雞miR-133a-3p的表達(dá)、生物信息學(xué)分析及其靶基因初篩

摘要：為了研究雞不同組織中miR-133a-3p的表達(dá)情況并預(yù)測(cè)其靶基因，進(jìn)行GO、KEGG富集分析，對(duì)關(guān)鍵靶基因進(jìn)行初篩，闡明其在機(jī)體中的作用。通過(guò)miRBase檢索15個(gè)物種的miR-133a-3p序列，采用MEGA 7.0進(jìn)行多物種序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建；使用TargetScan、miRDB預(yù)測(cè)雞miR-133a-3p的靶基因，再取交集，對(duì)其進(jìn)行GO、KEGG富集分析；通過(guò)qPCR檢測(cè)miR-133a-3p在羅斯308肉雞各組織中的表達(dá)量，并檢測(cè)其靶基因在不同生長(zhǎng)周齡（W0～W6）胸肌中的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明，不同物種miR-133a-3p的成熟序列同源性極高，物種間保守，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，雞miR-133a-3p與原鴿聚為一支；預(yù)測(cè)獲得145個(gè)靶基因，GO富集分析顯示，靶基因富集到酶活性調(diào)控、分子功能負(fù)調(diào)控、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)形成、肌球蛋白結(jié)合等條目，KEGG結(jié)果顯示，靶基因富集到p53、mTOR、FoxO、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控等多條與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路；對(duì)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)通路進(jìn)行分析，挖掘到PIK3CB、NRAS、EGFR、PRKAA1、IGF1R這5個(gè)顯著富集基因；miR-133a-3p僅在胸肌、腿肌、心臟中表達(dá)，且在胸肌中的表達(dá)量顯著高于心臟、腿?。≒lt;0.01）；隨著生長(zhǎng)周齡的增長(zhǎng)，miR-133a-3p在胸肌中的表達(dá)量先升后降，而靶基因IGF1R的表達(dá)量呈先降后升的規(guī)律，它們的拐點(diǎn)均在第3周齡，二者負(fù)相關(guān)。綜上說(shuō)明，雞miR-133a-3p在肌肉組織中特異性表達(dá)，很可能通過(guò)靶基因IGF1R調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育。

關(guān)鍵詞：雞；miR-133a-3p；生物信息學(xué)；表達(dá)分析；肌肉生長(zhǎng)發(fā)育；靶基因篩選

中圖分類號(hào)：S831.2" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）24-0179-08

收稿日期：2024-07-02

基金項(xiàng)目：四川省科技廳科技計(jì)劃（編號(hào)：2019YJ0341）；國(guó)家開(kāi)放大學(xué)產(chǎn)教融合協(xié)同育人中心建設(shè)試點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：2023CY3314）。

作者簡(jiǎn)介：余春蓮（1991—），女，重慶人，碩士，講師，主要研究方向?yàn)樾笄葸z傳育種。E-mail：519154841@qq.com。

通信作者：楊煒蓉，博士，副教授，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種。E-mail：constance890711@126.com。

在畜禽育種與生產(chǎn)中，肌肉發(fā)育是一個(gè)關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程，它直接影響動(dòng)物的生長(zhǎng)速度、肉質(zhì)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值^［1］。隨著生物信息學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，人們對(duì)肌肉發(fā)育相關(guān)基因及其調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種長(zhǎng)約22 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)與肌生成相關(guān)基因相互作用，控制成肌細(xì)胞增殖、分化等肌生成過(guò)程，在肌肉發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用^［2］。miR-133是一類肌肉組織特異性表達(dá)且高保守的功能型miRNA，它通過(guò)其序列結(jié)構(gòu)、豐度表達(dá)、多樣性的轉(zhuǎn)錄方式，調(diào)控肌發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)，從而調(diào)控骨骼肌細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程^［3-5］。miR-133a-3p作為miR-133家族中的一員，已被證實(shí)在小鼠、山羊、牛、人和虹鱒魚等物種的骨骼肌細(xì)胞增殖分化、肌管形成、肌肉損傷修復(fù)、肌肉再生過(guò)程中發(fā)揮重要功能^［6-11］。然而，miR-133a-3p在家禽中的研究較少，特別是關(guān)于它對(duì)雞骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的研究仍不清楚。在雞這一重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物中，肌肉發(fā)育的質(zhì)量直接關(guān)系到其生產(chǎn)性能和商業(yè)價(jià)值，對(duì)雞肌肉發(fā)育相關(guān)miR-133a-3p的研究顯得尤為重要。Li等發(fā)現(xiàn)，miR-133a-3p在雞骨骼肌中的表達(dá)差異上調(diào)，證實(shí)它與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，然而對(duì)它的分子調(diào)控機(jī)制以及在不同組織中的表達(dá)規(guī)律并沒(méi)有研究^［12-14］。本研究采用生物信息學(xué)分析手段，對(duì)雞miR-133a-3p的序列特征、保守性、靶基因預(yù)測(cè)等方面進(jìn)行綜合分析，旨在揭示其在雞肌肉發(fā)育中的潛在調(diào)控機(jī)制。同時(shí)，本研究利用qPCR技術(shù)檢測(cè)miR-133a-3p在羅斯308肉雞各組織中的表達(dá)水平以及miR-133a-3p及其靶基因在不同生長(zhǎng)周齡胸肌組織中的表達(dá)規(guī)律，對(duì)靶基因進(jìn)行初篩。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

