高效液相色譜法（HPLC）測定樂脈丸中丹參素鈉含量

＊宋易 易琦銘

（貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 貴州 550025）

中藥制劑在世界各地尤其是亞洲地區(qū)具有悠久的歷史和廣泛的應(yīng)用。樂脈丸是一種傳統(tǒng)的中藥制劑，主要用于治療心血管疾病，如心絞痛、心肌缺血、冠心病等[1]。

樂脈丸主要由丹參、川芎、赤芍等中藥材組成[6]，其中丹參素鈉是丹參的主要活性成分之一。近年來，許多研究已經(jīng)采用HPLC對中藥制劑中的活性成分進(jìn)行測定。然而，關(guān)于樂脈丸中丹參素鈉含量的HPLC測定研究相對較少。本研究通過建立一種可靠、準(zhǔn)確的HPLC方法，用于測定樂脈丸中丹參素鈉的含量。通過對不同品牌、不同批次樂脈丸樣品的測定，評估其質(zhì)量差異，為樂脈丸的質(zhì)量控制和產(chǎn)品研發(fā)提供有力支持。

1.實驗部分

（1）儀器與試劑。高效液相色譜儀島津LC-20AT；色譜柱Waters XBridge C18（4.6mm×250mm，5μm）；電子天平奧豪斯EX125DZH；超聲清洗儀KQ-500DA（昆山市超聲儀有限公司）；移液槍L-1000大龍；丹參素鈉對照品中國食品藥品檢定研究院；冰醋酸科密歐；色譜甲醇TEDIA；樂脈丸貴州景峰制藥有限公司；樂脈丸康美保寧（四川）制藥有限公司。

（2）溶液配制。①對照品溶液的制備。稱取丹參素鈉對照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶液制成每1mL含22.75μg的溶液，即得。②供試品溶液的制備。取樂脈丸粉末0.4g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密量取25mL 70%甲醇，稱定重量，超聲60min（功率100W，頻率40kHz，溫度4～10℃），用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

（3）色譜條件。色譜柱：Waters C18柱（4.6mm×250mm，Column），流動相以甲醇-0.2%冰醋酸（10:90），柱溫30℃，檢測波長280nm，流速1mL/min，進(jìn)樣量10μL。理論塔板數(shù)按丹參素鈉峰計算應(yīng)不低于6000。

2.結(jié)果與討論

(1)提取時間的考察

①提取溶劑體積分?jǐn)?shù)篩選。分別用甲醇體積分?jǐn)?shù)為：50%、70%、75%、80%、90%提取樂脈丸，按上述方法制備該供試品溶液，以上述色譜條件，采用HPLC法進(jìn)行提取溶劑濃度篩選。

通過用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇對樂脈丸進(jìn)行提取并測定，實驗結(jié)果顯示，樂脈丸中70%甲醇提取時丹參素鈉的含量最高，其含量值為2.219mg/g，則最終本實驗中最佳提取甲醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

②提取時間的考察。按上述提取操作，70%甲醇為提取溶劑，將樂脈丸樣品分別超聲10min、20min、30min、45min、60min、70min，以上述的色譜條件，采用HPLC法進(jìn)行超聲提取時間的篩選。

通過對不同超聲時間的考察，數(shù)據(jù)顯示，超聲隨著超聲（功率100W，頻率40kHz）時間的延長，樂脈丸中丹參素鈉的含量隨之增加，超聲60min與70min時含量值趨于平穩(wěn)，考慮到節(jié)約時間時間最終本實驗中提取樂脈丸中丹參素鈉的超聲時間為60min。

(2)精密度

取丹參素鈉對照品溶液（22.75μg/mL），同一瓶對照品溶液，進(jìn)樣6次，上述色譜條件，以丹參素鈉的峰面積計算，由結(jié)果計算其RSD值為0.28%，精密度達(dá)到要求。

(3)線性關(guān)系考察

取5個不同濃度的丹參素鈉對照品溶液，進(jìn)樣量10μL，采用HPLC法對丹參素鈉進(jìn)行測定，以丹參素鈉峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程：y=6368.9x-6156.5（r=0.9999），范圍：0.1468～2.2945mg，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察

(4)重復(fù)性實驗

取同一批號的樂脈丸樣品，照上述方式制備該供試品溶液共6份，以丹參素鈉的峰面積計算，得丹參素鈉RSD=0.67%，重復(fù)性數(shù)據(jù)達(dá)到數(shù)據(jù)要求，供試品重現(xiàn)性良好。

