微生物源天然產(chǎn)物——“小身材，大能量”

劉文 趙群飛 陳單丹 岳厚汝

本文圍繞2019年上海市自然科學(xué)獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)項(xiàng)目“微生物源天然產(chǎn)物的生物合成和分子創(chuàng)新”展開，該獎(jiǎng)項(xiàng)由中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所劉文研究員團(tuán)隊(duì)獲得。

大自然的恩賜——天然產(chǎn)物

從自然界里的動(dòng)物、植物、微生物體內(nèi)分離、提取得到的活性小分子，通常被稱為天然產(chǎn)物（NPs）。我們看到的有顏色的物體，聞到的氣味，嘗到的味道以及日常用到的日化品，很多都來自天然產(chǎn)物。作為大自然無私的原始饋贈(zèng)，天然產(chǎn)物是一個(gè)巨大寶庫，蘊(yùn)含著人類尚未完全揭開的秘密。從古人用發(fā)酵法從五倍子中得到?jīng)]食子酸，到李時(shí)珍用升華法制備并純化樟腦，再到德國藥劑師從罌粟中首次分離出單體化合物嗎啡，千百年來，人類對(duì)天然產(chǎn)物的探索和解密從未停止。

天然產(chǎn)物中有很多明星分子，如青蒿素、青霉素、紅霉素等，它們的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用對(duì)人類健康和疾病治療作出了重要貢獻(xiàn)。青蒿素的發(fā)現(xiàn)受到了中醫(yī)藥典籍的啟發(fā)，由中國科學(xué)家從中藥黃花蒿中提取、鑒定并合成。青蒿素被廣泛應(yīng)用于瘧疾治療，使全球數(shù)億人受益。主要發(fā)現(xiàn)者屠呦呦教授因此成為首位獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的中國科學(xué)家。青霉素是最早被發(fā)現(xiàn)的抗生素，由英國醫(yī)生亞歷山大 · 弗萊明（Alexander Fleming）偶然從放置發(fā)霉的細(xì)菌培養(yǎng)基中觀察到，他將這種霉菌產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)命名為青霉素。青霉素可以殺死多種細(xì)菌，由此開創(chuàng)了現(xiàn)代抗生素的歷史，并且挽救了無數(shù)患者的生命。紅霉素是繼青霉素之后被發(fā)現(xiàn)的又一種重要的抗生素，由禮來公司從菲律賓的土壤細(xì)菌中提取。紅霉素能夠治療多種細(xì)菌感染，為許多患者提供了有效的治療方案，是不可或缺的藥物之一。在上述三種明星分子中，青霉素和紅霉素均來源于微生物。微生物是自然界中廣泛存在的微小生物，它們具備豐富的代謝能力，可以合成各種復(fù)雜的天然產(chǎn)物。而這些來源于微生物的活性小分子同樣也在我們生活的方方面面發(fā)揮著不可忽視的作用。

生產(chǎn)生活中的微生物源天然產(chǎn)物

農(nóng)業(yè)到目前為止，化學(xué)殺蟲劑一直是控制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)害蟲的首選。由于化學(xué)殺蟲劑對(duì)環(huán)境的危害和對(duì)人體的潛在風(fēng)險(xiǎn)，具有較強(qiáng)殺蟲能力、對(duì)環(huán)境友好、對(duì)人體毒副作用低的生物殺蟲劑似乎是更好的選擇。阿維菌素是來自土壤細(xì)菌的生物殺蟲劑，可以干擾害蟲神經(jīng)生理活動(dòng)，使害蟲迅速麻痹，因其殺蟲效果顯著、用量極低，對(duì)人畜和環(huán)境都十分安全。

工業(yè)如何以一種可持續(xù)、綠色清潔的方式生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品對(duì)于保障社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展而言至關(guān)重要。除了微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酒精、食醋、乳酸等大宗工業(yè)品外，微生物可以產(chǎn)生具有明亮色彩的天然染料，如靛藍(lán)素和類胡蘿卜素被廣泛應(yīng)用于紡織業(yè)和印刷業(yè)中。微生物還能夠生產(chǎn)具有特殊香氣和風(fēng)味的化合物，如香蕉酮和丁香酚被用作香水和香精的添加劑。

