可注射含鈣骨基質(zhì)材料的制備及骨修復(fù)評價

郝麗芳 劉永進 韓麗偉 胡先同 衷鴻賓 李利 侯樹勛 趙彥濤

20 世紀(jì) 60 年代，Urist 等[1]首次報道關(guān)于脫鈣骨基質(zhì) (demineralized bone matrix，DBM) 具有骨誘導(dǎo)活性。目前 DBM 在骨再生和修復(fù)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用，能有效提高同種異體骨的利用率[2-5]。DBM 通過脫鈣處理，使骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP) 及其它生長因子得以從其周圍致密的礦物成分中釋放，進而發(fā)揮成骨誘導(dǎo)的能力。所以，DBM 中含鈣量過高，則不利于組織修復(fù)過程中BMP 的釋放[6]；含鈣量過低，則會減緩磷酸鹽的沉積[7]。因此，骨原料在脫鈣過程中應(yīng)適當(dāng)保留部分鈣質(zhì)可能有利于骨組織的修復(fù)。目前 DBM 終產(chǎn)品大都為粉末或顆粒，在臨床使用中，由于術(shù)中出血，使得 DBM 骨粉在治療區(qū)域成形較差，骨粉未能完全填充缺損區(qū)域形成空腔，進而影響 DBM 的修復(fù)效果，同時，游離的骨粉還可能會對周圍組織傷口的愈合產(chǎn)生影響[8-9]。為了解決 DBM 骨粉或顆粒在臨床使用中操作困難及術(shù)后從植入?yún)^(qū)域遷移游離等問題，有研究者提出 DBM 與載體共混使用的方式，例如雙峰[10]使用 DBM 混合醫(yī)用幾丁糖制備成可注射骨修復(fù)材料來修復(fù)兔橈骨骨缺損，馬潞等[11]使用明膠和二硫蘇糖醇、聚乙二醇雙丙烯酸酯制備成的水凝膠作為 DBM 的輸送載體。這些方法雖解決了骨粉在缺損區(qū)域固定的問題，但其對骨修復(fù)效果卻有很大差異，可能是所用載體不同導(dǎo)致的。理想的載體應(yīng)具有良好的物理性和生物相容性，活性物質(zhì)的可持續(xù)釋放可控，且不能抑制 DBM 的骨誘導(dǎo)活性，終端滅菌后性能穩(wěn)定[12-13]。

本課題組提出以甘油 -水 -明膠 (glcerol-watergelatin，GWG) 作為輸送載體，使含鈣骨基質(zhì) (calciumcontaining bone matrix，CBM) 粉賦型為可注射式材料，該材料生物安全性好，骨修復(fù)能力強，為臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論應(yīng)用。

材料與方法

一、可注射含鈣骨基質(zhì) (injectable calciumcontaining bone matrix，ICBM) 的制備及表征

參照本課題組前期研究，賦型劑 -2.50% GWG凝膠制備，稱取 0.63 g 明膠以 1∶3 (g∶g) 的比例在純化水中溶脹 1 h，然后加入 25 ml 預(yù)熱甘油，在70 ℃ 下持續(xù)攪拌約 10 min，使明膠完全溶解。CBM骨粉制備：采用同種骨植入材料 (北京鑫康辰醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司提供)，打粉篩分，取 100～150 μm顆粒于 0.5 mol/ L 鹽酸中恒溫振蕩器脫鈣 2 h，純化水清洗 5 次，每次 10 min[14]。待 2.50% GWG 凝膠完全冷卻后與 CBM 骨粉均勻混合。最后，將制備的ICBM 分裝密封，25 kGy 滅菌劑量的60Co 輻照滅菌后備用。

二、pH 值測定

分別取 2 ml CBM 和 ICBM 于燒杯中，加入20 倍體積的煮沸蒸餾水，超聲震蕩 10 min，室溫靜置 10 min，取上清測量 pH，重復(fù) 3 次，取平均值。

三、鈣含量測定

取 5 ml ICBM 于燒杯中，用蒸餾水反復(fù)沖洗，待賦型劑完全去除，將剩余的 CBM 用濾紙吸干并稱重。按照質(zhì)量比加適量硝酸進行硝解，高錳酸鉀法測定并計算鈣含量。