飼養(yǎng)試驗(yàn)于2024年4—6月在四川大恒家禽育種有限公司開(kāi)展。以羅斯308肉雞為試驗(yàn)素材，按照動(dòng)物試驗(yàn)倫理委員會(huì)的要求，于1日齡（W0）飼喂至6周齡（W6）。期間每周齡采集1次樣品，每次采集3只。采集組織樣品包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌、腿肌，樣品經(jīng)液氮速凍后于－80 ℃冷凍保存。

1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript^TM IV 1st strand cDNA Synthesis Mix）購(gòu)自日本TaKaRa公司；QuantiNovaTM SYBR Green PCR試劑盒、DNase/RNase-free去離子水購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；TRIzol^TM Plus RNA 純化試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 查詢miR-133a-3p的位置及其序列、結(jié)構(gòu)

利用miBase （https：//mirbase.org/）下載雞（Gallus gallus）、斑馬魚（Danio rerio）、原鴿（Columba livia）、猩猩（Pan troglodytes）、眼鏡王蛇（Ophiophagus hannah）、鯉魚（Cyprinus carpio）、西洋鮭（Salmo salar）、牛（Bos taurus）、豬（Sus scrofa）、兔（Oryctolagus cuniculus）、小鼠（Mus musculus）、人（Homo sapiens）、鵪鶉（Callithrix jacchus）、鴨嘴獸（Ornithorhynchus anatinus）、山羊（Capra hircus）這15個(gè)物種的miR-133a-3p序列（表1），并在NCBI上查詢gga-miR-133a-3p（登錄號(hào)：MIMAT0001126）在基因組上的定位信息。

1.3.2 miR-133a-3p序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用MEGA 7.0 軟件的Alignment程序，對(duì)已獲取15個(gè)物種的miR-133a-3p成熟體進(jìn)行不同物種間的序列對(duì)比；通過(guò)MEGA 7.0軟件的 phylogeny程序，計(jì)算各模型組合的貝葉斯信息準(zhǔn)則分?jǐn)?shù)，采用基于距離參數(shù)的鄰接法（neighbor-joining，NJ），構(gòu)建miR-133a-3p的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.3 gga-miR-133a-3p靶基因預(yù)測(cè)及功能分析

分別利用2個(gè)在線網(wǎng)站miRDB（https：//mirdb.org/index.html）、Targetscan（https：//www.targetscan.org/vert_80/），預(yù)測(cè)gga-miR-133a-3p的靶基因。利用在線工具Draw Venn Diagram（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）對(duì)2個(gè)網(wǎng)站的預(yù)測(cè)結(jié)果取交集，以降低假陽(yáng)性。利用R包ClusterProfiler v4.2對(duì)gga-miR-133a-3p的靶基因交集進(jìn)行基因本體論（GO）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析?；赑lt;0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn)，選擇顯著富集的GO條目和KEGG通路，最終結(jié)果以矩狀氣泡圖的形式呈現(xiàn)。