食品在生活中到處可見的益生菌食品為什么受人追捧呢？因?yàn)橐嫔梢源龠M(jìn)腸道營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，清除或減少致病菌的黏附，還可以維持腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡，改善便秘、腹瀉以及消化不良的癥狀。乳酸菌是一類常見的益生菌，能夠通過發(fā)酵作用合成乳酸和其他有機(jī)酸。除此之外，乳酸菌還會(huì)產(chǎn)生一些活性物質(zhì)，比如乳酸菌素和乳桿菌素，這些物質(zhì)具有抗菌、抗氧化等生物活性。

護(hù)膚品在護(hù)膚方面，微生物源天然產(chǎn)物也表現(xiàn)出驚人的優(yōu)勢(shì)。酵母是護(hù)膚品領(lǐng)域常見的微生物，通過發(fā)酵過程可以產(chǎn)生多種小分子化合物，其中包括多肽、多糖、多酚類物質(zhì)等。這些物質(zhì)可以促進(jìn)肌膚的新陳代謝，增加膠原蛋白的合成，從而達(dá)到保濕、抗皺、美白等效果。

醫(yī)藥微生物源天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其在醫(yī)藥領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用和繼續(xù)開發(fā)的前景，來源于微生物的β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類等次生代謝產(chǎn)物已被廣泛應(yīng)用于抗感染、抗腫瘤、免疫抑制、降血糖等醫(yī)療領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成分子相比，這些來源于微生物的活性小分子往往靶點(diǎn)明確、藥效顯著，為藥物發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新帶來了優(yōu)勢(shì)和挑戰(zhàn)。

更新迭代的微生物源天然產(chǎn)物

自然界的微生物雖然分布廣泛，但是其所能生產(chǎn)的各種產(chǎn)品的種類和產(chǎn)量仍然有限。因此，豐富微生物細(xì)胞生產(chǎn)化學(xué)品的種類和提高細(xì)胞的生產(chǎn)效率成為微生物源天然產(chǎn)物相關(guān)研究領(lǐng)域的兩個(gè)關(guān)鍵問題。

一方面，針對(duì)微生物源天然產(chǎn)物新品種的獲得問題，目前的主要解決策略包括通過基因組挖掘的方法充分開發(fā)微生物資源以尋找新分子，以及通過代謝途徑的改造在已知天然產(chǎn)物的基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾得到新分子。由于進(jìn)化上的特征，微生物的基因組中編碼天然產(chǎn)物的基因往往成簇存在，這使得挖掘和改造其產(chǎn)生的天然產(chǎn)物有跡可循。目前已有大量關(guān)于微生物源天然產(chǎn)物挖掘的研究報(bào)道。例如，核糖體肽已經(jīng)成為活性小分子的主要來源，正在以前所未有的速度和規(guī)模被發(fā)現(xiàn)和表征，成為新藥開發(fā)的潛力股。同樣，對(duì)天然產(chǎn)物的生物合成途徑進(jìn)行人工修飾以獲得非天然的“天然產(chǎn)物”的案例也越來越多。例如，阿尼芬凈在臨床上可用于治療深部真菌感染，其生產(chǎn)過程就是在真菌發(fā)酵產(chǎn)生的小分子母核的基礎(chǔ)上，通過微生物轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)其中關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)修飾。

另一方面，許多微生物源天然產(chǎn)物并未達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)的要求。許多活性小分子經(jīng)常是以毫克為單位來計(jì)算的，產(chǎn)量很低，不具備經(jīng)濟(jì)可行性，可能直接導(dǎo)致無法生產(chǎn)或者相應(yīng)產(chǎn)品價(jià)格高昂。針對(duì)這一問題，早期的解決方法主要通過自然篩選和誘變育種的方式獲得高產(chǎn)微生物，然而這種非理性策略效率極低。隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)微生物系統(tǒng)認(rèn)知和改造能力的進(jìn)步促使“合成生物學(xué)”（一門結(jié)合了生命科學(xué)觀察分析方法和工程學(xué)設(shè)計(jì)思維的學(xué)科）誕生。從合成生物學(xué)的研究視角來看，可以在微生物宿主里把一些原本不表達(dá)的沉默基因激活，也可以表達(dá)一些來源于動(dòng)物、植物體系的基因，甚至可以表達(dá)自然中不存在、通過人工合成的基因。