四、注射性能測定

將 ICBM 裝入 2 ml 一次性塑料注射器中，末端開口內(nèi)徑為 2 mm。采用 CSS-1101 電子萬能實驗機(長春實驗機廠) 測試注射性能。以 10 mm/ min 的速度將 ICBM 從注射器中推出，至加載力為 100 N 時結(jié)束。記錄位移結(jié)果并計算 ICBM 從注射器中推出所需要的推注力，重復(fù) 3 次，取平均值。

五、體外生物相容性評價

1.浸提液制備：ICBM 浸提液：按照重量與浸提液 0.10 g/ ml 的比例，加入 1640 完全培養(yǎng)基，37 ℃ 下浸提 24 h，制得浸提液。陰性對照：高密度聚乙烯，按照 3 cm2/ ml 比例加入 1640 完全培養(yǎng)基。陽性對照：含 20% 二甲基亞砜的 1640 完全培養(yǎng)基。

2.3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽 [ 3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-2,5-diphenytetrazoliumromide，MTT ] 法檢測浸提液對 L929細胞的增殖毒性：胰蛋白酶消化獲得 L929 細胞，細胞計數(shù)后按細胞密度為 1×104/ ml，接種到 96 孔板，每孔 100 μl。24 h 后棄去原培養(yǎng)基，各分別加入對應(yīng)浸提液，在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，觀察細胞形態(tài)。按照 GB/ T16886.5-2017《醫(yī)療器械生物學(xué)評價第 5 部分：體外細胞毒性實驗》的要求進行細胞形態(tài)學(xué)定性分級。每孔加入 20 μl 0.5% 的 MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，棄去液體，加入 150 μl 二甲基亞砜 (dimethyl sulfoxide，DMSO)，振蕩 10 min，在 450 nm 下用酶標(biāo)儀測定吸光度，按下列公式計算 L929 細胞的相對增殖率：

RGB=(A 供試品/ A 空白) ×100%

式中：RGB 為相對增殖率 (%)；A 供試品組為實驗組、陰性對照組、陽性對照組平均吸光度；A 空白為空白對照組平均吸光度。

六、體內(nèi)安全性評價

1.ICBM 浸提液制備：按照 0.10 g/ ml 的浸提比例，用生理鹽水進行浸提，于 37 ℃ 條件下浸提72 h。

2.急性全身毒性：選擇 6～8 周昆明 (SPF 級)小鼠，雌雄各半，采用隨機數(shù)字表法分成實驗組(ICBM) 和對照組 (生理鹽水)，每組 5 只。采用小鼠腹腔注射浸提液進行評價。注射前，記錄小鼠初始體重。注射劑量及方法參考 GBT 16886.11-2011《醫(yī)療器械生物學(xué)評價第 11 部分：全身毒性試驗》，在注射后 0 h、24 h、48 h 和 72 h 觀察小鼠是否出現(xiàn)不良反應(yīng)，每個時間點稱量小鼠體重，72 h 后進行眼眥內(nèi)取血檢測以及解剖肝臟、腎臟、脾臟和胸腺稱重，計算臟器比重。

3.遲發(fā)型超敏反應(yīng)：選擇成年白化豚鼠，采用隨機數(shù)字表法分成實驗組 (ICBM 浸提液)、陰性對照組 (生理鹽水) 和陽性對照組 (2，4-二硝基氯苯)，每組 5 只。(1) 皮內(nèi)誘導(dǎo)：每只豚鼠肩胛骨內(nèi)側(cè)脫毛對稱皮內(nèi)注射 0.10 ml，共 6 個位點。(2) 局部誘導(dǎo)：皮內(nèi)誘導(dǎo)后 7 天，脫去實驗區(qū)毛，用濾紙浸透 ICBM 浸提液后局部貼敷于動物各注射點，封閉式包扎固定，48 h 后去除包扎帶和濾紙。對照組用同法操作。(3) 激發(fā)階段：局部誘導(dǎo)后 14 天，脫去一側(cè)實驗區(qū)毛，用濾紙分別在 ICBM 浸提液和對照液中浸透后，貼敷于實驗區(qū)，封閉式包扎固定，24 h 后除去包扎帶和濾紙。在 24 h 和 48 h 后，分別觀察實驗組和對照組皮膚反應(yīng)情況。用 Magnusson和 Kligman 分級標(biāo)準(zhǔn)對激發(fā)部位及不同時間觀察皮膚紅斑和水腫反應(yīng)進行描述并分級。