1.3.4 組織表達(dá)分析

采用TRIzol^TM Plus RNA 純化試劑盒提取羅斯308肉雞各組織樣品的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。分別以U6、β-actin為內(nèi)參，每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用2^-ΔΔCT法計(jì)算gga-miR-133a-3p及其靶基因的相對(duì)表達(dá)量，引物信息見(jiàn)表2。擴(kuò)增體系（總體積為 10 μL）：上下游引物各0.5 μL，SYBR Green 5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL；擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共39個(gè)循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

gga-miR-133a-3p及其預(yù)測(cè)靶基因的組織表達(dá)量數(shù)據(jù)均使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析；試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，最后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Graphpad Prim 9.0，繪制柱狀圖和折線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 gga-miR-133a-3p的結(jié)構(gòu)與定位

gga-miR-133a-3p定位于雞20號(hào)染色體上基因LOC101747836內(nèi)部；前體序列g(shù)ga-miR-133a全長(zhǎng)95 bp，其5′-UTR、3′-UTR分別加工生產(chǎn)2個(gè)成熟的miRNA，分別為gga-miR-133a-5p、gga-miR-133a-3p，并構(gòu)成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（圖1）。

2.2 miR-133a-3p不同物種間序列比對(duì)分析

對(duì)15個(gè)物種的miR-133a-3p成熟體序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。各物種間miR-133a-3p成熟體序列基本相同，同源性極高，且序列長(zhǎng)度基本相同，均為21～23 nt。其中21個(gè)堿基（即第2～22位堿基）高度保守，僅第1、23位的U堿基存在個(gè)別缺失。各物種的miR-133a-3p的種子序列（UGGUCCC）完全一致。

2.3 miR-133a-3p系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用MEGA 7.0 軟件對(duì)miR-133a-3p在雞、原鴿、鵪鶉、豬、牛、山羊、兔、小鼠、西洋鮭、鯉魚、眼鏡王蛇、猩猩、人、鴨嘴獸、斑馬魚這15個(gè)物種的前體序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖3）表明，miR-133a-3p在進(jìn)化中保守性較高，成熟序列基本相同；雞與原鴿聚為一支，二者同為鳥(niǎo)類。

2.4 gga-miR-133a-3p靶基因預(yù)測(cè)

通過(guò)2個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)miRDB、TargetScan對(duì) gga-miR-133a-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，分別預(yù)測(cè)到380、221個(gè)靶基因； 取2個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果的交集降低其假陽(yáng)性，共得到145個(gè)共同靶基因（圖4）。

2.5 gga-miR-133a-3p靶基因的GO富集分析

對(duì)gga-miR-133a-3p的靶基因進(jìn)行GO富集分析，分為BP（生物學(xué)過(guò)程）、CC（細(xì)胞組分）、MF（分子功能）3個(gè)部分，結(jié)果見(jiàn)圖5。在BP中，靶基因主要富集于mRNA代謝過(guò)程調(diào)控、細(xì)胞因子響應(yīng)、酶活性調(diào)控、分子功能負(fù)調(diào)控、酶聯(lián)蛋白受體信號(hào)途徑等條目；在CC中，靶基因主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)、高爾基氏體、細(xì)胞核、囊泡等的形成有關(guān)；關(guān)于MF，靶基因主要具有與肌球蛋白結(jié)合、酶活性等分子功能。

2.6 gga-miR-133a-3p靶基因的KEGG富集分析

對(duì)gga-miR-133a-3p的靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果如圖6所示。靶基因主要參與線粒體自噬、磷酸酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、mTOR、FoxO、p53、嘌呤代謝、泛酸和輔酶A生物合成等信號(hào)通路。肌肉發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路及其靶基因見(jiàn)圖7。其中PIK3CB、NRAS是肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、mTOR、FoxO 這3條信號(hào)通路的共同基因；EGFR是肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、FoxO信號(hào)通路的共同基因；PRKAA1、IGF1R是mTOR、FoxO信號(hào)通路的共同基因。