世界上最小的工廠——微生物細(xì)胞工廠

微生物是藥物發(fā)現(xiàn)與發(fā)展的重要源泉，也是藥物高效精準(zhǔn)制備的理想“細(xì)胞工廠”。一提起工廠，人們腦海中浮現(xiàn)的應(yīng)該就是固定的廠房、流動(dòng)的工人、快速的物流；而提到微生物，你可能又會(huì)想到那些潛伏在我們身邊，可能引起食物腐敗、傷口感染和傳染病暴發(fā)的看不見摸不著的小家伙。那么，工廠和微生物是怎么聯(lián)系在一起的呢？一般而言，工廠是指經(jīng)人工設(shè)計(jì)具備一定生產(chǎn)線，配備相應(yīng)的動(dòng)力等輔助系統(tǒng)，并在一定的管理程序下運(yùn)行的生產(chǎn)系統(tǒng)。而經(jīng)過合理設(shè)計(jì)的微生物細(xì)胞就像一座“微型工廠”，輸入原料后，其體內(nèi)的遺傳信息仿佛一臺(tái)智能電腦快速運(yùn)行程序，在代謝能的驅(qū)動(dòng)下，經(jīng)設(shè)計(jì)優(yōu)化的“生產(chǎn)線”開始運(yùn)作，最后輸出特定產(chǎn)品。微生物細(xì)胞工廠具有高產(chǎn)率、低成本、易操作、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)、生物材料、食品、化妝品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

為了適應(yīng)規(guī)?；I(yè)應(yīng)用，需要對(duì)微生物細(xì)胞工廠進(jìn)行改造。理想的微生物細(xì)胞工廠的原料范圍可以不斷擴(kuò)大，盡可能提高能源吸收和產(chǎn)品產(chǎn)量。而隨著產(chǎn)量接近理論的最大值，無論是從上游的菌株構(gòu)建，中游的放大效應(yīng)，以及下游的工業(yè)化生產(chǎn)角度，如何進(jìn)一步提高產(chǎn)量將更具挑戰(zhàn)性，這就要求更合理、更系統(tǒng)的工程策略。

如何讓微生物這一細(xì)胞工廠變得更加高效？

通過對(duì)微生物的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方面的深入研究，可以發(fā)現(xiàn)其中許多代謝途徑和酶的作用機(jī)制，并基于對(duì)這些機(jī)制的理解構(gòu)建高效的微生物細(xì)胞工廠。隨著生物學(xué)技術(shù)的更新迭代，目前已經(jīng)開發(fā)了諸多構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠的基因工程、蛋白質(zhì)工程、代謝工程策略，有助于微生物細(xì)胞工廠在復(fù)雜的應(yīng)用環(huán)境中突破瓶頸，提高目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量。

基因工程指以分子生物學(xué)和微生物遺傳學(xué)的方法，將基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖進(jìn)行重組、克隆和表達(dá)（即重組DNA技術(shù)），涉及對(duì)DNA的人工改造，通過向微生物中引入外源基因或改變其內(nèi)源基因的表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定性狀的控制和改善。蛋白質(zhì)工程指利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行改造，通過對(duì)編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行有目的的設(shè)計(jì)和改造，調(diào)控蛋白質(zhì)的性質(zhì)，例如改善其穩(wěn)定性、活性、抗原性、溶解性和免疫原性等，從而適應(yīng)不同的應(yīng)用需求。代謝工程指通過改造和調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)量、代謝途徑及代謝產(chǎn)物的調(diào)控和優(yōu)化，使其能夠有效地合成所需的化合物，通常涉及對(duì)微生物基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組的分析和調(diào)控。

與此同時(shí)，作為輔助和指導(dǎo)工具的信息分析也在與時(shí)俱進(jìn)，生物信息學(xué)的發(fā)展將微生物研究推向了一個(gè)新時(shí)代。利用細(xì)胞內(nèi)極其復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的生活環(huán)境中的生物成分，開發(fā)出“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)”（DBTL）迭代循環(huán)，它依賴于數(shù)據(jù)分析和數(shù)學(xué)模型，目標(biāo)是進(jìn)行功能表征和響應(yīng)反饋，構(gòu)建更加高效簡便的微生物細(xì)胞工廠。毫無疑問，這些廣泛而深入的研究將為開發(fā)更好的微生物源天然產(chǎn)物提供巨大的潛力。

近年來，合成生物學(xué)作為一門新興學(xué)科得到了迅速的發(fā)展。通過合成生物學(xué)技術(shù)，可以優(yōu)化微生物細(xì)胞工廠的代謝能力，也可以優(yōu)化天然產(chǎn)物的生物合成過程。此外，基于對(duì)天然產(chǎn)物生物合成的認(rèn)知，可以利用合成生物學(xué)技術(shù)改造微生物細(xì)胞工廠，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)代謝物的定向修飾，生成在自然界難以獲取的獨(dú)特產(chǎn)物。