七、體內(nèi)骨誘導(dǎo)試驗

選取 6～8 周裸鼠，雌雄各半，采用隨機數(shù)字表法分成實驗組 (ICBM) 和對照組 (DBM)，每組 5 只。采用腿部肌間隙進行骨誘導(dǎo)實驗，在肌袋植入等量的實驗組或?qū)φ战M材料。術(shù)后 4 周，處死動物，取材后10% 甲醛溶液固定，經(jīng)過脫鈣、脫水、包埋及切片后，蘇木精 -伊紅 (HE) 染色，組織學(xué)形態(tài)觀察。按照骨誘導(dǎo)活性評分 OI 標(biāo)準(zhǔn)[15]進行活性分級。

八、兔股骨髁缺損修復(fù)

選取新西蘭白兔 12 只 (由解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心動物實驗室提供) 每組 6 只。1% 戊巴比妥鈉按 2 ml/ kg 耳緣靜脈注射麻醉，以股骨髁正中縱向切口，依次切開露出股骨髁。在股骨髁上鉆直徑5 mm、深度 5 mm 缺損，在缺損處分別填充 ICBM 和DBM。術(shù)后 8 周，手術(shù)部位處切開皮膚，取出完整股骨髁，于 10% 甲醛固定液中固定 24 h 后，以 30%甲酸 -乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA) 溶液室溫振蕩脫鈣 2 周，梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，以蘇木精 -伊紅 (HE) 染色，以免疫組織化學(xué)法行堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP) 染色，觀察股骨髁缺損部位愈合情況。

九、統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均采用表示，比較采用t檢驗，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、理化性能

ICBM 外觀為微黃色，具有可塑性，從注射器中均勻推擠出 (圖 1)。關(guān)于 ICBM 的 pH、鈣含量和注射推力指標(biāo)見表 1。

二、ICBM 體外生物相容性

表1 ICBM 的主要性能 (，n=3)Tab.1 The main performance of ICBM (,n=3)

表1 ICBM 的主要性能 (，n=3)Tab.1 The main performance of ICBM (,n=3)

注：“/”表示檢測指標(biāo)不適用該樣本Notice: ‘/’ indicated that the detection indicators were not applicable to the sample

圖1 ICBM 外觀形貌Fig.1 The appearance of ICBM

在各實驗組加入相應(yīng)浸提液培養(yǎng) 72 h 后，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，空白對照組、陰性對照組和實驗組均觀察到胞質(zhì)內(nèi)有離散顆粒，無細胞溶解，無細胞增殖下降情況，細胞毒性評級為 0 級，而陽性對照組細胞幾乎全部溶解死亡，細胞毒性評級為 4 級。ICBM 組、陰性對照組和陽性對照組中L929 細胞的相對增殖率分別為 (104.25±3.39) %、(105.66±3.06) % 和 (1.63±0.28) %，表明 ICBM 無細胞毒性且生物相容性良好 (圖 2、3)。

圖2 各實驗組 L929 細胞增殖狀態(tài) a：實驗組 (10×)；b：陰性對照組 (10×)；c：空白組 (10×)；d：陽性對照組 (10×)Fig.2 The proliferation of L929 cells in each experimental group a: The experimental group (10 ×);b: The negative control group (10 ×);c: The blank group (10 ×);d: The positive control group (10 ×)

圖3 各組細胞相對增殖率Fig.3 The relative proliferation rates of cells in all groups

三、體內(nèi)安全性評價結(jié)果

1.急性全身性毒性：將浸提液注射后，兩組小鼠在 72 h 觀察期內(nèi)均未出現(xiàn)俯臥不動、痙攣等異常行為，無小鼠死亡。浸提液注射后 24 h、48 h 和72 h，隨著時間的延長，實驗組和對照組小鼠體重均呈增長趨勢，體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞ 0.05)。在 72 h 時，兩組小鼠臟體比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞ 0.05)。說明 ICBM 植入體內(nèi)不會對重要臟器產(chǎn)生不良影響 (圖 4、5)。