2.7 gga-miR-133a-3p組織時(shí)間表達(dá)譜及靶基因初篩

gga-miR-133a-3p 的組織表達(dá)情況如圖8-A所示，在肝臟、肺臟、脾臟、腎臟中均未檢測(cè)到 gga-miR-133a-3p表達(dá)，僅在胸肌、腿肌、心臟中表達(dá)，且在胸肌中的表達(dá)量極顯著高于心臟、腿肌（Plt;0.01），在腿肌中的表達(dá)量極顯著高于心臟（Plt;0.01）。gga-miR-133a-3p 的時(shí)間表達(dá)情況如圖8-B所示，在羅斯308肉雞胸肌中，隨著周齡（W0～W6）的增長(zhǎng)，miR-133a-3p表達(dá)量呈先升后降的規(guī)律，且在3周齡達(dá)到表達(dá)量峰值。對(duì)5個(gè)肌肉發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路富集靶基因在不同生長(zhǎng)階段胸肌中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖8-C所示。IGF1R的mRNA表達(dá)量隨著周齡的增長(zhǎng)呈先降再升的規(guī)律，與miR-133a-3p表達(dá)量先升后降的規(guī)律相反，且它們的拐點(diǎn)均出現(xiàn)在3周齡。

3 討論

骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，受到眾多基因和信號(hào)通路的協(xié)同調(diào)控。本研究從miRNA分子角度，探究其在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制。miRNA是一類長(zhǎng)約22 nt的小分子非編碼RNA，主要通過(guò)其種子區(qū)序列與靶基因的3′-UTR靶序列特異性識(shí)別結(jié)合形成沉默復(fù)合物，從而抑制靶基因翻譯^{［1，15-16］}。miR-133a-3p是肌源性miRNA-133家族中的一員，已在多個(gè)物種中被證實(shí)參與肌肉相關(guān)基因的表達(dá)^［6-11］。本研究通過(guò)qPCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，gga-miR-133a-3p在羅斯308肉雞的腎臟、肺臟、脾臟、肝臟中均未被檢測(cè)到，而在胸肌、腿肌、心肌中高度表達(dá)，這說(shuō)明gga-miR-133a-3p是一種肌肉特異性表達(dá)miRNA，這與Li等的研究結(jié)果^［12-14］一致。羅斯308肉雞屬于快大型肉雞，生長(zhǎng)速度快，3～4周齡達(dá)到生長(zhǎng)速度高峰期，第6周齡（W6）就可生長(zhǎng)至2.5 kg的上市體重。在試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)miR-133a-3p表達(dá)量隨著羅斯308肉雞生長(zhǎng)日齡的增長(zhǎng)，呈先增后降再至平穩(wěn)的規(guī)律，并且在3周齡的時(shí)候達(dá)到表達(dá)量的最高峰，出現(xiàn)拐點(diǎn)后表達(dá)量緩慢降低；這與羅斯308肉雞的生長(zhǎng)曲線規(guī)律相吻合，也說(shuō)明miR-133a-3p是維持肉雞肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子。賈富民等研究發(fā)現(xiàn)，gga-miR-133a-5p雖然也在骨骼肌中高表達(dá)，但在其他非肌肉組織中也檢測(cè)到表達(dá)，并沒(méi)有表現(xiàn)出和gga-miR-133a-3p一致的肌肉特異性；說(shuō)明miR-133a-3p、miR-133a-5p雖然由同一個(gè)前體mir-133a加工生成，但其結(jié)構(gòu)差異也導(dǎo)致功能上的差異^［17］。雞的胸肌主要由快肌纖維構(gòu)成，心肌主要由慢肌纖維構(gòu)成，腿肌由快肌纖維、慢肌纖維嵌合構(gòu)成^［18］。gga-miR-133a-3p在胸肌中表達(dá)水平顯著高于心肌、腿肌，這表現(xiàn)出明顯的快肌纖維偏向性，推測(cè)其與快肌纖維的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。

miRNA的序列和結(jié)構(gòu)決定其分子功能。通過(guò)對(duì)15個(gè)物種的miR-133a-3p序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)各物種的miR-133a-3p成熟體序列幾乎相同，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)堿基突變，僅在第1、23位堿基處存在個(gè)別缺失，且種子區(qū)序列（UGGUCCC）完全相同。這說(shuō)明miR-133a-3p在各物種中高度保守，并且具有相同的靶基因，在各物種中功能類似；這與劉芳君等的研究結(jié)論“miRNA 在不同物種中相對(duì)保守，具有相似的功能和調(diào)控機(jī)制” ^［19］相吻合。通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，我們發(fā)現(xiàn)雞與同為鳥(niǎo)類的原鴿聚為一支，符合物種進(jìn)化規(guī)律。