微生物源天然產(chǎn)物的生物合成和分子創(chuàng)新

微生物產(chǎn)生天然產(chǎn)物的目的并非為人類所用，而是作為應(yīng)對(duì)各種外部環(huán)境關(guān)切的工具或媒介，比如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、競(jìng)爭(zhēng)拮抗和環(huán)境適應(yīng)等。這些生物學(xué)過程常常是動(dòng)態(tài)、可變的，會(huì)對(duì)生物體提出新的合成要求，通過其產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)改變、優(yōu)化和最終選擇來適應(yīng)各種生物學(xué)功能的變化。因此，生物體與其內(nèi)外環(huán)境的相互作用推動(dòng)了天然產(chǎn)物與生物學(xué)的共進(jìn)化，也導(dǎo)演了自然中基于普適性與特異性規(guī)律的小分子進(jìn)化、演變的基本法則。理解天然產(chǎn)物生物合成的普適性與特異性規(guī)律，并基于這些理解人為加速小分子的進(jìn)化、演變過程，將極大促進(jìn)微生物源天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)多樣性擴(kuò)展和應(yīng)用的進(jìn)程。

中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所的劉文研究員團(tuán)隊(duì)，遵循“師從于自然、認(rèn)知于自然、創(chuàng)新于自然”的研究思路，專注于微生物產(chǎn)生體系中天然產(chǎn)物的生物合成途徑的建立和新型酶學(xué)機(jī)理的闡明，致力于發(fā)展天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)新策略，并運(yùn)用合成生物學(xué)的理念加速小分子的演化過程及擴(kuò)展它們的用途，取得了系列國內(nèi)外同行高度評(píng)價(jià)和廣泛關(guān)注的引領(lǐng)性成果。團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)揭示了林可酰胺類、硫肽類、螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酯類等多個(gè)代表性抗生素家族的生物合成機(jī)制，極大地豐富了基于普適性與特異性規(guī)律去認(rèn)知小分子天然產(chǎn)物自然演變法則的理論。例如，林可酰胺類抗生素是一類產(chǎn)生于鏈霉菌的含硫抗生素，其中，林可霉素被廣泛用于治療革蘭氏陽性細(xì)菌引起的感染，在臨床上的應(yīng)用已長達(dá)半個(gè)多世紀(jì)。但是，該家族抗生素的生物合成機(jī)制一直不清楚，嚴(yán)重妨礙了相關(guān)新藥的研發(fā)和高效制造。劉文團(tuán)隊(duì)在《自然》（Nature）上發(fā)文，揭示了兩個(gè)小分子硫醇——麥角硫因（EGT）和放線硫醇（MSH）——參與的林可霉素生物合成機(jī)制，打破了長期以來人們對(duì)生物體內(nèi)廣泛存在的小分子硫醇解毒功能的認(rèn)知禁錮，揭示了一條全新的硫元素引入天然產(chǎn)物分子的新途徑。在隨后的研究中，團(tuán)隊(duì)陸續(xù)揭示更多來源于微生物體內(nèi)降解或解毒途徑的功能蛋白在活性分子林可酰胺類抗生素構(gòu)筑中發(fā)揮的重要作用，詮釋了微生物生物合成所體現(xiàn)的不破不立、對(duì)立統(tǒng)一的自然規(guī)律。