在浸提液注射 72 h 后，通過對各實驗組進行血常規(guī)檢測，與陰性對照組相比，白細胞 (white blood cell count，WBC)、紅細胞計數(shù) (red blood cell count，RBC) 及血紅蛋白 (hemoglobin，HGB) 計數(shù)均未發(fā)生顯著變化 (P＞ 0.05)，而陽性對照組的血小板(platelet count，PLT) 明顯升高 (P＜ 0.01)，表明 ICBM植入體內(nèi)不會對凝血生理指標(biāo)產(chǎn)生影響 (表 2)。

2.遲發(fā)型超敏反應(yīng)：白化豚鼠在注射 ICBM 浸提液，除去濾紙后 24 h 和 48 h，均未觀察到紅斑和水腫等皮膚刺激反應(yīng)，陰性對照組動物也未出現(xiàn)刺激反應(yīng)，Magnusson 和 Kligman 分級均為 0 級，而注射 2,4-二硝基氯苯的陽性對照組在 24 h 和 48 h 均出現(xiàn)紅斑和輕微水腫反應(yīng)，Magnusson 和 Kligman 分級為 2 級。表明 ICBM 植入體內(nèi)不會引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)。

表2 小鼠血常規(guī)指標(biāo)比較 (，n=5)Tab.2 Comparison of the indexes by routine blood test (,n=5)

表2 小鼠血常規(guī)指標(biāo)比較 (，n=5)Tab.2 Comparison of the indexes by routine blood test (,n=5)

四、ICBM 體內(nèi)骨誘導(dǎo)

在 4 周后對組織進行取材，HE 染色結(jié)果顯示DBM 組僅有少量成骨細胞，而 ICBM 組可見大量有明顯的成骨現(xiàn)象，有新骨、軟骨以及類骨髓腔結(jié)構(gòu)形成，說明 ICBM 具有顯著骨誘導(dǎo)活性 (圖 6)。利用 Image J 軟件計算新骨生成量，OI 標(biāo)準(zhǔn)評分與新骨面積。結(jié)果顯示 ICBM 組新生骨量高于 DBM 組，說明 ICBM 骨誘導(dǎo)活性活躍 (表 3)。

圖4 注射浸提液前后小鼠體重變化Fig.4 The change of body weight of mice before and after injection of the extract

圖5 小鼠臟器比值Fig.5 The organ ratios of the mice

五、ICBM 修復(fù)兔股骨髁缺損情況

在第 8 周時，對兔股骨髁缺損部位組織修復(fù)面積進行測量以及 HE、ALP 染色。ICBM 組缺損修復(fù)面積為 (15.68±2.25) %，優(yōu)于 DBM 組的 (12.91±2.27) %，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜ 0.05) (圖 7)。HE染色結(jié)果顯示，DBM 組在缺損處中可見形成較大空腔，而 ICBM 組在缺損區(qū)域中形成空腔明顯縮小，說明賦型劑可固定 CBM 骨粉，減輕骨粉顆粒游離遷移；ALP 染色結(jié)果顯示，ICBM 組在缺損處成骨效果明顯優(yōu)于 DBM 組 (圖 8)。

表3 體內(nèi)骨誘導(dǎo)評分 OITab.3 In vivo bone induction score by OI

討論

圖6 ICBM 和 DBM 體內(nèi)骨誘導(dǎo) 4 周 a：ICBM組織 HE 染色 (20×)；b：DBM 組織 HE 染色(20×) (黃色箭頭表示軟骨細胞和軟骨陷窩，紅色箭頭表示成骨細胞，綠色箭頭表示骨小梁，藍色箭頭表示骨髓樣組織)Fig.6 Inducing DBM and ICBM in vivo for 4 weeks a: ICBM tissue HE staining (20 ×);b: DBM tissue HE staining (20 ×) (The yellow arrow represented chondrocytes and cartilage lacunae,the red arrow represented osteoblasts,the green arrow represented bone trabecula,and the blue arrow represented bone marrow-like tissue)

圖7 比較 ICBM 和 DBM 修復(fù)兔股骨髁缺損 8 周時修復(fù)面積Fig.7 The repair area of DBM and ICBM for rabbit femoral condyle defect at week 8 was compared