識(shí)別篩選出 gga-miR-133a-3p 的靶基因是探索其功能及機(jī)制的關(guān)鍵。本研究利用miRDB、TargetScan 這2個(gè)在線平臺(tái)預(yù)測(cè)其靶基因，通過(guò)取其交集得到145個(gè)靶基因。通過(guò)GO分析，富集到肌球蛋白結(jié)合這一顯著條目；在KEGG分析中，得到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、FoxO、mTOR、p53等與肌肉相關(guān)的信號(hào)通路；這符合miR-133a-3p在肌肉組織中特異性表達(dá)的結(jié)果以及參與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的預(yù)期。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控信號(hào)通路影響細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架的組裝與調(diào)節(jié)、肌肉生長(zhǎng)與發(fā)育調(diào)控等多個(gè)方面，通路的異常與失活可能導(dǎo)致肌肉發(fā)育受到阻礙^［20］。p53信號(hào)通路主要通過(guò)其腫瘤抑制、調(diào)控細(xì)胞周期，影響肌肉細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和適應(yīng)性變化^［21］；同時(shí)p53信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞的能量代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)，保持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)一步促進(jìn)和保持肌肉的健康和功能^［22］。mTOR信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、維持健康的代謝狀態(tài)、參與細(xì)胞增殖和分化、響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)和激素刺激等方式，來(lái)促進(jìn)肌肉的生長(zhǎng)和發(fā)育^［23］。FoxO信號(hào)通路在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著多方面的作用，包括調(diào)控細(xì)胞增殖與分化、纖維類型轉(zhuǎn)換、蛋白質(zhì)合成與降解、代謝適應(yīng)以及衰老與再生等過(guò)程，這些作用共同影響著骨骼肌的結(jié)構(gòu)、功能和適應(yīng)性反應(yīng)^［24-25］。綜上，這些通路很可能是miR-133a-3p在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮功能的橋梁。

研究發(fā)現(xiàn)，PIK3CB、NRAS、EGFR、PRKAA1、IGF1R在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、mTOR、FoxO、p53等肌肉發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路中顯著富集，推測(cè)它們可能是miR-133a-3p發(fā)揮肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)調(diào)控作用的重要靶基因。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，PIK3CB編碼磷酸肌醇3激酶（PI3K）催化亞單位β亞型的一個(gè)亞型，屬于PI3K信號(hào)通路中一員，在肌肉損傷時(shí)表達(dá)顯著上調(diào)，并已證實(shí)通過(guò)IGF-I/PI3K通路促進(jìn)小鼠損傷骨骼肌的修復(fù)和再生^［26］。N-Ras蛋白是NRAS基因編碼的產(chǎn)物，屬于RAS/MAPK信號(hào)通路的一部分，在肌肉細(xì)胞增殖和分化中起間接作用^［27］。EGFR編碼一種跨膜蛋白，即表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR），屬于受體酪氨酸激酶（RTKs）家族，通過(guò)PI3K-AKT-mTOR途徑調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞存活等過(guò)程，從而促進(jìn)肌肉細(xì)胞的增殖和分化^［28］。PRKAA1基因作為AMPK的α1催化亞基，通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK的活性，影響肌肉細(xì)胞的能量代謝、蛋白質(zhì)合成和肌肉再生過(guò)程，從而間接影響肌肉的生長(zhǎng)和發(fā)育^［29］。大量研究已證實(shí)，IGF1R是協(xié)調(diào)肌肉生長(zhǎng)、增強(qiáng)肌肉修復(fù)、增加肌肉質(zhì)量和力量的關(guān)鍵因素之一；miR-322通過(guò)靶向IGF1R加重地塞米松誘導(dǎo)小鼠肌肉萎縮^［30-31］。CircRILPL1通過(guò)結(jié)合miR-145激活I(lǐng)GF1R/PI3K/AKT通路促進(jìn)牛肌肉增殖和分化^［32］。以上研究表明，PIK3CB、NRAS、EGFR、PRKAA1、IGF1R這5個(gè)基因在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。本研究對(duì)這5個(gè)靶基因在不同生長(zhǎng)周齡羅斯308肉雞的胸肌組織中的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)IGF1R的mRNA表達(dá)趨勢(shì)與gga-miR-133a-3p呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明它很可能是miR-133a-3p發(fā)揮肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)調(diào)控作用的重要靶基因，但其具體的分子調(diào)控機(jī)制還需通過(guò)靶標(biāo)試驗(yàn)及分子功能機(jī)制試驗(yàn)作進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié)論

