yù)MPKα，間接抑制SREBP1活性。SREBP1 活性的抑制最終導(dǎo)致包括FASN 和ACC在內(nèi)的脂肪生成基因表達(dá)的抑制，從而減輕高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝脂肪變性［21-22］。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD 模型組，NAMPT、Sirt1、AMPKα 表達(dá)明顯減少，且SREBP1 表達(dá)增加，提示高脂飲食可通過NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1 信號通路，促進(jìn)脂質(zhì)合成且沉積于肝臟，從而導(dǎo)致NAFLD。經(jīng)過紅景天苷干預(yù)后NAFLD小鼠肝組織NAMPT、Sirt1、AMPKα蛋白表達(dá)升高，SREBP1的表達(dá)減少，由此推斷紅景天苷可通過上調(diào)NAMPT、Sirt1、AMPKα，抑制SREBP1 活性，最終導(dǎo)致其下游脂肪生成受抑，減輕高脂肪飲食誘導(dǎo)的小鼠肝脂肪變性，發(fā)揮其對NAFLD的保護(hù)作用。

綜上，紅景天苷可明顯改善NAFLD 小鼠血液生化指標(biāo)，保護(hù)肝臟功能，降低血液中血脂含量，并可通過促進(jìn)NAMPT、Sirt1、AMPK的表達(dá)，減少SERBP1的表達(dá)，發(fā)揮其對NAFLD 的保護(hù)作用。通過本研究進(jìn)一步闡明紅景天苷在NAFLD 中的作用及其可能機(jī)制，為紅景天苷相關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)以及找尋防治NAFLD 藥物新靶點(diǎn)具有重要的科學(xué)和社會意義。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021年9月29日經(jīng)由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會審批，批號：20210929-013，符合實(shí)驗(yàn)室動物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王縷、李榮軍、張志紅負(fù)責(zé)課題設(shè)計；王縷、張庭負(fù)責(zé)飼養(yǎng)動物，造模，處理動物獲得標(biāo)本；王縷負(fù)責(zé)Western Blot、ELISA、病理組織學(xué)相關(guān)試驗(yàn)；徐春霞負(fù)責(zé)資料分析；李榮軍、張志紅負(fù)責(zé)擬定寫作思路；李榮軍、王縷負(fù)責(zé)撰寫論文，修改論文，最后定稿。