盡管微生物源天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，但在微生物體內(nèi)，它們都是以小分子羧酸、氨基酸和單糖等簡單的初級(jí)代謝產(chǎn)物分子作為底物，遵循一定的化學(xué)原則，經(jīng)過系列酶的順序協(xié)作催化反應(yīng)而形成。天然產(chǎn)物生物合成過程中新型獨(dú)特酶的發(fā)現(xiàn)及其酶學(xué)機(jī)制的解析，將豐富合成生物學(xué)的元件，是成功運(yùn)用合成生物學(xué)手段構(gòu)建微生物“細(xì)胞工廠”的關(guān)鍵。螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酯類抗生素吡咯吲哚霉素的骨架構(gòu)筑過程中，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了兩種不同的酶，可以極大地促進(jìn)狄爾斯-阿爾德（Diels-Alder，D-A）環(huán)化反應(yīng)的發(fā)生。D-A反應(yīng)是合成化學(xué)中最重要的反應(yīng)類型之一，作為一種極為有效的碳-碳鍵手性構(gòu)筑手段，廣泛地應(yīng)用于合成化學(xué)、藥物化學(xué)、材料化學(xué)等領(lǐng)域，科學(xué)家們?cè)缫杨A(yù)言D-A反應(yīng)可能存在于生物體系中，然而數(shù)十年來卻無法確切地判斷D-A反應(yīng)酶到底是否天然存在。該發(fā)現(xiàn)為回答這一生物和化學(xué)領(lǐng)域長期爭(zhēng)論但懸而未決的科學(xué)難題創(chuàng)造了有利的契機(jī)。團(tuán)隊(duì)在硫肽類抗生素生物合成途徑中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依賴的新型酶蛋白催化自由基介導(dǎo)的酶促結(jié)構(gòu)重排。自然界中以SAM介導(dǎo)的自由基酶促反應(yīng)數(shù)以萬計(jì)，但相關(guān)酶學(xué)機(jī)制知之甚少，很大程度上在于對(duì)相關(guān)產(chǎn)物和自由基轉(zhuǎn)化過程缺乏了解。該酶的發(fā)現(xiàn)和催化機(jī)制的揭示，在理解SAM依賴的自由基蛋白所催化的復(fù)雜結(jié)構(gòu)重排反應(yīng)方面邁出的重要一步，對(duì)構(gòu)筑具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)單元和重要藥學(xué)活性，尤其是具有芳香結(jié)構(gòu)單元的化學(xué)分子具有重要的意義。

基于對(duì)天然產(chǎn)物分子生物合成機(jī)制的原理性發(fā)現(xiàn)，劉文團(tuán)隊(duì)積極拓展理論研究在方法學(xué)上的應(yīng)用，采用生物技術(shù)解決合成化學(xué)的難題，擴(kuò)展微生物源天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性與用途。提出了“復(fù)用組合生物合成”的概念，把組合化學(xué)的思想應(yīng)用到生物合成的各個(gè)階段，最大限度地豐富分子的多樣性和用途。以抗霉素的鏈霉菌產(chǎn)生體系為模型，運(yùn)用以多樣性為導(dǎo)向的生物合成策略構(gòu)建了包含數(shù)百個(gè)成員的雙內(nèi)酯天然產(chǎn)物類似物庫；通過篩選，獲得了一大批活性高于母化合物的結(jié)構(gòu)單體，并引入了大量藥學(xué)上重要、化學(xué)上活潑或天然不存在的功能基團(tuán)?；趯?duì)硫肽類抗生素系統(tǒng)性共性和個(gè)性生物合成機(jī)制的解析，與合成生物學(xué)的理念相結(jié)合，設(shè)計(jì)、并以細(xì)菌作為“細(xì)胞工廠”生物合成了數(shù)十個(gè)新型的硫肽抗生素，其中氟取代的硫鏈絲菌素衍生物與對(duì)照藥物、臨床上作為最后一道防線的萬古霉素相比，對(duì)耐藥致病菌的活性高出200倍以上，是優(yōu)良的抗感染藥物先導(dǎo)物，激發(fā)了國際上以“細(xì)胞工廠”進(jìn)行硫肽結(jié)構(gòu)衍生的熱潮。目前，生物合成創(chuàng)造的新硫肽已遠(yuǎn)超過去70年自然分離的總和。

此外，團(tuán)隊(duì)關(guān)注國家需求，致力于我國大宗抗生素產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化方面一些關(guān)鍵科學(xué)問題的突破及相應(yīng)理論和方法的應(yīng)用轉(zhuǎn)化。研究團(tuán)隊(duì)通過采用合成生物學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)的紅霉素、林可霉素、阿維菌素等抗生素新工程菌株提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，運(yùn)用合成生物學(xué)的理念加速小分子的演化過程并擴(kuò)展其用途，在大宗工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)品技術(shù)發(fā)展變革方面產(chǎn)生了良好的示范作用。

未來，關(guān)于高效微生物細(xì)胞工廠的研究趨勢(shì)是將合成生物學(xué)與其他學(xué)科相結(jié)合，如計(jì)算機(jī)科學(xué)、人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)等，以實(shí)現(xiàn)更精確的設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)。這些技術(shù)的結(jié)合將加速活性小分子的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，并推動(dòng)微生物源天然產(chǎn)物的生物合成和分子創(chuàng)新進(jìn)一步發(fā)展。