miR-133a-3p序列在各物種間較為保守，符合進(jìn)化規(guī)律；靶基因富集分析結(jié)果表明，PIK3CB、NRAS、EGFR、PRKAA1、IGF1R在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、mTOR、FoxO、p53等肌肉發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路中顯著富集；雞miR-133a-3p僅在心臟、胸肌、腿肌中有表達(dá)，在胸肌中表達(dá)量顯著高于心臟、腿肌，是肌肉組織特異性表達(dá)miRNA，隨著周齡的增長(zhǎng)，miR-133a-3p在胸肌中的表達(dá)量呈先升后降再至平穩(wěn)的規(guī)律，且在3周齡達(dá)到表達(dá)量峰值；IGF1R在胸肌中的mRNA表達(dá)量隨著周齡（W0～W6）的增長(zhǎng)呈先降再升的規(guī)律，與miR-133a-3p表達(dá)量的變化規(guī)律相反，說(shuō)明它很可能是miR-133a-3p發(fā)揮肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)調(diào)控作用的重要靶基因。

參考文獻(xiàn)：

［1］Fu J J，Liu J，Zou X，et al. Transcriptome analysis of mRNA and miRNA in the development of LeiZhou goat muscles［J］. Scientific Reports，2024，14：9858.

［2］Oikawa S，Akimoto T. Functional analysis of microRNAs in skeletal muscle［J］. Methods in Molecular Biology，2023，2640：339-349.

［3］Horak M，Novak J，Bienertova-Vasku J. Muscle-specific microRNAs in skeletal muscle development［J］. Developmental Biology，2016，410（1）：1-13.

［4］Chen J F，Mandel E M，Thomson J M，et al. The role of microRNA-1 and microRNA-133 in skeletal muscle proliferation and differentiation［J］. Nature Genetics，2006，38：228-233.

［5］Shintani-Ishida K，Tsurumi R，Ikegaya H. Decrease in the expression of muscle-specific miRNAs，miR-133a and miR-1，in myoblasts with replicative senescence［J］. PLoS One，2023，18（1）：e0280527.

［6］Schanda J E，Heher P，Weigl M，et al. Muscle-specific micro-ribonucleic acids miR-1-3p，miR-133a-3p，and miR-133b reflect muscle regeneration after single-dose zoledronic acid following rotator cuff repair in a rodent chronic defect model［J］. The American Journal of Sports Medicine，2022，50（12）：3355-3367.

［7］Wang Y J，Ma J D，Qiu W L，et al. Guanidinoacetic acid regulates myogenic differentiation and muscle growth through miR-133a-3p and miR-1a-3p co-mediated akt/mTOR/S6K signaling pathway［J］. International Journal of Molecular Sciences，2018，19（9）：2837.

［8］Zhan S Y，Zhang Y，Yang C T，et al. LncR-133a suppresses myoblast differentiation by sponging miR-133a-3p to activate the FGFR1/ERK1/2 signaling pathway in goats［J］. Genes，2022，13（5）：818.

［9］李 燕. miR-133a互作LncRNA調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的機(jī)制研究［D］. 天津：天津農(nóng)學(xué)院，2019.

［10］Telles G D，Libardi C A，Conceio M S，et al. Time course of skeletal muscle miRNA expression after resistance，high-intensity interval，and concurrent exercise［J］. Medicine and Science in Sports and Exercise，2021，53（8）：1708-1718.

［11］Duran B O D S，Dal-Pai-Silva M，Garcia de la Serrana D. Rainbow trout slow myoblast cell culture as a model to study slow skeletal muscle，and the characterization of mir-133 and mir-499 families as a case study［J］. The Journal of Experimental Biology，2020，223（Pt 2）：jeb216390.

［12］Li J，Chen C W，Zhao R P，et al. Transcriptome analysis of mRNAs，lncRNAs，and miRNAs in the skeletal muscle of Tibetan chickens at different developmental stages［J］. Frontiers in Physiology，2023，14：1225349.