(5)中間精密度實驗

由不同的操作人員，取同一批號樂脈丸，照上述方式制備供試品溶液6份，上述色譜條件，進(jìn)行丹參素鈉含量測定，以丹參素鈉的峰面積計算，RSD值：1.32%。

(6)穩(wěn)定性實驗

取前序制備的同一樣品溶液，同一瓶供試品依次在0h、2h、4h、6h、8h、12h的間隔時間內(nèi)進(jìn)樣，共測6次，以丹參素鈉面積計算，結(jié)果表明是否供試品在12h內(nèi)丹參素鈉峰面積前后沒有明顯變化。

(7)加樣回收率試驗

取同一批號樂脈丸粉末0.2g，精密稱定，共6份，分別于50mL錐形瓶內(nèi)，加入70%甲醇配制丹參素鈉對照品溶液0.505mg，按照“3.1.3”項下制備供試品溶液，按上述色譜條件，進(jìn)行測定，計算丹參素鈉的平均加樣回收率為99.8%，RSD值為1.14%，達(dá)到準(zhǔn)確度要求。

(8)耐用性變化實驗

①流速微小變化。分別以0.98mL/min、1.00mL/min、1.02mL/min為流速，測定樣品相關(guān)數(shù)據(jù)，考察其分離效果，結(jié)果見表2。

表2 流速的微小變化

由實驗結(jié)果表明，當(dāng)流速出現(xiàn)微小變化時，理論塔板數(shù)、拖尾因子及分離度不受影響。

②流動相比例的微小變化。分別以流動相比例為甲醇-0.2%冰醋酸（12:88）；甲醇-0.2%冰醋酸（10:90）；甲醇-0.2%冰醋酸（8:92）；測定樣品相關(guān)數(shù)據(jù)，考察其分離效果，結(jié)果見表3。

表3 流動相比例的微小變化

實驗結(jié)果顯示，流動相的微小變化對樣品的分離效果無影響。

③柱溫的微小變化。分別以28℃、30℃、32℃為柱溫，測定樣品相關(guān)數(shù)據(jù)，考察其分離效果，結(jié)果見表4。

實驗結(jié)果表明，當(dāng)柱溫出現(xiàn)微小變化時，實驗測定方法不受其影響。

(9)專屬性試驗

分別取丹參素鈉陰性樣品溶液、丹參素鈉對照品溶液、供試品溶液、溶劑（70%甲醇），進(jìn)樣體積10μL，上述方法進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，結(jié)果見圖1、圖2、圖3、圖4。

圖1 溶劑

圖2 樂脈丸樣品

圖3 丹參素鈉對照品

圖4 缺丹參素鈉陰性樣品

溶劑與陰性樣品在丹參素鈉峰位置均無陰性干擾。

(10)樣品含量測定

按照上述方法制備供試品溶液，以上述色譜條件，測定6個批號的樂脈丸中丹參素鈉的含量，1～3為景峰制藥有限公司產(chǎn)品，4～6號為康美保寧（四川）制藥有限公司產(chǎn)品。實驗結(jié)果見表5。

表5 樂脈丸中丹參素鈉含量測定統(tǒng)計表

由數(shù)據(jù)顯示，兩種不同品牌間3個批次的樂脈丸中丹參素鈉的含量值相差無幾。

3.討論

通過文獻(xiàn)[7-9]閱讀，經(jīng)過多次方法調(diào)整，對樂脈丸樣品提取時甲醇溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取時間的考察，結(jié)果表明70%甲醇提取效果最好，超聲60min時丹參素鈉的含量最高。實驗中通過對色譜條件中流速、流動相及柱溫的微小變化進(jìn)行實驗，由實驗結(jié)果表明，從樣品中檢測出的丹參素鈉峰形、拖尾因子和對稱性來看，當(dāng)流速、流動相及柱溫發(fā)生微小改變時，拖尾因子、分離效果與對稱性不理想，比較下來，則選擇流動相比例為甲醇-0.2%冰醋酸（10:90），流速為1mL/min，柱溫為30℃。

為研究市面不同品牌樂脈丸質(zhì)量差異，對兩種不同品牌的樂脈丸中丹參素鈉含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其丹參素鈉含量相當(dāng)，質(zhì)量幾乎無差別。

未來，我們將繼續(xù)優(yōu)化實驗方法，同時測定樂脈丸中不同成分的含量，以期更全面的對樂脈丸的質(zhì)量進(jìn)行評價，為中藥質(zhì)量控制和產(chǎn)品研發(fā)做出更多貢獻(xiàn)。