目前，國內(nèi)有關(guān) DBM 顆?；蚍勰┰谑中g(shù)操作中會出現(xiàn)成形差，術(shù)后無法對缺損進行修復(fù)，且顆粒游離會影響缺損修復(fù)部位骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)作用發(fā)揮，同時散落在傷口周圍 DBM 粉末也會影響傷口正常愈合[16]。曾有學(xué)者提出以殼聚糖、玻璃酸鈉、甲基纖維素等作為賦型劑來解決 DBM 應(yīng)用問題[17-18]。現(xiàn)在國內(nèi)醫(yī)療器械大多采用終端輻照滅菌的方式，而賦型劑在輻照后穩(wěn)定性極為重要。在前期研究中，筆者對這三種賦型劑和 GWG 輻照前后黏度進行比較，發(fā)現(xiàn)輻照前賦型劑黏度介于 6000～1600 Pa·s，而輻照后除 GWG 外，其余賦型劑后黏度均低于10 Pa·s，說明 GWG 輻照能夠耐受輻照滅菌[19]。

本研究以前期研究為基礎(chǔ)，以 GWG 作為賦型劑制備 ICBM，對骨修復(fù)進行評價。首先，對骨原料進行脫鈣處理，使 BMP 及其它生長因子從周圍致密礦物成分中釋放出來，進而發(fā)揮成骨誘導(dǎo)能力，脫鈣程度會影響成骨活性。Zhang 等[7]發(fā)現(xiàn)，在異體骨植入兔橈骨缺損處，脫鈣率 (81.10%) 越高骨修復(fù)速度越快。同時，有研究者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鈣殘留量低于DBM 質(zhì)量 1.20% 時，誘導(dǎo)新生骨質(zhì)質(zhì)量顯著降低，對于骨基質(zhì)中適量保留鈣可成為新生骨組織鈣化核心，為磷酸鈣沉積提供晶核[20]。本研究中，檢測骨粉鈣含量 (26.24±1.25) %，ICBM 鈣含量為 (5.32±0.73) %。然后，對 ICBM 通過體外細胞毒性實驗，結(jié)果評級為 0 級，說明其賦型材料具有良好的生物相容性。在體內(nèi)進行急性毒性實驗和遲發(fā)型超敏反應(yīng)實驗，結(jié)果顯示 ICBM 材料不會對小鼠產(chǎn)生急性全身性毒性，沒有引起小鼠皮膚紅斑和水腫等刺激反應(yīng)，說明 ICBM 材料具有良好的體內(nèi)安全性。體內(nèi)進行骨誘導(dǎo)實驗驗證，結(jié)果顯示 DBM 組僅有少量成骨細胞形成，而 ICBM 組可見大量有明顯的成骨現(xiàn)象，有新骨、軟骨以及類骨髓腔結(jié)構(gòu)形成，說明其骨誘導(dǎo)活性高。

基于以上表征和評價結(jié)果，筆者使用 ICBM 材料對兔股骨髁缺損進行修復(fù)，結(jié)果顯示，8 周時，ICBM 組缺損修復(fù)面積為 (15.68±2.25) %，DBM組缺損修復(fù)面積為 (12.91±2.27) %，ICBM 組修復(fù)效果明顯優(yōu)于 DBM 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。進一步說明骨粉在脫鈣過程中適當(dāng)留存部分鈣利于后續(xù)缺損組織修復(fù)，但對于骨基質(zhì)內(nèi) BMP-2等因子釋放、鈣保留量以及組織修復(fù)效果之間的動態(tài)平衡關(guān)系，本研究僅在鈣保留量 (5.32±0.73) %進行初步探索，后期筆者會對其它方面進行研究。另外，有研究者發(fā)現(xiàn)，在用載體輸送 DBM 時，由于 DBM 被賦型劑包裹，阻礙與周圍組織直接接觸及 BMP 相關(guān)因子釋放，將會延遲 DBM 發(fā)揮骨誘導(dǎo)活性[21-22]。Barbieri 等[23]研究表明，載體包裹磷酸鈣延遲組織長入和血管化發(fā)生，減少間充質(zhì)干細胞遷入。而筆者對 ICBM 植入兔股骨髁缺損處發(fā)現(xiàn)，GWG 沒有影響組織再生。在組織修復(fù)初期，對于賦型劑填充防止 CBM 流失及空腔形成，而 GWG 會被體液吸收，這為組織長入提供空間以達到更好的修復(fù)效果。

綜上所述，以 GWG 為載體，制備為可注射式ICBM，其在保持骨誘導(dǎo)活性同時有效改善 CBM 粉或顆粒在臨床使用中塑形操作困難等問題，為 ICBM臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。