［13］陳 敏. gga-miRNA-454和gga-miRNA-301b對(duì)雞成肌細(xì)胞增殖與分化的作用研究［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

［14］Jebessa E，Ouyang H J，Abdalla B A，et al. Characterization of miRNA and their target gene during chicken embryo skeletal muscle development［J］. Oncotarget，2017，9（25）：17309-17324.

［15］Long K R，F(xiàn)eng S Y，Ma J D，et al. Small non-coding RNA transcriptome of four high-altitude vertebrates and their low-altitude relatives［J］. Scientific Data，2019，6：192.

［16］Wu P F，He M L，Zhang X C，et al. miRNA-seq analysis in skeletal muscle of chicken and function exploration of miR-24-3p［J］. Poultry Science，2022，101（11）：102120.

［17］賈富民，賈羽晴，夏晶晶，等. 雞肌肉發(fā)育相關(guān)miR-133a-5p分析和關(guān)鍵靶基因篩選［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，28（8）：172-182.

［18］Huo W R，Weng K Q，Li Y，et al. Comparison of muscle fiber characteristics and glycolytic potential between slow-and fast-growing broilers［J］. Poultry Science，2022，101（3）：101649.

［19］劉芳君，藍(lán)吳濤，馬悅悅，等. miRNA-148a-3p 的生物信息學(xué)分析及其在小鼠不同組織中的表達(dá)水平檢測(cè)［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2022，53（2）：414-422.

［20］Blaine J，Dylewski J. Regulation of the actin cytoskeleton in podocytes［J］. Cells，2020，9（7）：1700.

［21］Park J W，Lee J H，Han J S，et al. Muscle differentiation induced by p53 signaling pathway-related genes in myostatin-knockout quail myoblasts［J］. Molecular Biology Reports，2020，47（12）：9531-9540.

［22］Xia S. Application of P53 mRNA in signal transduction mechanisms of skeletal muscle cells［J］. Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences，2021，34（Special 1）：447-455.

［23］Tinline-Goodfellow C T，Lees M J，Hodson N. The skeletal muscle fiber periphery：a nexus of mTOR-related anabolism［J］. Sports Medicine and Health Science，2022，5（1）：10-19.

［24］鄭莉芳，陳佩杰，肖衛(wèi)華. 骨骼肌質(zhì)量控制信號(hào)通路［J］. 生理學(xué)報(bào)，2019，71（4）：671-679.

［25］Chen K，Gao P，Li Z C，et al. Forkhead box O signaling pathway in skeletal muscle atrophy［J］. The American Journal of Pathology，2022，192（12）：1648-1657.

［26］Matheny R W Jr，Carrigan C T，Abdalla M N，et al. RNA transcript expression of IGF-I/PI3K pathway components in regenerating skeletal muscle is sensitive to initial injury intensity［J］. Growth Hormone amp; IGF Research，2017，32：14-21.

［27］Lee J S，Choi K J，Lim M J，et al. Proto-oncogenic H-Ras，K-Ras，and N-Ras are involved in muscle differentiation via phosphatidylinositol 3-kinase［J］. Cell Research，2010，20（8）：919-934.

［28］Zhou H L，Lin S，Hu Y D，et al. miR-125a-5p and miR-7 inhibits the proliferation，migration and invasion of vascular smooth muscle cell by targeting EGFR［J］. Molecular Medicine Reports，2021，24（4）：708.

［29］Wu W C，Xu Z Y，Zhang L，et al. Muscle-specific deletion of Prkaa1 enhances skeletal muscle lipid accumulation in mice fed a high-fat diet［J］. Journal of Physiology and Biochemistry，2018，74（2）：195-205.

［30］Philippou A，Barton E R. Optimizing IGF-I for skeletal muscle therapeutics［J］. Growth Hormone amp; IGF Research，2014，24（5）：157-163.

［31］Geng H W，Song Q L，Cheng Y Y，et al. MicroRNA 322 aggravates dexamethasone-induced muscle atrophy by targeting IGF1R and INSR［J］. International Journal of Molecular Sciences，2020，21（3）：1111.

［32］Shen X M，Tang J，Jiang R，et al. CircRILPL1 promotes muscle proliferation and differentiation via binding miR-145 to activate IGF1R/PI3K/AKT pathway［J］. Cell Death amp; Disease，2021，12：142.